包含EGF(A)衍生物和N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐的固体组合物的制作方法

包含egf(a)衍生物和n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐的固体组合物
1.发明技术领域
2.本发明涉及包含pcsk9抑制剂和n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐的固体组合物、其制备方法及其在医学中的用途。
3.序列表的援引并入
4.名称为“序列表(sequence listing)”的序列表为4kb，创建于2020年7月1日，并且通过引用并入本文。
5.背景
6.高ldl-c(低密度脂蛋白胆固醇)水平和血脂异常是公认的心血管疾病的驱动因素。
7.他汀类药物已被批准用于治疗血脂异常达25年。已经证实这类药物能大幅度地且持续地减少心血管事件，具有可接受的安全性特征。最畅销的他汀类药物，即阿托伐他汀(lipitor
tm
)，一直是世界上最畅销的药物，其从1996年至2012年的销售额超过1250亿美元。
8.尽管他汀类药物和其他降脂药物可以获得并广泛应用，但许多患者并未达到他们的目标ldl-c水平，并且仍处于患心血管疾病的高风险中。pcsk9(9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin)促进肝ldl-r(ldl受体)降解，由此降低肝ldl-r表面表达，并因此降低ldl颗粒的清除率。相反，阻断pcsk9增加了ldl-c以及其他致动脉粥样硬化脂蛋白的清除率。事实上，ldl受体有助于清除ldl之外的致动脉粥样硬化脂蛋白，如中密度脂蛋白和残余颗粒。增加的中密度脂蛋白和残余颗粒清除率可能具有超出由ldl降低所提供的治疗益处。
9.经由srebp2转录因子，他汀类药物增加ldl-r和pcsk9两者的表达。增加的pcsk9表达可减弱他汀类药物对从循环中清除ldl-c的作用。
10.通过抑制pcsk9与ldl-r的结合从而防止ldl-r降解，他汀类药物的功效得到增强。综上所述，pcsk9抑制为脂质管理提供了一种新方法。
11.最近，阿利库单抗(alirocumab)/和依伏库单抗(evolocumab)/这两种抗pcsk9抗体已被批准用于高ldl-c水平的治疗。这些抗体通过每两周皮下注射1ml来施用。
12.ldl-r(ldl-r-(293-332))的egf(a)(表皮生长因子样结构域a)序列(40个氨基酸)被公认为pcsk9结合的位点。已经显示分离的野生型egf(a)肽以低μm范围内的ic
50
抑制pcsk9与ldl-r的结合(biochemical and biophysical research communications 375(2008)69
–
73)。这种较差的效力阻碍了egf(a)肽的实际药学用途。此外，预期这类肽的半衰期太短而无法在治疗上使用。
13.wo2012177741和j.mol.biol.(2012)422,685-696公开了egf(a)的类似物及其fc融合体。
14.wo2017/121850已经公开了具有延长的半衰期的替代性基于egf(a)肽的pcsk9抑制剂。为了增加此类药物的可用性，开发合适的口服制剂是有意义的。由于治疗性肽在胃肠系统中的快速降解，这类肽的口服给药具有挑战性。
15.肽化合物的口服生物利用度通常是有限的，但如wo 2012/080471和wo 2013/139694所述，司美格鲁肽已经获得了有用的结果。


技术实现要素：

16.在一方面，本发明涉及包含pcsk9抑制剂和吸收促进剂或递送剂的组合物。在一个实施方案中，根据本发明的组合物的辅料包括极高含量的递送剂和最小含量的如下文所述的其他辅料。所提供的组合物表现出加速的溶出，使得能够快速摄取活性药物成分。
17.本文描述了显示出加速溶出的药物组合物，因此基于先前使用司美格鲁肽获得的数据，可以预见通过口服给药，pcsk9抑制剂的暴露能够得到改善。发明人发现，当用极高含量的吸收促进剂和最小含量的任何其他辅料制备组合物时，pcsk9抑制剂组合物的溶出发生得更快。
18.在一个方面，本发明涉及组合物，其中递送剂相对于总组合物，或者特别是相对于该组合物的其他辅料的重量比非常高。
19.在一个实施方案中，本发明涉及包含pcsk9抑制剂、递送剂和/或吸收促进剂如snac的药物组合物，其中所述递送剂/吸收促进剂占该组合物的辅料的至少90％，如至少95％w/w。
20.在一个实施方案中，所述组合物包含：
21.a)0.5-100mg egf(a)衍生物，
22.b)20-1000mg，如50-600mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，并且
23.其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90％w/w。
24.在一个实施方案中，本发明涉及包含pcsk9抑制剂、递送剂和/或吸收促进剂如snac的药物组合物，其中所述递送剂/吸收促进剂占该组合物的至少70％w/w。
25.在另外的实施方案中，所述组合物进一步包含润滑剂。
26.在一个实施方案中，所述组合物包含：
27.a)0.5-100mg egf(a)衍生物，
28.b)20-1000mg，如50-600mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，和
29.c)0.5-50mg，如1-30mg润滑剂，
30.其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90％w/w。
31.在一方面，本发明涉及制备如本文所述的药物组合物的方法，如包括以下步骤的方法：
32.a)将包含递送剂、pcsk9抑制剂和可选的润滑剂的混合物粒化，以及
33.b)将步骤a)中获得的颗粒压缩成片剂，并任选地在压缩之前将另外的润滑剂添加到所述颗粒中。
34.在另一方面，本发明涉及用于医学，例如用于改善脂质参数以及/或者预防和/或治疗心血管疾病的如本文定义的组合物或颗粒，其中所述组合物经口服施用。
35.在另一方面，本发明涉及改善脂质参数以及/或者预防和/或治疗心血管疾病的方法，其包括向有需要的患者施用如本文定义的组合物，其中所述组合物是片剂并且经口服
施用。
附图说明
36.图1显示了与测试组合物1相比，测试组合物2、3、5、6和7的快速溶出。
37.描述
38.本发明的一方面涉及包含pcsk9抑制剂和吸收促进剂或递送剂的组合物。该组合物可以是适合口服给药的形式，如片剂、囊剂或胶囊。在一个实施方案中，该组合物是口服组合物，或药物组合物，如口服药物组合物。
39.在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含高含量的递送剂和最小含量的如下文所述的其他辅料。所提供的组合物表现出加速的溶出，从而使得能够快速摄取活性药物成分。
40.pcsk9抑制剂
41.如本文所用的术语“pcsk9抑制剂”是指完全或部分阻止pcsk9与人低密度脂蛋白受体(ldl-r)结合的化合物。
42.egf(a)ldl-r(293-332)肽与pcsk9结合，但由于与pcsk9的结合相对较弱，因此不被视为pcsk9抑制剂。egf(a)类似物抑制pcsk9的潜力可以在elisa测定(如本文的试验i)中测量，该elisa测定提供egf(a)类似物或包含egf(a)类似物的化合物的表观亲和力，被报告为ki。因此，低ki是具有强抑制功能的化合物的特征，如wo2017/121850所述。基于其抑制pcsk9与ldl-r相互作用的能力，此类化合物被称为pcsk9抑制剂。基于wo2017/121850中描述的发现，合适的pcsk9抑制剂的ki低于8nm，如低于5nm。在一个实施方案中，pcsk9抑制剂的ki约为0.5-8nm，或如0.5-5nm，或如1.0-4nm。适合于测定ki的试验在本文试验i中进行了描述。
43.在一个实施方案中，pcsk9抑制剂具有至少与egf(a)301l相当的抑制功能。在一个实施方案中，pcsk9抑制剂具有与egf(a)301l相当的pcsk9抑制功能。在给定的试验，如本文描述的试验i中，比率因此优选地低于2，如低于1.5，如低于1.2。在一个实施方案中，该比率至多为1.0，如至多0.8，如至多0.7，如至多0.6，或如至多0.5。在一个实施方案中，比率为2.0-0.2，如1.5-0.5，或如1.2-0.8。
44.在一个实施方案中，pcsk9抑制剂具有与egf(a)301l相当的抑制功能。在一个实施方案中，与egf(a)301l,309r,310k相比，pcsk9抑制剂具有改善的pcsk9抑制功能。在给定的试验，如本文描述的试验i中，比率因此优选地低于2，如低于1.5，如低于1.2。在一个实施方案中，该比率至多为1.0，如至多0.8，如至多0.7，如至多0.6，或如至多0.5。在一个实施方案中，比率为2.0-0.2，如1.5-0.5，或如1.2-0.8。
45.在一个实施方案中，pcsk9抑制剂包含如下进一步描述的egf(a)肽类似物。
46.egf(a)化合物
47.本文使用术语“egf(a)化合物”来泛指包含egf(a)肽的化合物，其涵盖如seq id no:1所定义的wt-ldl-r(293-332)及其类似物。术语egf(a)化合物包括egf-(a)肽及其类似物的衍生物，即，如本文所述的具有取代基的egf(a)肽类似物是egf(a)化合物的典型实例。
48.egf(a)肽
49.例如在本发明的上下文中使用的术语“肽”是指包含一系列通过酰胺(或肽)键相互连接的氨基酸的化合物。在特定实施方案中，该肽由通过肽键相互连接的氨基酸组成。
50.本发明的肽包含至少35个，如36、37、38、39个或至少40个氨基酸。在特定实施方案中，该肽由36个，如38个或40个氨基酸组成。在另外的特定实施方案中，该肽由35、36、37、38、39或40个氨基酸组成。
51.在存在氨基酸添加(在本文中称为n末端和c末端延长)的情况下，本发明的肽可包含至多140个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的肽可包含41个氨基酸残基或可由41个氨基酸残基组成。在特定的实施方案中，该肽包含40-140、40-120、40-100、40-80、40-60或40-50个氨基酸。
52.如本文所用的术语“ldl-r的egf(a)结构域”、“ldl-r(293-332)”、“天然ldl-r(293-332)、“egf(a)(293-332)”、“野生型egf(a)”、“wt-egf(a)”或“天然egf(a)”是指由序列seq id no:1组成的肽。
53.seq id no:1为：
54.gly-thr-asn-glu-cys-leu-asp-asn-asn-gly-gly-cys-ser-his-val-cys-asn-asp-leu-lys-ile-gly-tyr-glu-cys-leu-cys-pro-asp-gly-phe-gln-leu-val-ala-gln-arg-arg-cys-glu。
55.在该式中，氨基酸残基的编号遵循ldl-r的egf(a)结构域(ldl-r-(293-332))的编号，其中第一个(n末端)氨基酸残基被编号为第293号或被给予第293号的位置，并且后续的朝向c末端的氨基酸残基被编号为294、295、296等，直到最后一个(c末端)氨基酸残基，其在ldl-r的egf(a)结构域中是编号为332的glu。
56.在序列表中进行不同的编号，其中seq id no:1的第一个氨基酸残基(gly)被指定为第1号，而最后一个(glu)被指定为第40号。这同样适用于序列表中的其他序列，即所指定的n末端氨基酸为第1号，而无论其相对于293gly或参照ldl-r(293-332)的293置换氨基酸残基如何定位。然而，如上所说明的，本文中氨基酸位置的编号是参照ldl-r(293-332)的。
57.本发明涉及由seq id no:1所确定的egf(a)肽的类似物以及由seq id no:1定义的ldlr的野生型egf(a)结构域的这类egf(a)肽类似物的衍生物。
58.术语“类似物”通常是指与参考氨基酸序列相比，其序列具有一个或多个氨基酸改变的肽。
59.如本文所用的术语“本发明的类似物”、“本发明的肽类似物”、“ldl-r(293-332)类似物”、“egf(a)类似物”或“seq id no:1的类似物”可被称为肽，其序列包含相对于序列seq id no:1的氨基酸置换，即氨基酸替换。“类似物”还可包括在n末端和/或c末端位置的氨基酸延长以及/或者在n末端和/或c末端位置的截短。
60.与seq id no.:1的同一性水平可以通过确定相对于seq id no 1没有改变的氨基酸的数目来计算。seq id no:1由40个氨基酸残基组成，并且如果引入三个氨基酸置换，则同一性水平为37/40％＝92.5％。如果5个氨基酸残基发生改变，则同一性水平为87.5％。如
果所述肽在n末端或c末端延长，则该部分通常不包括在该比较中，而一个或多个氨基酸的缺失缩短了该比较物。例如，在上述实例中，如果n末端氨基酸缺失，则同一性水平分别略微降低至36/39x100％和34/39x100％。当讨论衍生物的骨架序列的同一性时，取代基的氨基酸残基(例如该取代基所连接的残基，也被称为该取代基的氨基酸残基)可以是野生型(wt)或置换的氨基酸。如果该取代基的氨基酸残基为野生型残基，如n末端gly或312k，则该残基被包括于同一性水平的计算中，而从293至332的其他任何位置处的lys将是氨基酸置换，且不包括在与seq id no.:1的氨基酸同一性的计算中。
61.在一个实施方案中，与seq id no.:1相比，所述egf(a)肽类似物具有1-15个氨基酸置换。在一个实施方案中，与seq id no.:1相比，所述egf(a)肽类似物具有1-10个氨基酸置换。在一个实施方案中，与seq id no.:1相比，所述egf(a)肽类似物具有1-8个氨基酸置换，例如与seq id no.:1相比具有1-7、1-6、1-5个氨基酸置换。在特定的实施方案中，在所述egf-1肽类似物中可存在至多7个氨基酸置换，例如可存在至多6、5、4、3、2或1个氨基酸置换。
62.在一个实施方案中，本发明的类似物具有与seq id no.:1至少75％的同一性，如80％、如85％、如90％或甚至95％的同一性，在没有截短的情况下分别对应于至多10、8、6、4和2个相对于seq id no 1的氨基酸置换。
63.本发明的每种肽类似物可参照以下两方面来描述：i)天然egf(a)(ldl-r(293-332))中与改变的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的编号(即天然ldl-r(293-332)egf(a)中的相应位置)，和ii)实际改变。
64.换言之，本发明的肽类似物可以参照天然ldl-r(293-332)egf(a)肽来描述，即描述为与天然ldl-r(293-332)egf(a)(seq id no:1)相比其中许多氨基酸残基已经改变的其变体。这些变化可独立地代表一个或多个氨基酸置换。
65.以下是合适的类似物命名法的非限制性实例：
66.并入wo2017/121850的实施例2衍生物中的egf(a)肽因此被称为以下ldl-r(293-332)egf(a)类似物：(301leu,309arg)ldl-r(293-332)egf(a)，或(leu301,arg309)-ldl-r(293-332)egf(a)或(301l,309r)ldl-r(293-332)或(l301,r309)ldl-r(293-332)。这意味着当这种类似物与天然ldl-r(293-332)比对时，其i)在该类似物中根据该比对与天然ldl-r(293-332)egf(a)的位置301相对应的位置处具有leu，ii)在该类似物中与天然ldl-r(293-332)egf(a)的位置309相对应的位置处具有arg。
67.与seq id no:1相比，“包含”某些指定改变的类似物可包含进一步的改变。
68.在特定实施方案中，所述类似物“具有”或“包含”指定的改变。在特定的实施方案中，该类似物由这类改变“组成”。当对于类似物使用术语“由...组成”或“组成”时，例如对于类似物由一组指定的氨基酸置换组成，或由一组指定的氨基酸置换组成的类似物，应当理解该指定的氨基酸置换是该肽类似物中仅有的氨基酸置换。相反，“包含”一组指定的氨基酸置换的类似物可具有另外的置换。
69.从以上实例可以明显看出，氨基酸残基可以用其全名、其单字母代码和/或其三字母代码来表示。这三种方式完全等效。
70.表述“等同于...的位置”或“相应位置”可用来参照参考序列天然ldl-r(293-332)egf(a)(seq id no:1)表征变体ldl-r(293-332)egf(a)序列中的变化位点。等同或相应位
置，以及变化编号，例如通过简单的书写和目测来容易地推断；以及/或者可使用标准蛋白质或肽比对程序，如基于needleman-wunsch算法的“align”。
71.在下文中，可能发生以下情况：定义化学式，使得两个后续的化学基团均可被选择为“键”。在这样的情况下，这两个后续的化学基团实际上将不存在，并且只有一个键连接周围的化学基团。
72.氨基酸是含有氨基和羧酸基团以及可选的一个或多个通常被称为侧链的额外基团的分子。
73.术语“氨基酸”包括蛋白型(proteinogenic)(或天然)氨基酸(其中有20种标准氨基酸)以及非蛋白型(或非天然)氨基酸。蛋白型氨基酸是天然地并入蛋白质中的氨基酸。标准氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。非蛋白型氨基酸或者不存在于蛋白质中，或者不通过标准细胞机制产生(例如，它们可能已经经历翻译后修饰)。非蛋白型氨基酸的非限制性实例是aib(α-氨基异丁酸或2-氨基异丁酸)、正亮氨酸、正缬氨酸以及蛋白型氨基酸的d-异构体。
74.在下文中，未说明其光学异构体的本发明肽的各个氨基酸都应被理解为意指l-异构体(除非另有说明)。
75.egf(a)肽类似物
76.本发明的一个方面涉及seq id no:1的肽的类似物。本发明的肽类似物可被定义为包含作为seq id no:1的类似物的氨基酸序列的肽。本发明的肽类似物具有与pcsk9结合的能力。在具体的实施方案中，本发明的类似物具有例如与天然ldl-r(293-332)(天然egf(a))或其他pcsk9结合化合物相比改善的与pcsk9结合的能力。
77.本发明的肽类似物具有抑制pcsk9与ldl-r结合的能力。在一个实施方案中，该肽为pcsk9抑制剂。在一个实施方案中，该肽抑制pcsk9与人低密度脂蛋白受体(ldl-r)的结合。可以使用本文试验iv中描述的试验来评估这样的结合。在一个实施方案中，本发明的肽类似物和肽衍生物是pcsk9抑制剂肽或简称为pcsk9抑制剂。在一个实施方案中，本发明涉及seq id no.:1的肽类似物，其中该肽类似物能够抑制pcsk9与人低密度脂蛋白受体(ldl-r)的结合。
78.在一个实施方案中，与egf(a)ldl-r(293-332)(seq id 1)相比，本发明的肽类似物、化合物或pcsk9抑制剂具有改善的结合pcsk9的能力。
79.如上所述，当符合以下条件时，egf(a)肽类似物或包含其的化合物被认为是pcsk9抑制剂：根据与egf(a)ldl-r(293-332)(seq id 1)相比具有改善的与pcsk9的结合，此类分子具有抑制pcsk9与ldl-r结合的能力。
80.在一个实施方案中，如在pcsk9-ldl-r结合竞争性elisa测定(试验i)中所测量的，本文所述的肽类似物、化合物或pcsk9抑制剂的ki低于10nm，如低于8nm，或如低于5nm。
81.如wo2017/121850实施例d1.2中所述，egf(a)类似物及其衍生物的功能性可进一步通过它们改善ldl摄取的能力来表征。在一个实施方案中，本发明的肽类似物、化合物或pcsk9抑制剂在pcsk9的存在下增加ldl摄取。在一个实施方案中，本发明的肽类似物、化合物或pcsk9抑制剂能够逆转或减低pcsk9介导的ldl摄取减少。
82.在一个实施方案中，如在ldl摄取试验中所测量的，本发明的肽类似物、化合物或pcsk9抑制剂的ec50低于1500nm，如低于1000nm或如低于500nm。
83.在一个实施方案中，本发明的肽类似物可被定义为与seq id no:1相比包含至少1个氨基酸置换，并且任选地包含延长。在一个实施方案中，本发明的肽类似物可被定义为与seq id no:1相比包含至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或1个氨基酸置换，并且任选地包含延长。这意味着包含n末端和/或c末端延长的肽除所述延长外还可在位置293至332处包含至多15个氨基酸置换。
84.氨基酸“延长”也可被称为“延伸”。在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含延长。所述延长可以是在seq id no:1或其类似物的n末端位置处添加至多50个氨基酸残基，也被称为n末端延长，这意味着本发明的肽可从位置292向下直至例如位置242处包含至多50个氨基酸。另外或备选地，所述延长可以是在seq id no:1或其类似物的c末端位置处添加至多50个氨基酸残基，也被称为c末端延长，这意味着本发明的肽可从位置333向上直至例如位置383处包含至多50个氨基酸。
85.所述延长可存在于n末端、c末端或存在于两者。所述延长也可以是彼此独立地在每一侧0至50个氨基酸之间的任何长度的延长。在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含1-50、1-40、10-40、1-30、10-30、20-30、20-40、20-50、30-50、1-10、11-20、21-30、31-40或41-50个氨基酸残基的或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基的n末端延长。另外或备选地，本发明的肽类似物可包含1-50、1-40、10-40、1-30、10-30、20-30、20-40、20-50、30-50、1-10、11-20、21-30、31-40或41-50个氨基酸残基的或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基的c末端延长。
86.在某些情况下，延长可被称为置换，因为引入了新的氨基酸残基，如本文例示的292a、292lys或333lys。
87.egf(a)肽的n末端和/或c末端处的较小截短可存在于该egf(a)肽类似物中。
88.在一个实施方案中，所述egf(a)肽包含至少35个氨基酸残基，如36个氨基酸残基，如37个氨基酸残基，如38个氨基酸残基，或如39个氨基酸残基。在一个实施方案中，该egf(a)肽类似物相应地包含1-2个氨基酸残基的n末端截短。在一个实施方案中，一个或两个n末端氨基酸残基缺失。在进一步的实施方案中，该egf(a)肽类似物相应地包含至少缺失或具体缺失氨基酸293gly的n末端截短。
89.在进一步的实施方案中，所述egf(a)肽类似物包含至少缺失或具体缺失293gly-294thr的n末端截短。
90.在一个实施方案中，所述egf(a)肽类似物包含1个氨基酸残基的c末端截短。在一个实施方案中，单个c末端氨基酸残基缺失。在一个实施方案中，该肽类似物包含具体缺失氨基酸332glu的c末端截短。
91.另外或备选地，本发明的肽类似物在n末端或c末端，例如在位置292和/或333处可包含至少一个氨基酸延长。
92.本发明的egf(a)肽类似物包含氨基酸残基301从asn至leu的氨基酸置换，还被描述为asn301leu，或简称301leu。在特定的实施方案中，该egf(a)肽类似物包含置换301leu。
93.另外或备选地，所述egf(a)肽类似物包含氨基酸残基297cys、304cys、308cys、317cys、319cys和331cys。这些cys残基是可参与二硫键，如297cys与308cys之间、304cys与317cys之间以及319cys与331cys之间的二硫键的野生型残基。
94.在一个实施方案中，如上所述，所述egf(a)肽类似物包含301leu和多个其他氨基酸置换。
95.在一个实施方案中，所述egf(a)肽类似物包含301leu、310asp，以及312lys的氨基酸置换。
96.在一个实施方案中，所述egf(a)肽类似物包含301leu和310asp，并且其中该肽类似物不具有299asp至glu、val或his的置换。
97.在一个实施方案中，所述egf(a)肽类似物包含301leu、309arg和312glu。
98.在一个实施方案中，所述egf(a)肽类似物包含301leu和309arg，条件是该肽类似物不具有310asp至310lys的置换，或者
99.在一个实施方案中，所述egf(a)肽类似物包含301leu和309arg，条件是该肽类似物不具有299asp至glu、val或his的置换。
100.在进一步的实施方案中，所述肽类似物不具有d310k、d310n、d310q、d310q、d310r和d310a中的任何置换，或甚至不具有310asp的任何置换。
101.在一个实施方案中，所述egf(a)肽类似物包含一个、两个、三个或全部四个以下野生型残基：295asn、296glu、298leu和302gly。
102.在一个实施方案中，所述egf(a)肽类似物包含一个、两个、三个、四个或全部五个以下野生型残基：295asn、296glu、298leu、302gly和310asp。
103.在一个实施方案中，所述肽具有295asn。
104.在一个实施方案中，所述肽类似物具有296glu。在一个实施方案中，该肽类似物具有298leu。在一个实施方案中，该肽类似物具有302gly。在一个实施方案中，该肽类似物具有310asp。
105.在一个实施方案中，所述肽类似物具有310asp、295asn和296glu中的两个或更多个。在一个实施方案中，该肽类似物具有310asp、295asn和296glu中的全部三个。
106.如本文所述，所述egf(a)肽类似物可包含其他氨基酸置换。在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：293、294、296、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、328、329、330和332。
107.在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：293、294、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330、331和332。
108.在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：294、299、300、303、309、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330和332。
109.在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：299、300、309、313、316、318、321、322、323、324、326、328、329、330和332。
110.在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个进一步的氨基酸置换：309、312、313、321、324、328和332。
111.在进一步的实施方案中，除上文指定的氨基酸残基之外，所述肽类似物还在某些特定位置处包含野生型氨基酸残基或者不同的残基，即氨基酸置换。
112.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置293处包含氨基酸残基gly(g)或asn(n)。
113.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置294处包含氨基酸残基trp(w)、thr(t)或gly(g)。
114.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置299处包含氨基酸残基asp(d)、gly(g)、pro(p)、arg(r)、lys(k)、ser(s)、thr(t)、asn(n)、gln(q)、ala(a)、ile(i)、leu(l)、met(m)、phe(f)、tyr(y)或trp(w)。
115.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置299处包含氨基酸残基asp(d)、gly(g)、pro(p)、arg(r)、lys(k)、ser(s)、thr(t)、asn(n)、gln(q)、ala(a)、met(m)、phe(f)、tyr(y)或trp(w)。
116.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置299处包含氨基酸残基asp(d)、ser(s)、arg(r)、leu(l)、ala(a)、lys(k)或tyr(y)。
117.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置299处包含氨基酸残基asp(d)或ala(a)。
118.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置300处包含氨基酸残基his(h)或asn(n)。
119.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置307处包含氨基酸残基val(v)、ser(s)、thr(t)或ile(i)。
120.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置307处包含氨基酸残基val(v)或ile(i)。
121.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置307处包含ser(s)、thr(t)或ile(i)。
122.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置307处包含ile(i)。
123.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基asn(n)、glu(e)、his(h)、arg(r)、ser(s)或lys(k)。
124.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基asn(n)、arg(r)、ser(s)或lys(k)。
125.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基asn(n)、arg(r)或ser(s)。
126.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基asn(n)或arg(r)。
127.在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基lys(k)或arg(r)。
128.所述egf(a)肽类似物可包含若干如本文所述的氨基酸置换，如选自299ala、307ile和321glu的一个或多个氨基酸置换。
129.在进一步的实施方案中，所述egf(a)肽类似物在位置321处包含氨基酸残基asp(d)、lys(k)或glu(e)。
130.在进一步的实施方案中，所述egf(a)肽类似物在位置321处包含氨基酸残基asp(d)或glu(e)。
131.在进一步的实施方案中，所述egf(a)肽类似物在位置321处包含氨基酸残基glu(e)。
132.在进一步的实施方案中，所述egf(a)肽类似物在位置324处包含氨基酸残基gln(q)或gly(g)。
133.在进一步的实施方案中，所述egf(a)肽类似物在位置329处包含氨基酸残基arg(r)或his(h)。
134.在进一步的实施方案中，所述egf(a)肽类似物不具有300asn(n)至pro(p)的置换。
135.ldl-r的egf(a)结构域在位置312处包含赖氨酸，该赖氨酸可用于如本文所述的置换。在不希望将该取代基连接至312的实施方案中，312lys可被如本文所述的另一种氨基酸所置换。
136.在一个实施方案中，位置312处的lys被选自gly、pro、asp、glu、arg、his、ser、thr、asn、gln、ala、val、ile、leu、met、phe和tyr的氨基酸残基所置换。在一个实施方案中，位置312处的lys被选自gly、asp、glu、ser、thr、asn、ala、val、ile、leu、phe和tyr的氨基酸残基所置换。在一个实施方案中，位置312处的lys被选自asp、glu、thr、asn、ile、leu、phe和tyr的氨基酸残基所置换。在一个实施方案中，312lys被312asp、312glu、312thr、312asn、312ile或312phe所置换。在一个实施方案中，312lys被312glu、312asp、312gln或312arg所置换。
137.在一个实施方案中，312lys被312glu、312thr、312asn、312ile、312phe或312tyr所置换。在一个实施方案中，312lys被312glu、312asn或312ile所置换。
138.在一个实施方案中，312lys被312glu或312arg所置换。在一个实施方案中，312lys被312arg所置换。在一个实施方案中，312lys被312glu所置换。
139.为了包括将取代基在各个位置连接的选项(进一步参见下文)，可以通过seq id no.:1的野生型残基的氨基酸置换或通过seq id no.:1的肽延长如292lys或333lys来引入lys。
140.在需要多于一个取代基的情况下，一个可以经由312lys，而第二个是经由通过肽延长或seq id no.:1中的置换所引入的lys。
141.在一个实施方案中，seq id no:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处的lys残基：292lys、293lys、294lys、296lys、299lys、300lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、312lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
142.在一个实施方案中，seq id no:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处的lys残基：292lys、293lys、294lys、299lys、300lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、312lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
143.在一个实施方案中，seq id no:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处
的lys残基：292lys、293lys、294lys、300lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、312lys、313lys、314lys、316lys、318lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
144.在一个实施方案中，seq id no:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处的lys残基：292lys、293lys、294lys、300lys、303lys、305lys、306lys、311lys、312lys、313lys、314lys、316lys、318lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
145.在一个实施方案中，seq id no:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处的lys残基：292lys、293lys、294lys、300lys、303lys、305lys、306lys、311lys、313lys、314lys、316lys、318lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
146.另外或备选地，本发明的肽类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、295lys、296lys、298lys、299lys、301lys、302lys、303lys、305lys、306lys、307lys、309lys、310lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。
147.在进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、295lys、296lys、298lys、299lys、302lys、303lys、305lys、306lys、307lys、309lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。
148.在进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、295lys、296lys、298lys、299lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。
149.在进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、295lys、296lys、299lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。
150.在进一步的实施方案中，本发明的egf(a)类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、296lys、299lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。
151.在进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、299lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。
152.在进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、299lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。
153.在进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、299lys、303lys、305lys、306lys、310lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。
154.在进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、299lys、303lys、305lys、306lys、309lys、310lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。
155.在进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物包含至少一个选自292lys、293lys、294lys、303lys、305lys、306lys、310lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys的氨基酸置换。在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含以下任何置换：296k、298k、301k、302k和307k。
156.在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含以下任何置换：296k、298k、301k、302k、307k和310k。
157.在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含以下任何置换：296k、298k、301k、302k、307和295k。
158.在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含以下任何置换：296k、298k、301k、302k、307k和295d。
159.在特定的实施方案中，本发明的肽类似物包含1或2个这样的lys置换。
160.另外或备选地，本发明的肽可以包含312lys。
161.在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含两个lys残基。在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含两个lys残基，这两个lys残基选自由以下组成的对：
162.i.293k和294k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xiv.313k和321k
163.ii.293k和312k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xv.313k和324k
164.iii.293k和333k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xvi.313k和328k
165.iv.309k和313k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xvii.313k和332k
166.v.309k和324k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xviii.313k和333k
167.vi.309k和328k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xix.314k和333k
168.vii.309k和332k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xx.321k和332k
169.viii.309k和333k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxi.321k和333k
170.ix.311k和313k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxii.324k和333k
171.x.312k和333k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxiii.324k和328k
172.xi.312k和313k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxiv.328k和333k
173.xii.312k和314k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxv.330k和333k，以及
174.xiii.313k和314k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxvi.332k和333k。
175.如本文以上所述，本发明提供各种肽类似物。在进一步的实施方案中，根据本发明的egf(a)肽类似物与seq id no.:1相比包含至少两个由以下所示i-xxiv组中的任一个所表示的氨基酸置换。
176.在更进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物由如下所示i-xxiv组中的任一个所表示的氨基酸置换组成。
177.在进一步的实施方案中，根据本发明的egf(a)肽类似物与seq idno.:1相比包含至少两个由以下所示i-xvi组中的任一个所表示的氨基酸置换。
178.在更进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物由如下所示i-xvi组中的任一个所表示的氨基酸置换组成。
179.i.301leu和309arg
180.ii.301leu、309arg、312glu
181.iii.301leu、307ile和309arg
182.iv.301leu、307ile、309arg和312glu
183.v.301leu、309arg和321glu
184.vi.301leu、309arg、321glu和312glu
185.vii.301leu、307ile、309arg和299ala
186.viii.301leu、307ile、309arg、299ala和312glu
187.ix.301leu和309arg以及至少一个lys置换
188.x.301leu、309arg、312glu以及至少一个lys置换
189.xi.301leu、307ile和309arg以及至少一个lys置换
190.xii.301leu、307ile、309arg和312glu以及至少一个lys置换
191.xiii.301leu、309arg和321glu以及至少一个lys置换
192.xiv.301leu、309arg、321glu和312glu以及至少一个lys置换
193.xv.301leu、307ile、309arg和299ala以及至少一个lys置换，或者
194.xvi.301leu、307ile、309arg、299ala和312glu以及至少一个lys置换。
195.在进一步的实施方案中，根据本发明的egf(a)肽类似物与seq id no.:1相比包含至少两个由以下所示xvii-xx组中的任一个所表示的氨基酸置换。
196.在更进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物由如下所示xvii-xx组中的任一个所表示的氨基酸置换组成。
197.xvii.301leu和309lys
198.xviii.301leu、309lys和312glu
199.xix.301leu和309lys以及至少一个其他lys置换
200.xx.301leu、309lys和312glu以及至少一个其他lys置换。
201.在进一步的实施方案中，根据本发明的egf(a)肽类似物与seq id no.:1相比包含至少两个由以下所示xxi-xxiv组中的任一个所表示的氨基酸置换。
202.在更进一步的实施方案中，本发明的egf(a)肽类似物由如下所示xxi-xxiv组中的任一个所表示的氨基酸置换组成。
203.xxi.301leu和307ile，
204.xxii.301leu、307ile和312glu
205.xxiii.301leu和307ile以及至少一个其他lys置换，以及
206.xxiv.301leu、3307ile和312glu以及至少一个其他lys置换。
207.在进一步的具体实施方案中，根据本发明的肽类似物或化合物的肽类似物包含由
seq id 1至114所表示的任一个氨基酸序列或由seq id1至114所表示的任一个氨基酸序列组成。
208.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:2-114所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:2-114所表示的任一个氨基酸序列组成。
209.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:2-47和49-114所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:2-47和49-114所表示的任一个氨基酸序列组成。
210.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:2-44、46、47和49-1-114所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:2-44、46、47和49-1-114所表示的任一个氨基酸序列组成。
211.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:2-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:2-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列组成。
212.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:2-4、6-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:2-4、6-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列组成。
213.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列组成。
214.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列组成。
215.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:3、6和81所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:3、6和81所表示的任一个氨基酸序列组成。
216.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:4、8、11、15-19、21、22、24、31-42、44、51-53、70-73、77-78、91、94、95、97-102、104-109、112-114所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:4、8、11、15-19、21、22、24、31-42、44、51-53、70-73、77-78、91、94、95、97-102、104-109、112-114所表示的任一个氨基酸序列组成。
217.在一个实施方案中，所述肽类似物包含由seq id no.:4、6、32、72、76、78、98、104和105所表示的任一个氨基酸序列或由seq id no.:4、6、32、72、76、78、98、104和105所表示的任一个氨基酸序列组成。
218.中间体化合物
219.本发明还涉及可以并入本发明衍生物的肽类似物。这类肽类似物可被称为“中间产物”或“中间体化合物”。它们为新型ldl-r(293-332)类似物的形式，如上所述其可以如下文进一步描述的那样并入本发明的egf(a)衍生物中。这类肽类似物如以上部分所定义。
220.特别是，根据本发明的肽类似物或中间肽可被称为序列seq id no:1的肽类似物。
221.在一个方面，本发明涉及如本文所述的用于制备egf(a)化合物如egf(a)衍生物的egf(a)肽类似物。
222.本文中针对本发明肽类似物公开的其他特征、定义、方面和实施方案也可适用于本发明的中间产物。
223.egf(a)衍生物
224.本发明的肽类似物可进一步包含取代基并由此成为衍生化合物。
225.术语“衍生物”通常是指可以通过化学修饰，特别是通过一个或两个取代基的共价连接，由天然肽或其类似物制备的化合物。
226.如本文所用的术语“本发明的衍生物”、“egf(a)衍生物”、“egf(a)衍生物”或“ldl-r(293-332)衍生物”或“ldl-r(293-332)类似物的衍生物”是指连接有一个或两个取代基的肽。另外或备选地，这些中的每一个可被称为侧链。换言之，“本发明的衍生物”包含肽(即在此为egf(a)肽类似物的肽序列)和至少一个(包括诸如一个或两个)取代基。
227.术语“取代基”用来描述与egf(a)肽共价键合的部分，例如该取代基为并非该egf(a)肽本身一部分的部分。
228.在一个实施方案中，所述一个或多个取代基连接至egf(a)肽类似物的氮原子。在一个实施方案中，所述一个或多个取代基连接至egf(a)肽类似物的氨基。在一个实施方案中，所述一个或多个取代基连接至egf(a)肽类似物的n末端氨基酸或连接至egf(a)肽类似物的lys残基。在一个实施方案中，所述一个或多个取代基连接至egf(a)肽类似物的n末端氨基酸。在一个实施方案中，所述一个或多个取代基连接至egf(a)肽类似物的n末端氨基酸残基的α-氮。在一个实施方案中，所述一个或多个取代基连接至egf(a)肽类似物中的lys残基。在一个实施方案中，所述一个或多个取代基连接至egf(a)肽类似物中的lys残基的ε-氮。
229.取代基的实例是多种多样的，并进一步描述于下。
230.在一方面，本发明涉及包含egf(a)肽类似物和至少一个取代基的egf(a)衍生物。在一个实施方案中，该衍生物的取代基包含至少一个脂肪酸基团。对于所有实施方案，术语egf(a)衍生物还涵盖其任何药学上可接受的盐、酰胺或酯。
231.在一个实施方案中，所述egf(a)衍生物是tfa盐、铵盐、钠盐、乙酸盐或氯化物盐。在一个实施方案中，所述egf(a)衍生物是铵盐或钠盐。
232.取代基
233.取代基是连接至egf(a)肽类似物的部分。根据本发明，优选的是该部分，例如取代基，对egf(a)肽的功能性没有影响或具有最小的影响，同时增加其他有益性质，如较长的半衰期和/或改善的口服给药后暴露。
234.由此得出，所述衍生物以及以上描述的本发明类似物具有与pcsk9结合的能力。这种与pcsk9的结合抑制pcsk9与ldl-r的结合，从而防止ldl-r降解，因此增加ldl-c和致动脉粥样硬化脂蛋白的清除率。
235.在具体的实施方案中，本发明的衍生物和类似物具有例如与天然ldl-r(293-332)或其他pcsk9结合化合物相比改善的与pcsk9结合的能力。例如，使用本文试验i所述的试验可测试本发明的类似物和衍生物抑制pcsk9与ldl-r结合的能力。
236.在一个实施方案中，所述取代基旨在改善肽的功能性。
237.在一个实施方案中，所述取代基以如下方式延长肽类似物的半衰期：包含骨架肽和取代基的衍生物的血浆半衰期具有与骨架的半衰期相比延长的半衰期。用于确定在不同物种中的半衰期的方法在本领域中是公知的，并且在wo2017/121850中以小鼠和狗为例来说明(d2和d5部分)。
238.在一个实施方案中，根据本发明的egf(a)衍生物具有超过4小时的半衰期。
239.在一个实施方案中，如在皮下或静脉内给药后测量的，根据本发明的egf(a)衍生物在小鼠中的半衰期超过6小时，如超过8小时，或者如超过10小时。
240.在一个实施方案中，根据本发明的egf(a)衍生物在狗中的半衰期超过25小时。
241.在一个实施方案中，根据本发明的egf(a)衍生物在狗中的半衰期超过50小时，如超过100小时，或者如超过150小时。
242.在一个实施方案中，半衰期延长取代基是蛋白质部分。在进一步的这类实施方案中，该蛋白质部分可包括人白蛋白、fc结构域或非结构化的蛋白质延伸。在进一步的实施方案中，该蛋白质部分可以与肽类似物融合。在进一步的实施方案中，该蛋白质部分为fc结构域，并且该fc结构域与肽类似物融合。当制备fc融合体时，所得化合物将通常是二价的，因为两个fc多肽将形成一个fc结构域。
243.在一个实施方案中，所述取代基不是蛋白质部分。在一个实施方案中，该取代基不是与egf(a)肽类似物融合的蛋白质部分。在一个实施方案中，该蛋白质部分不是fc结构域。
244.在另一个实施方案中，所述取代基为非蛋白质部分。
245.在特定实施方案中，所述取代基能够与白蛋白形成非共价复合物，从而促进衍生物在血流内的循环，并且还具有延长衍生物的作用时间的效果。在特定实施方案中，该取代基能够延长egf(a)化合物的作用时间，而基本上不降低其与pcsk9的结合能力。
246.在一个实施方案中，所述egf(a)衍生物包含半衰期延长取代基。多种半衰期延长取代基在本领域中是公知的，并具体包括如下文进一步描述的包含脂肪酸基团的白蛋白结合物，并且这类白蛋白结合物为非蛋白质取代基。
247.所述取代基包含至少一个脂肪酸基团。
248.在特定实施方案中，所述脂肪酸基团包含含有至少8个连续-ch
2-基团的碳链。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含至少10个连续的-ch
2-基团，如至少12个连续的-ch
2-基团、至少14个连续的-ch
2-基团、至少16个连续的-ch
2-基团、至少18个连续的-ch
2-基团。
249.在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含8-20个连续的-ch
2-基团。在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含10-18个连续的-ch
2-基团。在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含12-18个连续的-ch
2-基团。在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含14-18个连续的-ch
2-基团。
250.在衍生物包含两个取代基的情况下，用较短的脂肪酸基团可以获得延长的半衰期，因此在衍生物包含两个取代基的实施方案中，该脂肪酸基团可包含至少8个连续的-ch
2-基团，如至少10个连续的-ch
2-基团，如至少12个连续的-ch
2-基团，至少14个连续的-ch
2-基团，至少16个连续的-ch
2-基团。
251.在衍生物包含两个取代基的进一步的实施方案中，每个取代基包含含有8-18个连续-ch
2-基团的脂肪酸基团。在进一步的这类实施方案中，该脂肪酸基团包含10-18个连续的-ch
2-基团，如12-18个连续的-ch
2-基团，如14-18个连续的-ch
2-基团。
252.如本文所用的术语“脂肪酸基团”可被称为包含至少一个官能团的化学基团，该官能团为pka《7的酸。作为酸的这类官能团的非限制性实例包括羧酸(还包括羧基苯氧基)、磺酸、四唑部分。
253.在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含选自羧酸、磺酸、四唑部分、甲基磺酰基
氨基甲酰基氨基(msu)部分和3-羟基-异噁唑部分的官能团。因此，本发明的半衰期延长取代基在一个实施方案中包含羧酸、磺酸、四唑部分、甲基磺酰基氨基甲酰基氨基部分或羟基-异噁唑部分，其进一步包含8-20个连续的-ch
2-基团，如下所定义：
254.化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被称为c(n+2)二酸或者被表示为
255.化学式1b：其中n为8-20范围内的整数，
256.化学式2：5-四唑基-(ch2)
n-co-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被表示为
257.化学式2b：其中n为8-20范围内的整数。
258.化学式3：hooc-(c6h4)-o-(ch2)
m-co-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被表示为
259.化学式3b：其中羧基在化学式3的(c6h4)基团的位置2、3或4处，并且其中m为8-11范围内的整数。
260.化学式4：ho-s(o)
2-(ch2)
n-co-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被表示为
261.化学式4b：其中n为8-20范围内的整数，
262.化学式5：mes(o)2nh(co)nh-(ch2)
n-co-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被表示为
263.化学式5b：其中n为8-20范围内的整数，
264.化学式6：3-ho-异噁唑-(ch2)
n-co-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被表示为
265.化学式6b：其中n为8-20范围内的整数。
266.术语官能团在其酸性形式时被表示为fg-h，并且其共轭碱形式被表示为fg-。如本
文所用的术语“pka《7的官能团”可被称为酸，其在水溶液中的甲基衍生物(ch
3-fg-h)形式具有低于7的平衡pka，其中pka为以下所示平衡的平衡常数(ka)的-log：
[0267][0268]
本领域公知测定pka的方法。例如reijenga等人在anal chem insights 2013(2013；8:53
–
71)中描述了这样的方法。
[0269]
在一个实施方案中，根据本发明的取代基包含一个或多个连接体元件。该连接体元件可通过酰胺键与脂肪酸基团连接并被称为z
2-z
10
。如下文进一步定义的，连接体元件的数目可以至多为10个。
[0270]
在具体的实施方案中，所述连接体为式i：
[0271]z1-z
2-z
3-z
4-z
5-z
6-z
7-z
8-z
9-z
10-[i]，其中
[0272]
z1选自：
[0273]
化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*或
[0274]
化学式1b：
[0275]
化学式2：5-四唑基-(ch2)
n-co-*或
[0276]
化学式2b：
[0277]
化学式3：hooc-(c6h4)-o-(ch2)
m-co-*或
[0278]
化学式3b：其中羧基在-(c6h4)-的位置2、3或4处，
[0279]
化学式4：hos(o)
2-(ch2)
n-co-*或
[0280]
化学式4b：
[0281]
化学式5：mes(o)2nh2n(co)nhn-(ch2)
n-co-*或
[0282]
化学式5b：和
[0283]
化学式6：3-ho-异噁唑-(ch2)
n-co-*或
[0284]
化学式6b：
[0285]
其中n为8-20范围内的整数，且m为8-11范围内的整数。
[0286]
在特定实施方案中，在化学式1或1b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在特定实施方案中，在化学式2或2b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在特定实施方案中，在化学式4或4b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在特定实施方案中，在化学式3或3b中m为8、9、10或11。
[0287]
在特定实施方案中，在化学式5或5b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
[0288]
在特定实施方案中，在化学式6或6b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
[0289]
在特定实施方案中，符号*表示与z2中的氮的连接点。在其中z2为键的另一个实施方案中，符号*表示与相邻z元件的氮的连接点。
[0290]
在式i的背景中使用的术语“键”意为共价键。当式i(z
1-z
10
)的组分被定义为键时，其相当于其中不存在所述组分的式i。
[0291]
下文中的表述z
2-z
10
中的任一个为键也可以被解读为z
2-z
10
中的任一个不存在。在逻辑上“键”不能跟随“键”。因此本文的表述“键”意指在前的z元件共价连接至不是“键”(或不存在)的下一个z元件。
[0292]
连接体元件z
2-z
10
选自能够形成酰胺键的化学部分，包括氨基酸样部分，如glu、γglu(也被称为gammal glu或gglu，并由*-nh-ch-(cooh)-ch
2-ch
2-co-*定义)、gly、ser、ala、thr、ado、aeep、aeeep和ttdsuc，和以下定义的其他部分。
[0293]
z2选自
[0294]
化学式7：*-nh-so
2-(ch2)
3-co-*或
[0295]
化学式7b：
[0296]
化学式8：*-nh-ch
2-(c6h
10
)-co-*或
[0297]
化学式8b：和
[0298]
键。
[0299]
z3选自γglu、glu或键。
[0300]
当z2为化学式7或化学式7b时，z3选自γglu、glu或键。
[0301]
z3选自γglu、glu或键，条件是当z2为化学式8时，z3选自γglu、glu。
[0302]
当z2为化学式8时，z3选自γglu和glu。
[0303]
z4、z5、z6、z7、z8、z9彼此独立地选自glu、γglu、gly、ser、ala、thr、ado、aeep、aeeep、ttdsuc和键。
[0304]
本领域公知，glu、gly、ser、ala、thr为氨基酸残基。
[0305]
γglu为化学式9：*-nh-ch(cooh)-(ch2)
2-co-*，其等同于化学式9b：
[0306]
并且也可被称为gglu。
[0307]
ttdsuc为化学式10：
[0308]
*-nh-(ch2)
3-o-(ch2)
2-o-(ch2)2o-(ch2)
3-nhco*或
[0309]
*-nh-ch2ch2ch2och2ch2och2ch2och2ch2ch2nhco*，其等同于
[0310]
化学式10b：
[0311]
ado为化学式11：*-nh-(ch2)
2-o-(ch2)
2-o-ch
2-co-*，其也可被称为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其等同于
[0312]
化学式b 11b：
[0313]
aeep为化学式12：*nh-ch2ch2och2ch2och2ch2co*，其也可被表示为
[0314]
化学式12b：
[0315]
aeeep为化学式13：*nh-ch2ch2och2ch2och2ch2och2ch2co*，其也可被表示为
[0316]
化学式13b：
[0317]z10
选自键和化学式14：*-nh-ch
2-(c6h4)-ch
2-*，其也可被表示为化学式14b：
[0318]
在特定实施方案中，当z
10
为化学式14时，所述取代基连接至所述肽的n末端氨基。
[0319]
在另一个实施方案中，当z
10
为键时，所述取代基连接至存在于所述肽中的lys残基的ε位置或连接至所述肽的n末端氨基酸残基。
[0320]
在一个实施方案中，所述衍生物包含两个取代基。在一个这样的实施方案中，所述两个取代基是相同的。在一个这样的实施方案中，所述两个取代基是不同的。在一个实施方案中，所述两个取代基连接至egf(a)肽类似物的氮原子。在一个实施方案中，所述两个取代基连接至egf(a)肽类似物的氨基。在一个实施方案中，所述两个取代基连接至n末端氨基酸egf(a)且连接至egf(a)肽类似物的lys残基。在一个实施方案中，一个取代基连接至egf(a)肽类似物的n末端氨基酸残基的α-氮，并且一个取代基连接至该egf(a)肽类似物的lys残基。在一个实施方案中，两个取代基连接至egf(a)肽类似物的n末端氨基酸。在一个实施方案中，这两个取代基连接至egf(a)肽类似物的不同lys残基。在一个实施方案中，这两个取代基连接至egf(a)肽类似物中不同lys残基的ε-氮。
[0321]
在存在两个取代基的一个实施方案中，在连接至肽类似物的n末端氨基的一个取
代基中z
10
为化学式14，而在连接至存在于所述肽类似物中的lys残基的ε位置的另一个取代基中z
10
为键。
[0322]
在存在两个取代基的另一个实施方案中，在连接至肽类似物的n末端氨基的一个取代基中z
10
为键，而在连接至存在于所述肽类似物中的lys残基的ε位置的另一个取代基中z
10
为键。
[0323]
在存在两个取代基的另一个实施方案中，在两个取代基中z
10
均为键，并且这两个取代基中的每一个都连接至存在于肽类似物中的不同lys残基的ε位置。
[0324]
在特定实施方案中，可以通过一个或两个取代基的共价连接由egf(a)肽类似物制备本发明的衍生物。
[0325]
在特定实施方案中，所述两个取代基为式i：z
1-z
2-z
3-z
4-z
5-z
6-z
7-z
8-z
9-z
10-[i]。z1至z
10
如上所定义。在特定实施方案中，这两个取代基为式i并且是相同的，这意味着选定的z1至z
10
在两个取代基中是相同的。在另一个实施方案中，这两个取代基为式i并且是不同的，这意味着一个或多个选定的z1至z
10
在一个取代基与另一个取代基之间不同。
[0326]
具体取代基
[0327]
如上所见，各种取代基可以由本领域技术人员制备。本技术中包括的取代基因此不被认为是对本发明的限制。
[0328]
在一个实施方案中，所述一个或两个取代基选自以下取代基：
[0329]
[0330][0331]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为16；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8、z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为化学式14：*-nh-ch
2-(c6h4)-ch
2-*。
[0332]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为16；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为键。
[0333]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为14或16；z2为键；z3为γglu；并且z4、z5、z6、z7、z8和z9均为键；z
10
为键。
[0334]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为16或18；z2为化学式8(trx)；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为键。
[0335]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式2：四唑基-(ch2)
n-co-*，其中n为15；z2为化学式7(磺酰亚胺)；z3为键；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为化学式14：*-nh-ch
2-(c6h4)-ch
2-*。
[0336]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式2：四唑基-(ch2)
n-co-*，其中n为15；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为键。
[0337]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式2：四唑基-(ch2)
n-co-*，其中n为12；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为键。
[0338]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式3：hooc-(c6h4)-o-(ch2)
m-co-*，其中m为10；z2为键；z3为键；并且z4、z5、z6、z7、z8和z9均为键；z
10
为键。
[0339]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式3：hooc-(c6h4)-o-(ch2)
m-co-*，其中m为10；z2为键；z3为γglu；并且z4、z5、z6、z7、z8和z9均为键；z
10
为键。
[0340]
在一个实施方案中，所述取代基为式i，其中z1为化学式3：hooc-(c6h4)-o-(ch2)
m-co-*，其中m为10；z2为键；z3为γglu；并且z4、z5、z6、z7、z8和z9之一为γglu，而其余五个为键；z
10
为键。
co-*，其中n为12；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，其余四个为键；z
10
为键。
[0355]
具体取代基组合：
[0356]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个式i的取代基，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为16；z2为键；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为键。
[0357]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个式i的取代基，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为14；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为键。
[0358]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个式i的取代基，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为14；z2为键；z3为γglu；所有z4、z5、z6、z7、z8和z9中的四个为键；z
10
为键。
[0359]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个式i的取代基，其中z1为化学式3：hooc-(c6h4)-o-(ch2)
m-co-*，其中m为10；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，其余四个为键；z
10
为键。
[0360]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式i，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为16；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8、z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为化学式14：*-nh-ch
2-(c6h4)-ch
2-*；另一个取代基为式i，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为16；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8、z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为键。
[0361]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式i，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为16；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8、z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为化学式14：*-nh-ch
2-(c6h4)-ch
2-*；另一个取代基为式i，其中z1为化学式3：hooc-(c6h4)-o-(ch2)
m-co-*，其中m为10；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，其余四个为键；z
10
为键。
[0362]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式i，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为16；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8、z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为键；另一个取代基为式i，其中z1为化学式3：hooc-(c6h4)-o-(ch2)
m-co-*，其中m为10；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，其余四个为键；z
10
为键。
[0363]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式i，其中z1为化学式1：hooc-(ch2)
n-co-*，其中n为16；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8、z9中的两个为ado，而其余四个为键；z
10
为键；并且另一个取代基为式i，其中z1为化学式4：hos(o)
2-(ch2)
n-co-*，其中m为15；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，其余四个为键；z
10
为化学式14：*-nh-ch
2-(c6h4)-ch
2-*。
[0364]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式i，其中z1为化学式3：hooc-(c6h4)-o-(ch2)
m-co-*，其中m为10；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，其余四个为键；z
10
为键；另一个取代基为式i，其中z1为化学式4：hos(o)
2-(ch2)
n-co-*，其中m为15；z2为键；z3为γglu；z4、z5、z6、z7、z8和z9中的两个为ado，其余四个
为键；z
10
为化学式14：*-nh-ch
2-(c6h4)-ch
2-*。
[0365]
肽和连接位点
[0366]
根据本发明的egf(a)衍生物或化合物包含由seq id no.:1所定义的ldl-r的egf(a)结构域的egf(a)肽类似物。这样的肽序列已经在上文详细描述，并且本发明的衍生物或化合物的肽可通过相同术语来描述和定义。该egf(a)衍生物或化合物进一步具有至少一个与肽序列连接的、如上文描述的取代基。
[0367]
在本发明的化合物中，所述取代基与肽共价连接，意思是连接至肽序列的一个氨基酸残基。
[0368]
在一个实施方案中，本发明的egf(a)衍生物包含不连接至以下位置中的任一个的取代基：295、296、298、301、302和307。在进一步的实施方案中，该取代基不连接至以下位置中的任一个：295、296、298、301、302、307和310。在进一步的这类实施方案中，它也不连接至以下位置中的任一个：299和320。
[0369]
在特定实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置297、304、308、317、319和331中的任何位置之外的任何位置连接。
[0370]
在特定实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置297、298、301、302、304、307、308、317、319和331中的任何位置之外的任何位置连接。
[0371]
在特定实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置295、296、297、298、301、302、304、307、308、317、319和331中的任何位置之外的任何位置连接。在特定实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置295、296、297、298、301、302、304、307、308、310、317、319、320和331中的任何位置之外的任何位置连接。在特定实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置295、296、297、298、301、302、304、307、308、309、310、317、319、320和331中的任何位置之外的任何位置连接。
[0372]
在一个实施方案中，所述取代基连接至egf(a)肽类似物的位置292、293、294、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、332和333中的任意一个或两个。
[0373]
在一个实施方案中，所述取代基连接至egf(a)肽类似物的位置292、293、294、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、332和333中的任意一个或两个。
[0374]
在一个实施方案中，所述取代基连接至egf(a)肽类似物的位置292、293、294、300、303、305、306、311、312、313、314、315、316、318、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、332和333中的任意一个或两个。
[0375]
在一个实施方案中，所述取代基连接至肽序列的n末端氨基酸。在特定实施方案中，该n末端氨基酸为gly。在特定实施方案中，该n末端氨基酸为293gly。在特定实施方案中，该n末端氨基酸为293lys。在特定实施方案中，该n末端氨基酸为292lys。它还可以是n末端位置的lys或gly或另一个氨基酸残基，该n末端位置可以是293或从n末端进一步向下的任何位置，如294thr、294gly或294lys或295asn。在特定实施方案中，该取代基连接至肽类似物的n末端氨基酸残基的α-氮。在另一个实施方案中，如果n末端氨基酸残基为lys，则该取代基可以共价连接至该赖氨酸残基的α-氮或ε氨基。
[0376]
在特定实施方案中，取代基连接至存在于肽中的lys残基的ε-氨基。
[0377]
在另一个实施方案中，取代基连接至c末端位置的lys，该位置可以是位置332、333或进一步朝向c末端的任何位置。
[0378]
在本发明的肽包含n末端或c末端延长的实施方案中，所述取代基可以连接至所述延长的氨基酸残基上。在存在n末端延长的情况下，取代基可以连接至所述延长的n末端氨基酸或连接至存在于延长序列内的lys。在存在c末端延长的情况下，取代基可以连接至c末端位置的lys残基或连接至存在于延长序列内的lys。
[0379]
在又一个实施方案中，所述取代基连接至存在于肽序列中的氨基酸。在特定实施方案中，该取代基连接至存在于肽中的赖氨酸残基。在特定实施方案中，该取代基连接至存在于肽中的赖氨酸残基的ε氨基。与该取代基连接的赖氨酸残基可位于ldl-r(293-332)egf(a)类似物的任何位置，包括该肽的n末端位置或c末端位置、n末端延长(如果存在)的n末端残基之内或之处的任何位置、c末端延长(如果存在)的c末端残基之内或之处的任何位置。
[0380]
如上文所述，所述egf(a)肽类似物可具有一个或多个lys残基；并且这些残基可用于取代基的连接。
[0381]
在特定实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：292lys、293lys、294lys、299lys、300lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、312lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
[0382]
在特定实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自293lys、294lys、295lys、296lys、298lys、299lys、301lys、302lys、303lys、305lys、306lys、307lys、309lys、310lys、311lys、312lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
[0383]
在特定实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自293lys、294lys、300lys、303lys、306lys、309lys、311lys、312lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
[0384]
在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自293lys、294lys、298lys、299lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、312lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
[0385]
在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：292lys、293lys、294lys、299lys、300lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、313lys、314lys、315lys、316lys、318lys、320lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
[0386]
在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：292lys、293lys、294lys、300lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、313lys、314lys、316lys、318lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
[0387]
在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：293lys、294lys、300lys、303lys、305lys、306lys、309lys、311lys、313lys、314lys、316lys、318lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
[0388]
在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：293lys、294lys、300lys、303lys、305lys、306lys、311lys、313lys、314lys、316lys、318lys、321lys、322lys、323lys、324lys、325lys、326lys、327lys、328lys、329lys、330lys、332lys和333lys。
[0389]
在所述取代基连接至c末端延长的实施方案中，该取代基所连接的赖氨酸可以选自333lys至242lys位置中的任一个和/或333lys至383lys位置中的任一个。
[0390]
在本发明化合物具有两个取代基的实施方案中，该取代基可以如上所述彼此独立地连接，这意味着任一个可连接至肽的n末端氨基酸，连接至肽的c末端氨基酸，或连接至肽的氨基酸序列内的氨基酸。
[0391]
在lys存在于n末端位置的实施方案中，两个取代基可以均与肽的n末端lys连接。一个可与所述lys的n末端α-胺连接，而另一个可与所述lys的ε氮连接。当存在两个取代基时，一个取代基可与肽的n末端氨基酸连接，而另一个取代基与肽内的氨基酸如lys连接。或者，一个取代基可与肽的c末端位置的lys连接，而另一个取代基与肽内的氨基酸如lys连接。或者，一个取代基可与肽(包括延长)内的氨基酸残基如lys连接，另一个取代基与肽(包括延长)内的另一个氨基酸残基如lys连接。
[0392]
在一个实施方案中，本发明的化合物具有一个取代基，所述取代基在n末端与肽连接；或者所述取代基在位置292lys处与肽连接；或者所述取代基在位置293lys处与肽连接，或者所述取代基在位置299lys处与肽连接；或者所述取代基在位置300lys与肽连接；或者所述取代基在位置309lys处与肽连接；或者所述取代基在位置311lys处与肽连接；或者所述取代基在位置312lys处与肽连接；或者所述取代基在位置313lys处与肽连接；或者所述取代基在位置314lys处与肽连接；或者所述取代基在位置315lys处与肽连接；或者所述取代基在位置316lys处与肽连接；或者所述取代基在位置318lys处与肽连接；或者所述取代基在位置320lys处与肽连接；或者所述取代基在位置321lys处与肽连接；或者所述取代基在位置322lys处与肽连接；或者所述取代基在位置323lys处与肽连接；或者所述取代基在位置324lys处与肽连接；或者所述取代基在位置325lys处与肽连接；或者所述取代基在位置326lys处与肽连接；或者所述取代基在位置328lys处与肽连接；或者所述取代基在位置329lys处与肽连接；或者所述取代基在位置330lys处与肽连接；或者所述取代基在位置332lys处与肽连接；或者所述取代基在位置333lys处与肽连接。
[0393]
在本发明的衍生物具有两个取代基的实施方案中，所述取代基可经由n末端和以上提及的任意lys位置如293lys、309lys、313lys、324lys、328lys、330lys、332lys和333lys与肽连接。
[0394]
在衍生物包含两个取代基的进一步的实施方案中，它们可以连接至两个不同的lys残基，如以下lys残基对中的任一个
[0395]
i.293k和294k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xiv.313k和321k
[0396]
ii.293k和312k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xv.313k和324k
[0397]
iii.293k和333k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xvi.313k和328k
[0398]
iv.309k和313k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xvii.313k和332k
[0399]
v.309k和324k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xviii.313k和333k
[0400]
vi.309k和328k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xix.314k和333k
[0401]
vii.309k和332k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xx.321k和332k
[0402]
viii.309k和333k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxi.321k和333k
[0403]
ix.311k和313k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxii.324k和333k
[0404]
x.312k和333k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxiii.324k和328k
[0405]
xi.312k和313k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxiv.328k和333k
[0406]
xii.312k和314k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxv.330k和333k，以及
[0407]
xiii.313k和314k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xxvi.332k和333k。
[0408]
在一个实施方案中，所述两个取代基经由333lys和选自293lys、309lys、312lys、313lys、314lys、321lys、324lys、328lys、330lys和332lys的lys连接。
[0409]
在一个实施方案中，所述两个取代基经由333lys和选自312lys、313lys、314lys、321lys、324lys、328lys和330lys的lys连接。
[0410]
在一个实施方案中，所述两个取代基经由333lys和选自313lys、324lys和328lys的lys连接。
[0411]
如上所述，所述肽可具有一个或多个可与如本文所述特定位置上的特定氨基酸残基组合的氨基酸置换。这类特定氨基酸残基可以是应该被保持的野生型氨基酸残基，如半胱氨酸，其在一系列优选实施方案中，例如与本文所述的其他特征组合，可存在于肽类似物中。在这类实施方案中，该肽类似物在位置297cys-308cys、304cys-317cys和319cys-331cys处包含三个二硫键。在这类实施方案的另一个实例中，肽衍生物的肽类似物包含在位置297cys-308cys、304cys-317cys和319cys-331cys处的三个二硫键和至少一个取代基，其中该取代基不与选自所述肽类似物的295、296、298、301、302和307的位置连接。本领域技术人员将会理解，肽序列信息的组合可与取代基的位置和身份信息组合，以定义本发明的各个具体实施方案。
[0412]
在一个实施方案中，所述肽类似物在除取代基所连接的位置外的其他位置不包含lys。
[0413]
在一个实施方案中，本发明的化合物具有一个取代基，所述取代基在n末端位置连接或者连接至任何位置的lys，并且所述肽类似物在所有其他位置不包含lys。在一个实施方案中，本发明的化合物具有一个取代基，所述取代基连接至除位置312以外的任何位置的lys，并且所述肽类似物在位置312arg处包含arg。
[0414]
在一个实施方案中，本发明的化合物具有两个取代基，并且所述肽类似物在除取代基所连接的位置外的位置不包含lys。
[0415]
在一个实施方案中，根据本发明的egf(a)衍生物选自以下egf(a)衍生物：wo2017/121850中公开的实施例1-47、51-102和106-159。
[0416]
在进一步的实施方案中，根据本发明的egf(a)衍生物单独地选自以下egf(a)衍生物：wo2017/121850中公开的实施例1-47、51-102和106-159。。
[0417]
在一个实施方案中，根据本发明的egf(a)衍生物选自以下egf(a)衍生物：wo2017/121850中公开的实施例1-44、46-47、51-55、57、60-64、66-69、71-102和106-159。。
[0418]
在一个实施方案中，根据本发明的egf(a)衍生物选自以下egf(a)衍生物：wo2017/121850中公开的实施例31、95、128、133、143、144、150、151、152和153，具有以下所示的结构。
[0419]
#结构
[0420][0421]
[0422][0423]
递送剂
[0424]
n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐
[0425]
本发明中使用的递送剂是n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐。n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸根的结构式在式(i)中示出。
[0426][0427]
在一些实施方案中，n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐包含一个单价阳离子、两个单价阳离子或一个二价阳离子。在一些实施方案中，n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐选自n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的钠盐和钾盐。在一个实施方案中，n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐选自钠盐、钾盐和/或铵盐。在一个实施方案中，n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是钠盐或钾盐。在一个实施方案中，n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐选自钠盐和铵盐。n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸盐可以使用例如wo96/030036、wo00/046182、wo01/092206或wo2008/028859中所述的方法来制备。
[0428]
n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐可以是结晶的和/或无定形的。在一些实施方案中，递送剂包括n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐的无水物、一水合物、二水合物、三水合物、溶剂化物或三分之一水合物，及其组合。在一些实施方案中，递送剂是如wo2007/121318中描述的n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。
[0429]
在一些实施方案中，递送剂是n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(在本文中称为“snac”)，也称为8-(水杨酰基氨基)辛酸钠。
[0430]
组合物
[0431]
本发明的组合物或药物组合物是适合于通过口服途径施用的固体或干燥组合物，如下文进一步描述。
[0432]
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种药学上可接受的辅料。如本文所用的术语“辅料”宽泛地指除活性治疗成分或活性药物成分(api)外的任何组分。辅料可以是药学惰性物质、无活性物质和/或治疗上或医学上无活性的物质。
[0433]
辅料可用于多种目的，例如作为载体、媒介物、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、流动控制剂、结晶抑制剂、增溶剂、稳定剂、着色剂、调味剂、表面活性剂、乳化剂或其组合，并且/或者用于改善治疗活性物质或活性药物成分的给药和/或吸收。如本文所述，n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是充当递送剂的辅料。所使用的每种辅料的量可以在本领域的常规范围内变化。可用于配制口服剂型的技术和辅料在以下文献中描述：handbook of pharmaceutical excipients,第8版,sheskey等人编,american pharmaceuticals association and the pharmaceutical press,publications department of the royal pharmaceutical society of great britain(2017)；和remington:the science and practice of pharmacy,第22版,remington和allen编,pharmaceutical press(2013)。
[0434]
在一些实施方案中，辅料可以选自粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)等；填充剂，如纤维素粉末、微晶纤维素、纤维素衍生物，例如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素，磷酸氢钙、玉米淀粉、预胶化淀粉等；润滑剂和/或助流剂，如硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酰富马酸钠、三山萮酸甘油酯等；流动控制剂，如胶体二氧化硅、滑石等；结晶抑制剂，如聚维酮等；增溶剂，如pluronic、聚维酮等；着色剂，包括染料和颜料，如氧化铁红或氧化铁黄、二氧化钛、滑石等；ph控制剂，如柠檬酸、酒石酸、富马酸、柠檬酸钠、磷酸氢钙、磷酸氢二钠等；表面活性剂和乳化剂，如pluronic、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚乙氧基化和氢化蓖麻油等；以及两种或更多种这些辅料和/或佐剂的混合物。
[0435]
所述组合物可以包含粘合剂，如聚维酮；淀粉；纤维素及其衍生物，如微晶纤维素，例如来自fmc(philadelphia,pa)的avicel ph、来自dow chemical corp.(midland,mi)的羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素methocel；蔗糖；右旋糖；玉米糖浆；多糖；和明胶。粘合剂可以选自干法制粒粘合剂和/或湿法制粒粘合剂。合适的干法制粒粘合剂是，例如，纤维素粉末和微晶纤维素，如avicel ph 102和avicel ph 200。在一些实施方案中，该组合物包含avicel，如avicel ph 102。用于湿法制粒或干法制粒的合适的粘合剂是玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(共聚维酮)和纤维素衍生物，如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。在一些实施方案中，该组合物包含聚维酮。
[0436]
在一些实施方案中，所述组合物包含填充剂，该填充剂可以选自乳糖、甘露糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、山梨糖醇、磷酸钙如磷酸氢钙、微晶纤维素、粉状纤维素、糖果糖、可压缩糖、葡萄糖结合剂、糊精和右旋糖。在一些实施方案中，该组合物包含微晶纤维素，如avicel ph 102或avicel ph 200。
[0437]
在一些实施方案中，所述组合物包含润滑剂和/或助流剂。在一些实施方案中，该组合物包含润滑剂和/或助流剂，如滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、山萮酸甘油酯、二
山萮酸甘油酯、山萮酰基聚氧乙烯-8甘油酯、聚环氧乙烷聚合物、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、油酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、氢化植物油、二氧化硅和/或聚乙二醇等。在一些实施方案中，该组合物包含硬脂酸镁或二山萮酸甘油酯(例如由山萮酸(c22)的单酯、二酯和三酯组成的产品888ato，其中二酯部分占优势)。
[0438]
在一些实施方案中，所述组合物包含崩解剂，如羟乙酸淀粉钠、波拉克林钾、羟乙酸淀粉钠、交聚维酮、交联羧甲纤维素、羧甲基纤维素钠或干燥的玉米淀粉。
[0439]
所述组合物可包含一种或多种表面活性剂，例如一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指由水溶性(亲水性)部分与脂溶性(亲脂性)部分组成的任何分子或离子。该表面活性剂例如可选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。
[0440]
本发明的组合物具有极高含量的递送剂。这种极高的含量可以相对于还包含活性药物成分(即pcsk9抑制剂)的片剂的全部含量或相对于不包括活性药物成分的辅料的总含量来定义。下文中的描述还涉及由特定成分——pcsk9抑制剂和辅料组成的组合物，术语“组成”应理解为可包含痕量的对组合物的功能没有影响的任何物质，也可以称为基本由...组成。这类物质可能是在制备pcsk9抑制剂时或在生产nac盐时残留的杂质，或最少量的不影响制剂质量或吸收的任何药学上可接受的辅料。
[0441]
本发明的一方面涉及药物组合物，其包含
[0442]
a)pcsk9抑制剂，和
[0443]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐占所述组合物的至少或高于60w/w％。
[0444]
在其他这样的实施方案中，所述nac的盐占所述组合物的70w/w％以上，如75w/w％以上，如80w/w％以上，如85w/w％以上，如90w/w％以上。
[0445]
在其他这样的实施方案中，所述nac的盐占所述组合物的至少70w/w％，如至少75w/w％，如至少80w/w％，如至少85w/w％，如至少90w/w％。
[0446]
在一个实施方案中，所述药物组合物包含
[0447]
a)pcsk9抑制剂，和
[0448]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐，其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％。
[0449]
在一个实施方案中，所述药物组合物由以下成分组成
[0450]
a)pcsk9抑制剂，和
[0451]
b)辅料，其中所述辅料是
[0452]
i.n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐，和
[0453]
ii.一种或多种其他辅料
[0454]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％。
[0455]
在其他这样的实施方案中，所述nac的盐占所述组合物的辅料的至少91w/w％，如至少92w/w％，如至少93w/w％，如至少94w/w％，如至少95w/w％。
[0456]
在其他这样的实施方案中，所述nac的盐占所述组合物的辅料的95w/w％以上，如96w/w％以上，如97w/w％以上，或者如98w/w％以上。
[0457]
本发明的一方面涉及药物组合物，其包含
[0458]
a)pcsk9抑制剂，和
[0459]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐，其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％。
[0460]
在一个实施方案中，所述药物组合物由以下成分组成
[0461]
a)pcsk9抑制剂，和
[0462]
b)辅料，其中所述辅料是
[0463]
i.n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐，和
[0464]
ii.一种或多种其他辅料
[0465]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％。
[0466]
在其他这样的实施方案中，所述nac的盐占所述组合物的辅料的至少91w/w％，如至少92w/w％，如至少93w/w％，如至少94w/w％，如至少95w/w％。
[0467]
在其他这样的实施方案中，所述nac的盐占所述组合物的辅料的95w/w％以上，如96w/w％以上，如97w/w％以上，或者如98w/w％以上。
[0468]
在其他这样的实施方案中，所述nac的盐占所述组合物的60w/w％以上，如70w/w％以上，如75w/w％以上，或者如80w/w％以上。
[0469]
在其他这样的实施方案中，所述nac的盐占所述组合物的至少60w/w％，如至少70w/w％，如至少75w/w％，如者如至少80w/w％。
[0470]
在其他这样的实施方案中，所述nac的盐占所述组合物的辅料的至少95w/w％，如至少96w/w％，如至少97w/w％，如者如至少98w/w％。
[0471]
如上所述，除了递送剂以外，辅料的含量根据本发明优选为最小。在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种润滑剂。
[0472]
在一个实施方案中，所述药物组合物包含以下成分或由以下成分组成：
[0473]
a)pcsk9抑制剂，
[0474]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐，和
[0475]
c)至少一种润滑剂。
[0476]
在这样的实施方案中，所述润滑剂可以是硬脂酸镁或二山萮酸甘油酯。在一个实施方案中，该润滑剂是硬脂酸镁。在一个实施方案中，该润滑剂是二山萮酸甘油酯。
[0477]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)盐占组合物辅料的至少95w/w％的上述组合物可以进一步是这样的组合物，其中所述盐占该组合物的至少或高于60w/w％。
[0478]
同样，其中所述盐占组合物的至少或高于60w/w％的上述组合物可以进一步是这样的组合物，其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐占该组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％。
[0479]
所述药物组合物可以进一步是这样的组合物，其中n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐选自n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的钠盐、钾盐，或者就选自该钠盐和钾盐。在一个实施方案中，n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐是n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠。
[0480]
在其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)盐占组合物辅料的至少90w/w％的实施方案中，任何其他辅料占辅料的至多10w/w％，即任何这样的粘合剂、填充剂和/或润滑剂/助流剂占组合物辅料重量的至多10w/w％。在一些实施方案中，该组合物的辅料包含至少或高于90w/w％的递送剂，和少于5w/w％的任何其他辅料，如粘合剂、填充剂和/或润滑剂/助流剂。在一个实施方案中，该组合物的辅料包含至少90w/w％的递送剂和至多或少于5w/w％的润滑剂。在一个实施方案中，该组合物的辅料包含至少90w/w％的递送剂和少于3w/w％的润滑剂。
[0481]
在一些实施方案中，所述组合物的辅料包含至少或高于90w/w％的递送剂，和0.1-10w/w％，如0.5-8w/w％，如1-5w/w％的润滑剂。在其他这样的实施方案中，该组合物的辅料包含1-3w/w％或如2-2.5w/w％的润滑剂。
[0482]
在其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)盐占组合物辅料的至少95w/w％的实施方案中，该组合物的任何其他辅料占辅料的至多5w/w％，即任何这样的粘合剂、填充剂和/或润滑剂/助流剂占组合物辅料重量的至多5w/w％。在一些实施方案中，该组合物的辅料包含至少95w/w％的递送剂和少于5w/w％的润滑剂。在一个实施方案中，该组合物的辅料包含至少95w/w％的递送剂和少于3w/w％的润滑剂。
[0483]
在一些实施方案中，所述组合物的辅料包含至少95w/w％的递送剂，和0.1-5w/w％，如0.5-4w/w％或1-3w/w％的润滑剂。在其他这样的实施方案中，该组合物的辅料包含2-2.5w/w％的润滑剂。
[0484]
如下文所述，根据本发明的药物组合物优选以适合于口服给药的剂型生产。在下文中，参照剂量单位中的含量，即每个片剂、胶囊或囊剂，提供本发明组合物的成分的绝对量。
[0485]
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物在每个剂量单位中可包含至多1000mg所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。在一个实施方案中，本发明涉及组合物，其中剂量单位包含至多600mg的所述盐。
[0486]
在一些实施方案中，每个剂量单位中n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸盐的量为至少0.05mmol，如至少0.075mmol，如至少0.1mmol，如至少0.125mmol，如至少0.15mmol，如至少0.20mmol、至少0.25mmol、至少0.30mmol、至少0.35mmol、至少0.40mmol、至少0.45mmol、至少0.50mmol、至少0.55mmol或至少0.60mmol。
[0487]
在一些实施方案中，所述组合物每个剂量单位中n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸盐的量为至多3mmol，如至多2.75mmol，如至多2.5mmol，如至多2.25mmol，如2mmol，如至多1.5mmol、至多1mmol、至多0.75mmol、至多0.6mmol、至多0.5mmol、至多0.4mmol、至多0.3mmol和至多至0.2mmol。
[0488]
在一些实施方案中，所述组合物每个剂量单位中n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸盐的量在0.05-3mmol、0.10-2.5mmol、0.15-2.0mmol、0.20-1.5mmol、0.25-1.0mmol、0.30-0.75mmol或诸如0.45-0.65mmol的范围内。
[0489]
在其中nac的盐是snac的一些实施方案中，所述组合物中snac的量为每个剂量单位至少20mg，如至少25mg，如至少50mg，如至少75mg、至少100mgmg、至少125mg、至少150mg、至少175mg、至少200mg、至少225mg、至少250mg、至少275mg和至少300mg。
[0490]
在其中nac的盐是snac的一些实施方案中，所述组合物中snac的量为每个剂量单
位至多1000mg，如至多800mg，如至多600mg，如至多575mg，如至多550mg、至多525mg、至多500mg、至多475mg、至多450mg、至多425mg、至多400mg、至多375mg、至多350mg、至多325mg，或每个剂量单位至多300mg。
[0491]
在其中nac的盐是snac的一些实施方案中，所述组合物中snac的量在每个剂量单位100-1000mg，如150-800mg，如200-750mg，如250-700mg，如300-700mg，如350-650mg，或诸如约400mg至约600mg的范围内，如每个剂量单位约500mg。
[0492]
在其中nac的盐是snac的一些实施方案中，所述组合物中snac的量在每个剂量单位20-800mg，如25-600mg，如50-500mg，如50-400mg，如75-400mg，如80-350mg，或诸如约100mg至约300mg的范围内。
[0493]
在其中nac的盐是snac的一个实施方案中，snac的量在每个剂量单位200-800mg，如250-400mg，如250-350mg，如275-325mg的范围内，如约300mg。
[0494]
在其中nac的盐是snac的一个实施方案中，snac的量在每个剂量单位20-200mg，如25-175mg，如75-150mg，如80-120mg的范围内，如约100mg。
[0495]
在一个实施方案中，本发明药物组合物的剂量单位包含0.5-150mg、0.1-100mg或0.2-100mg的pcsk9抑制剂。
[0496]
在其中pcsk9抑制剂是egf(a)衍生物的一些实施方案中，所述组合物的剂量单位包含的pcsk9抑制剂的量在0.5-150、0.5-120、0.5-100mg、1-80mg、1-70mg、1-60、1-50mg或1-40mg的范围内。
[0497]
在其他这样的实施方案中，剂量单位包含1-50mg的pcsk9抑制剂，如每个剂量单位0.75-40mg，如10、15、20、25或30mg或35、40、45mg，如10-30或30-50mg的pcsk9抑制剂。
[0498]
在其他这样的实施方案中，剂量单位包含20至150mg的pcsk9抑制剂，如每个剂量单位20-120mg，如20-100mg，如20-80mg，如20、30、40、50、60、70或80mg，如20、30、40或50mg，或如80、85、90、95或100mg，或如100、110、120或130mg，或如50mg，或如75mg的pcsk9抑制剂。
[0499]
在其他这样的实施方案中，剂量单位包含5至50mg的pcsk9抑制剂，如每个剂量单位10-45mg，如20、30或40mg，或如25、35或45mg，或如30-50mg，或如20-40mg的pcsk9抑制剂。
[0500]
pcsk9抑制剂的量可以根据pcsk9抑制剂的身份而变化。
[0501]
在优选实施方案中，所述组合物的单位剂量包含0.5-50mg硬脂酸镁，如1-25mg，如1-10mg，如2-8mg，或如2-5mg硬脂酸镁。
[0502]
在优选实施方案中，相对于nac的盐如snac的量确定硬脂酸镁的量，使得组合物的单位剂量包含1-10mg，如1-8mg，如2-5mg，或如2-3mg硬脂酸镁/100mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸盐如snac。
[0503]
在优选实施方案中，该组合物的单位剂量包含80-1000mg snac、0.5-100mg pcsk9抑制剂和1-50mg润滑剂。
[0504]
在优选实施方案中，该组合物的单位剂量包含80-800mg snac、1.0-80mg pcsk9抑制剂和1-40mg润滑剂。
[0505]
在优选实施方案中，该组合物的单位剂量包含100-800mg snac、2-50mg pcsk9抑制剂和1-40mg润滑剂。
[0506]
在优选实施方案中，该组合物的单位剂量包含100-600mg snac、5-50mg pcsk9抑制剂和1-30mg润滑剂。
[0507]
在优选实施方案中，该组合物的单位剂量包含100-500mg snac、5-50mg pcsk9抑制剂和1-25mg润滑剂。
[0508]
在优选实施方案中，该组合物的单位剂量包含100-500mg snac、5-50mg pcsk9抑制剂和1-25mg润滑剂。
[0509]
在优选实施方案中，该组合物的单位剂量包含80-1000mg snac、0.5-100mg egf(a)衍生物和1-50mg润滑剂。
[0510]
在优选实施方案中，该组合物的单位剂量包含100-800mg snac、20-120mg egf(a)衍生物和1-30mg润滑剂。
[0511]
在优选实施方案中，该组合物的单位剂量包含200-600mg snac、50-100mg egf(a)衍生物和1-20mg润滑剂。
[0512]
在一个实施方案中，本发明的药物组合物在体外具有快速崩解或溶出。可以如本领域已知的那样，例如通过使用本文所述的试验ii或试验iii来测试崩解或溶出。
[0513]
溶出或释放可以表示为相对于组合物的pcsk9抑制剂的总含量，在给定时间段后在溶液中测得的pcsk9抑制剂的量。相对量可以以百分比给出。
[0514]
在一个实施方案中，pcsk9抑制剂从本发明药物组合物中的释放在15分钟内为至少80％或在30分钟内为至少95％。在一个这样的实施方案中，释放在ph 6.8下测量。
[0515]
在一个实施方案中，所述药物组合物包含
[0516]
a)pcsk9抑制剂，和
[0517]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，其中所述pcsk9抑制剂的释放在15分钟内达到80％，或者在30分钟内达到95％。在一个实施方案中，释放在ph 6.8下测量。
[0518]
实验已经证明，根据本发明的pcsk9抑制剂/snac组合物在崩解和溶出方面的表现类似于司美格鲁肽/snac组合物(本文的实施例2和3)。使用本文的试验v(实施例4)已经证明，与根据wo 2012/080471和wo 2013/139694制备的pcsk9抑制剂/snac组合物相比，使用根据本发明的组合物改善的pcsk9抑制剂的血浆暴露类似于之前对司美格鲁肽和其他glp-1受体激动剂所观察到的(pct/ep2019/052487)。
[0519]
在一个实施方案中，本发明的药物组合物在体内提供早期暴露。在一个实施方案中，本发明的药物组合物在体内提供增加的暴露。在一个实施方案中，本发明的药物组合物在体内提供增加的早期暴露。可以在相关模型，如本文所述的试验iii中测试这种体内暴露。还可以在预定时间段内测量暴露，并计算累积剂量校正的auc，例如对于给药后t＝0-30分钟。
[0520]
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其中相对于如wo2013/139694所述用pcsk9抑制剂代替glp-1制备的pcsk9抑制剂组合物，给药后t＝30min时剂量校正的血浆暴露增加。或者，参考物可以是本文所述的测试组合物1。
[0521]
在一个实施方案中，所述药物组合物包含
[0522]
a)pcsk9抑制剂，和
[0523]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，其中给药后t＝30min时剂量校正的血浆暴露相对于制备为wo2013/139694的f型的pcsk9抑制剂组合物增加。
[0524]
在一个实施方案中，所述药物组合物包含
[0525]
a)pcsk9抑制剂，和
[0526]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，其中给药后t＝0-30min的剂量校正的auc相对于制备为wo2013/139694的f型的pcsk9抑制剂组合物增加。
[0527]
在一个实施方案中，与制备为wo2013/139694的f型的pcsk9抑制剂组合物相比，给药后t＝0-30min的剂量校正的auc增加至少1.2倍，如1.5倍，如2倍。
[0528]
在一个实施方案中，所述药物组合物包含
[0529]
a)pcsk9抑制剂，和
[0530]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0531]
其中给药后t＝30min时剂量校正的血浆暴露相对于本文的测试组合物1增加。
[0532]
在一个实施方案中，所述药物组合物包含
[0533]
a)pcsk9抑制剂，和
[0534]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0535]
其中给药后t＝0-30min的剂量校正的auc相对于本文的测试组合物1增加。
[0536]
在一个实施方案中，相对于本文的测试组合物1，t＝0-30min的剂量校正的auc增加至少1.2倍，如1.5倍，如2倍。
[0537]
剂型
[0538]
所述组合物可以以几种剂型施用，例如以片剂、包衣片剂、囊剂或胶囊如硬壳或软壳明胶胶囊施用，并且所有这类组合物均被认为是固体口服剂型。
[0539]
例如，为了改善稳定性和/或溶解性或进一步改善生物利用度，可将组合物进一步复合在药物载体或药物递送系统中。该组合物可以是冷冻干燥或喷雾干燥的组合物。
[0540]
所述组合物可以是剂量单位的形式，如片剂。在一些实施方案中，单位剂量的重量在50mg至1000mg的范围内，如50-750mg的范围内，或如100-600mg的范围内。在一些实施方案中，剂量单位的重量在75mg至350mg的范围内，如100-300mg的范围内，或如200-350mg的范围内。
[0541]
在一些实施方案中，剂量单位的重量在100mg至400mg的范围内，如50-300mg的范围内，或如200-400mg的范围内。
[0542]
在一些实施方案中，可以在压实，即压缩成片剂之前使组合物粒化。该组合物可包含颗粒内部分和/或颗粒外部分，其中颗粒内部分已经被粒化，并且颗粒外部分已经在粒化之后添加。
[0543]
颗粒内部分可包含pcsk9抑制剂、递送剂和/或辅料，如润滑剂和/或助流剂。
[0544]
在一些实施方案中，颗粒内部分包含递送剂和润滑剂和/或助流剂。
[0545]
在一些实施方案中，颗粒外部分包含pcsk9抑制剂，和/或润滑剂和/或助流剂，如硬脂酸镁。在一些实施方案中，颗粒外部分包含pcsk9抑制剂。在一些实施方案中，颗粒外部分包含辅料，如润滑剂和/或助流剂，如硬脂酸镁。
[0546]
在另外的实施方案中，颗粒内部分包含pcsk9抑制剂、递送剂和润滑剂和/或助流剂。在这样的实施方案中，可以将颗粒直接压缩成片剂，并且该片剂不具有颗粒外部分。
[0547]
组合物的制备
[0548]
根据本发明的组合物的制备可以按照本领域已知的方法进行。
[0549]
为了制备压片材料的干掺合物，对各种组分进行任选地消除结块(delumped)或过筛，称重，然后合并。组分的混合可以进行到获得均匀的掺合物。
[0550]
术语“颗粒”和“颗粒物”在本文中可互换使用，是指可如下所述制备的组合物材料的颗粒。该术语宽泛地指用于制备固体剂量制剂的颗粒、微粒和聚集体形式的药物成分。通常，颗粒如下获得：加工粉末或掺合物以获得固体，随后用其获得所需大小的颗粒。
[0551]
如果要在压片材料中使用颗粒，则可以以本领域技术人员已知的方式来生产颗粒，例如使用已知用于生产“组合”颗粒或“分离”颗粒的湿法制粒方法。形成组合颗粒的方法可以连续运行，并且包括例如同时用造粒溶液喷洒造粒物料并干燥，例如在鼓式造粒机中，在盘式造粒机中，在圆盘造粒机中，在流化床中，通过喷雾干燥、喷雾粒化或喷雾固化，或者可以不连续运行，例如在流化床中，在旋转式流化床中，在间歇式混合器如高剪切混合器或低剪切混合器中，或在喷雾干燥鼓中。生产分离颗粒的方法可以连续地或不连续地进行，其中造粒物料首先与造粒溶液形成湿聚集体，随后将其粉碎或通过其他手段形成所需大小的颗粒，然后可以将颗粒干燥。用于湿法制粒步骤的合适的设备是行星式混合器、低剪切混合器、高剪切混合器、挤出机和滚圆机，例如但不限于来自loedige、glatt、diosna、fielder、collette、aeschbach、alexanderwerk、ytron、wyss&probst、werner&pfleiderer、hkd、loser、fuji、nica、caleva和gabler公司的设备。也可以通过干法制粒技术形成颗粒，其中将一种或多种辅料和/或活性药物成分压缩以形成相对较大的模制品，例如条状物或带状物，通过研磨将其粉碎，并将研磨的材料用作压片材料，随后压实。用于干法制粒的合适的设备是但不限于来自gerteis的辊压设备，如gerteis micro-pactor、mini-pactor和macro-pactor。
[0552]
为了将压片材料压实成固体口服剂型，例如片剂，可以使用压片机。在压片机中，将压片材料填充(例如压力进料或重力进料)到模具腔中。然后用施加压力的一组冲头将压片材料压实。随后，从压片机中排出所得到的压缩物(compact)或片剂。上述压片过程在本文中随后被称为“压实过程”。合适的压片机包括但不限于旋转式压片机和偏心式压片机。压片机的实例包括但不限于fette 102i(fette gmbh)、korsch xl100、korsch ph 106旋转式压片机(korsch ag，德国)、korsch ek-o偏心式压片机(korsch ag，德国)和manesty f-press(manesty machines ltd.，英国)。
[0553]
通常，颗粒可以通过湿法、熔融或干法制粒，优选通过干法制粒来制备。包含i、ii和/或iii的颗粒因此可以通过对其掺合物进行干法制粒，例如通过辊压而获得。在替代实施方案中，可以使用湿法制粒来获得颗粒。这种材料然后可以直接使用，或者进一步精制以获得最终颗粒。
[0554]
在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种颗粒。在一个实施方案中，该组合物包含一种类型的颗粒。或者，该组合物可以包含两种类型的颗粒。
[0555]
在实施方案中，本发明涉及组合物，其包含
[0556]
a)pcsk9抑制剂，
[0557]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐，和
[0558]
c)润滑剂
[0559]
其中所述组合物包含b)和可选的c)的颗粒。
[0560]
在进一步的实施方案中，颗粒部分可包含a)和b)以及可选的c)。
[0561]
可以通过上述各种方法实现制粒，其中a)、b)和/或c)首先以粉末形式混合，或通过制备包含所述一种或多种成分的溶液进行混合。
[0562]
在一些实施方案中，片剂的制备方法包括：a)将包含递送剂和可选的润滑剂的混合物粒化；b)将a)的颗粒与pcsk9抑制剂和可选的其他润滑剂掺混，然后c)将b)的掺合物压缩成片剂。
[0563]
在一些实施方案中，片剂的制备方法包括：a)将包含递送剂、pcsk9抑制剂和可选的润滑剂的混合物粒化，以及b)将a)的颗粒压缩成片剂，并任选地包含其他润滑剂。
[0564]
为了获得均质的产品，可以在最终干法制粒步骤/辊压或压片步骤之前包括一个或多个筛分步骤。
[0565]
最后，可以添加额外的辅料，如润滑剂，之后进行压片，从而形成颗粒外部分。
[0566]
药物适应症
[0567]
在一方面，本发明涉及pcsk9抑制剂如egf(a)肽类似物或egf(a)衍生物在制备如本文所述的药物组合物中的用途。
[0568]
在一方面，本发明涉及包含pcsk9抑制剂，如egf(a)肽类似物或egf(a)衍生物的组合物，其用作药物和/或用于治疗方法。
[0569]
在一个实施方案中，所述组合物用于治疗方法，例如用于
[0570]
(i)改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质；降低ldl-c，增加hdl；降低小而致密的ldl；降低vldl；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低脂蛋白a(lp(a))的血浆水平；抑制载脂蛋白a(apo(a))的产生；
[0571]
(ii)预防和/或治疗心血管疾病，如心脏综合征x、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注损伤、卒中、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠状动脉病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齐、心律失常、晕厥、心绞痛、心脏搭桥和/或支架再闭塞、间歇性跛行(闭塞性动脉粥样硬化)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；和/或降低血压，如降低收缩压；治疗心血管疾病。
[0572]
血脂异常可以是例如血浆胆固醇浓度高，也称为高胆固醇血症，是指血浆胆固醇浓度高于总胆固醇≥5.0mmol/l的正常范围的情况。在一个实施方案中，本发明的化合物或组合物可用于治疗高胆固醇血症。
[0573]
治疗方法
[0574]
本发明进一步涉及治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的组合物。在一个实施方案中，该治疗方法用于(i)改善脂质参数，和/或(ii)预防和/或治疗心血管疾病和/或以上说明的其他适应症。
[0575]
在一些实施方案中，描述了方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含pcsk9抑制剂、n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐和可选的润滑剂的药物组合物。
[0576]
在一些实施方案中，描述了治疗糖尿病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含
[0577]
a)pcsk9抑制剂，
[0578]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸(nac)的盐，和
[0579]
c)如上文所述的润滑剂。
[0580]
描述了润滑剂的各种实例，包括硬脂酸镁。所述组合物经口服施用，并且是片剂、
胶囊或囊剂的形式。
[0581]
在另一这样的实施方案中，一个或多个剂量单位可以施用于所述有需要的受试者。
[0582]
联合治疗
[0583]
使用根据本发明的pcsk9抑制剂进行的治疗可以与使用一种或多种额外药理学活性物质的治疗联合，所述药理学活性物质例如选自抗糖尿病剂、抗肥胖剂、食欲调节剂、抗高血压剂、用于治疗和/或预防由糖尿病导致或与糖尿病相关的并发症的药剂，以及用于治疗和/或预防由肥胖症导致或与肥胖症相关的并发症和病症的药剂。
[0584]
这类药理学活性物质的实例是：glp-1受体激动剂、胰岛素、dpp-iv(二肽基肽酶-iv)抑制剂、胰淀素(amylin)激动剂和瘦蛋白受体激动剂。这类活性物质的具体实例为glp-1受体激动剂利拉鲁肽(liraglutide)和司美格鲁肽(semaglutide)以及德谷胰岛素(insulin degludec)。
[0585]
如本文所述的发明进一步由下文所述的实施方案和该文件的权利要求书来限定，但不限于此。
[0586]
实施方案
[0587]
1.药物组合物，其包含
[0588]
a)pcsk9抑制剂，和
[0589]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐
[0590]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的至少60w/w％。
[0591]
2.药物组合物，其包含
[0592]
a)pcsk9抑制剂，和
[0593]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐
[0594]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％。
[0595]
3.药物组合物，其由以下成分组成
[0596]
a)pcsk9抑制剂，和
[0597]
b)辅料，其中所述辅料是
[0598]
i.n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，和
[0599]
ii.一种或多种其他辅料
[0600]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％。
[0601]
4.根据前述实施方案1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含至少一种润滑剂。
[0602]
5.药物组合物，其由以下成分组成：
[0603]
a)pcsk9抑制剂，
[0604]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，和
[0605]
c)至少一种润滑剂。
[0606]
6.根据前述实施方案4和5中任一项所述的药物组合物，其中所述润滑剂是硬脂酸镁。
[0607]
7.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含1-25mg，如1-10mg，如2-5mg，或如2-3mg硬脂酸镁/100mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。
[0608]
8.根据前述实施方案2-7中任一项所述的药物组合物，其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的至少60w/w％。
[0609]
9.根据前述实施方案1、5-8中任一项所述的药物组合物，其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少95w/w％。
[0610]
10.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐选自n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的钠盐、钾盐。
[0611]
11.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(snac)。
[0612]
12.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中剂量单位包含至多1000mg所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。
[0613]
13.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中剂量单位包含0.1-100mg所述pcsk9抑制剂，如1-100mg所述pcsk9抑制剂。
[0614]
14.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂具有至少与egf(a)301l相当的抑制功能。
[0615]
15.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂的表观结合亲和力(ki)等于或低于egf(a)301l的表观结合亲和力(ki)。
[0616]
16.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂具有至少与egf(a)301l,309r,312e相当的抑制功能。
[0617]
17.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂的表观结合亲和力(ki)等于或低于egf(a)301l,309r,312e的表观结合亲和力(ki)。
[0618]
18.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中低于2。
[0619]
19.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中低于2。
[0620]
20.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂的表观结合亲和力(ki)低于10nm，如低于8nm，如低于5mm。
[0621]
21.根据前述实施方案14-20中任一项所述的药物组合物，其中所述表观结合亲和力(ki)在如试验i所述的竞争性elisa中测量。
[0622]
22.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂在小型猪中的t1/2至少为24小时。
[0623]
23.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述pcsk9抑制剂在大鼠中的t1/2至少为2小时。
[0624]
24.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述pcsk9抑制剂的摩尔质量至多为50000g/mol。
[0625]
25.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂是egf(a)肽或egf(a)衍生物。
[0626]
26.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中根据实施方案24的egf(a)衍生物包含白蛋白结合取代基。
[0627]
27.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中根据实施方案24或25的egf(a)衍生物包含脂肪酸或脂肪二酸。
[0628]
28.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中根据实施方案24、25或26的egf(a)衍生物包含c16、c18或c20脂肪酸或者c16、c18或c20脂肪二酸。
[0629]
29.根据实施方案24-27中任一项所述的组合物，其中所述egf(a)肽或egf(a)衍生物包含与由seq id no 1定义的ldl-r的egf(a)结构域相比具有1-8个氨基酸置换的egf(a)肽类似物。
[0630]
30.根据权利要求28所述的组合物，其中所述egf(a)肽类似物包含301leu。
[0631]
31.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂选自：以下所示的egf(a)衍生物31、95、128、133、143、144、150、151、152和153
[0632]
[0633][0634][0635]
32.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂选自egf(a)衍生物150、151、152和153。
[0636]
33.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述pcsk9抑制剂是：
[0637][0638]
34.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含至少一种颗粒。
[0639]
35.根据前述实施方案34所述的药物组合物，其中所述至少一种颗粒包含n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。
[0640]
36.根据前述实施方案34-35中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种颗粒进一步包含润滑剂，如硬脂酸镁。
[0641]
37.根据前述实施方案34-36中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种颗粒进一步包含pcsk9抑制剂。
[0642]
38.根据前述实施方案34-37中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种颗粒通过干法制粒，例如通过辊压法制备。
[0643]
39.根据前述实施方案34-38中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含颗粒外部分。
[0644]
40.根据前述实施方案34-39中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的颗粒外部分包含润滑剂或助流剂如硬脂酸镁和/或pcsk9抑制剂。
[0645]
41.药物组合物，其包含
[0646]
a)0.1-100mg pcsk9抑制剂，和
[0647]
b)20-800mg，如25-700mg，如50-600mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0648]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％，并且其中所述pcsk9抑制剂是如wo2017/121850的实施例151所示的egf(a)衍生物。
[0649]
42.药物组合物，其包含
[0650]
a)1-100mg pcsk9抑制剂，和
[0651]
b)50-800mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0652]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％，并且其中所述pcsk9抑制剂是如wo2017/121850的实施例151所示的egf(a)衍生物。
[0653]
43.药物组合物，其包含
[0654]
a)1-100mg pcsk9抑制剂，和
[0655]
b)75-600mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0656]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％，并且其中所述pcsk9抑制剂是如wo2017/121850的实施例151所示的egf(a)衍生物。
[0657]
44.药物组合物，其包含
[0658]
a)1-100mg pcsk9抑制剂，和
[0659]
b)75-400mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0660]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％，并且其中所述pcsk9抑制剂是如wo2017/121850的实施例151所示的egf(a)衍生物。
[0661]
45.药物组合物，其包含
[0662]
a)1-100mg pcsk9抑制剂，和
[0663]
b)100-400mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0664]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％，并且其中所述pcsk9抑制剂是如wo2017/121850的实施例151所示的egf(a)衍生物。
[0665]
46.药物组合物，其包含
[0666]
a)1-100mg pcsk9抑制剂，和
[0667]
b)200-600mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0668]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％，并且其中所述pcsk9抑制剂是如wo2017/121850的实施例151所示的egf(a)衍生物。
[0669]
47.药物组合物，其包含
[0670]
a)5-100mg pcsk9抑制剂，和
[0671]
b)250-500mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0672]
其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐占所述组合物的辅料的至少90w/w％，如至少95w/w％，并且其中所述pcsk9抑制剂是如wo2017/121850的实施例151所示的egf(a)衍生物。
[0673]
48.根据实施方案41-47中任一项所述的药物组合物，其进一步包含1-26mg润滑剂，如硬脂酸镁。
[0674]
49.根据实施方案41-47中任一项所述的药物组合物，其进一步包含1-25mg，如1-10mg，如2-5mg，或如2-3mg硬脂酸镁/100mg n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。
[0675]
50.根据实施方案41-47中任一项所述的药物组合物，其中所述n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(snac)。
[0676]
51.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物用于口服给药。
[0677]
52.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是固体组合物。
[0678]
53.根据前述实施方案所述的药物组合物，其中所述组合物是固体组合物，如片剂、胶囊或囊剂。
[0679]
54.药物组合物，其包含
[0680]
a)pcsk9抑制剂，和
[0681]
b)n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，
[0682]
其中所述pcsk9抑制剂的释放在15分钟内达到80％，或者在30分钟内达到95％。
500g)的测定缓冲液中孵育1小时。然后将包被的测定板用200μl测定缓冲液洗涤4次，然后将100μl的测试化合物和生物素化pcsk9的混合物添加至该板并在室温下孵育2小时。将板用200μl测定缓冲液洗涤4次，然后在室温下与链霉亲和素-hrp(25ng/ml；vwr#14-30-00)孵育1小时。通过添加50μl的tmb-on(kem-en-tec)来检测该反应并在黑暗中孵育10分钟。然后通过向混合物中添加50μl 4m h3po4终止反应，其通过电子多路移液添加。然后在1小时内用spectramax在450和620nm处读板。620nm读数用于背景减除。使用graphpad prism，通过非线性回归log(抑制剂)与响应变量斜率(四个参数)计算ic50值，并使用以下公式将其转换为ki值：ki＝ic50/(1+(生物素-pcsk9)/(kd(生物素-pcsk9)))，其中生物素-pcsk9的kd为1.096727714μg/ml，且[生物素-pcsk9]＝0.5μg/ml。
[0708]
较高的ki值反映较低的对pcsk9的表观结合亲和力，反之亦然。高于500nm的值将表明观察到的结合不是特异性的。
[0709]
下面包括egf(a)肽及其衍生物的实例的ki值，表明具有包含301l和可选的309r、312e和321e之一个或多个的egf(a)肽的化合物的高亲和力非常相似，也包括具有连接至n末端或赖氨酸残基的一个或两个取代基的化合物。
[0710][0711]
egf(a)肽衍生物
[0712]
[0713][0714]
试验ii：崩解试验
[0715]
根据欧洲药典(ph eur 2.9.1)的标准崩解试验可以在适当的崩解设备，例如usp崩解设备中进行，以测量测试组合物在体外的崩解时间。
[0716]
试验iii：溶出试验
[0717]
可以进行根据欧洲药典(ph eur 2.9.3)的标准溶出试验，以测量pcsk9抑制剂和snac从测试组合物中的体外释放。
[0718]
溶出试验在适当的溶出设备，例如usp溶出设备2中进行。更具体地，使用50rpm的桨转速，根据美国药典35使用设备2。对于在ph6.8下的测试，在37
±
0.5℃的温度下使用0.05m磷酸盐缓冲液的500ml溶出介质。溶出介质的含量为0.1％35。以适当的时间间隔取出样品，并使用用于pcsk9抑制剂和snac双重检测的rp-uhplc方法确定样品含量。
[0719]
基于色谱图中pcsk9抑制剂和snac的峰面积分别相对于pcsk9抑制剂和snac参考物的峰面积计算样品含量。将pcsk9抑制剂和snac的释放量计算为测试组合物中标称或实际总含量的百分比。片剂中的总含量使用试验(iv)来确定。
[0720]
试验iv：pcsk9抑制剂和snac的量的分析
[0721]
对于测定分析，在提取pcsk9抑制剂和snac之前对测试组合物进行称重。将片剂溶解在相关量的含有20％乙腈的0.05m磷酸盐缓冲液(ph 7.4)中。使用两小时的提取时间。对样品进行离心，并将合适的体积转移至hplc小瓶。相关pcsk9抑制剂和snac的标准品使用与样品相同的稀释剂来制备。使用带有紫外线检测器的uhplc进行pcsk9抑制剂和snac含量的双重确定。基于色谱图中pcsk9抑制剂和snac的峰面积分别相对于pcsk9抑制剂和snac参考物的峰面积计算片剂含量。
[0722]
试验v：比格犬中的药代动力学研究
[0723]
在比格犬中进行了药代动力学(pk)研究，以确定在经口施用不同测试组合物后pcsk9抑制剂的暴露。
[0724]
对于药代动力学研究，使用在研究开始时为1至6岁且重约10-16kg的雄性比格犬。犬在围栏中分组圈养(12小时光照：12小时黑暗)，并单独且限制性地每日一次饲以成年狗
粮(royal canine,丹麦)。只要可能，允许每天进行运动和社交活动。使用这些犬进行重复的药代动力学研究，其中在连续给药之间具有适当的洗脱期。在开始第一次药代动力学研究之前给予适当的适应期。动物的所有处理、给药和血液采样都由受过训练且熟练的人员进行。在研究之前，在给药前整夜以及给药后0至4h将犬禁食。此外，在给药前1小时直到给药后4小时限制犬饮水，但在整个时间段的其他时间自由饮水。
[0725]
含有pcsk9抑制剂的片剂以下述方式施用：在施用片剂前10min，向犬皮下给予约3nmol/kg的seq id no:115。将pcsk9抑制剂片剂置于犬的口腔后部以防止咀嚼(一片/犬)。然后使嘴闭合，并通过注射器或强饲给予自来水，以促进片剂的吞咽。
[0726]
血液采样
[0727]
在预定的时间点采集血样，持续直到给药后10hr，以充分覆盖pcsk9抑制剂的完整的血浆浓度-时间吸收谱。
[0728]
对于每个血液采样时间点，在1.3ml edta涂覆的管中收集约1.2ml的全血，并将该管轻轻转动以使样品与edta混合。然后，将血样保持在冰上，直到离心(4min，4℃，4000rpm)以收集血浆。将血浆(200μl)用移液器移取至干冰上的micronic管中，并在-20℃下保存直到分析。
[0729]
视情况取得血液样品，例如在前2小时从前腿的头静脉中的venflon取得，随后对于其余的时间点，采用注射器从颈静脉取得(使前几滴从venflon中排出，以避免样品中有来自venflon的肝素盐水)。
[0730]
试验vi：生物分析试验
[0731]
通过以下试验来分析在犬中的口服和静脉内pk研究的pcsk9抑制剂血浆浓度：将血浆样品在通过蛋白质沉淀分解后与胍一起孵育，并通过涡流液相色谱质谱法(tf-lc-ms)进行分析。通过在空白犬血浆中掺加pcsk9抑制剂来制备校准品，通常在0.5至2000nm的范围内(lloq为2nm)。将校准品、血浆空白或研究样品与8m盐酸胍(gndhcl)以1:1混合至终浓度为4m gndhcl，并在37℃下孵育30分钟以解离非共价蛋白质相互作用。用2.5倍体积的冰冷甲醇沉淀1倍体积的校准品、血浆空白或研究样品，并在4℃下以6200rpm离心15分钟。上清液用水+1％甲酸以1:2的比例稀释，然后进行tf-lc-ms分析。在室温下使用cyclone turboflow柱(turboflow cyclone 0.5x 50mm，thermo fischer scientific)，以及在60℃下使用aeris peptide 3.6μm xb-c18分析柱(2.1x 50mm，phenomenex)。使用流动相a(由含有1％甲酸和5％甲醇/乙腈(50/50)的milli-q水组成)和流动相b(由含有1％甲酸和5％milli-q水的甲醇/乙腈(50/50)组成)进行梯度洗脱。qexactive plus质谱仪用作单离子监测模式(m/z 1185-1188)的检测器。线性校准曲线(权重1/x2)用于计算血浆样品中的浓度。包括质量控制样品。校准品和质量控制样品中的标称浓度和计算浓度之间的偏差低于15％。
[0732]
通用方法
[0733]
方法1：干法制粒
[0734]
干法制粒在gerteis micro-pactor或mini-pactor上通过辊压进行。将辊速设置为1或3rpm，将辊压缩力设置为6kn/cm，间隙为1mm。在干法制粒之后，使用0.63mm或0.8mm的筛子将模制品粉碎成颗粒。
[0735]
在干法制粒之前，将snac和硬脂酸镁以及可选的egf(a)衍生物和/或mcc的部分在
合适的掺和器如pharmatech v-壳掺和器或turbula混合器中掺混。
[0736]
方法2：压片
[0737]
在模拟fette 102i的kilian style one上或安装有一组冲头的fette102i上生产片剂，产生7mm圆形或7.2
×
12mm或7.5
×
13mm或7.5
×
14mm或8.4
×
15.5mm椭圆形片剂，没有刻痕。根据片剂的总重量选择冲头尺寸。将压片机速度设置为20rpm。调节填充体积以获得目标重量为107.6mg至634mg的片剂。施加约4.5至14kn的压缩力，以获得与片剂大小相应的抗碎强度为50-130n的片剂。
[0738]
在压片之前，将通过方法1获得的颗粒任选地与pcsk9抑制剂和任何其他辅料在turbula混合器上掺混(7min，25rpm)。
[0739]
方法3：盐交换
[0740]
将喷雾干燥的egf(a)衍生物材料批次溶解在中性ph的100mm tris缓冲液中至终浓度为10-20g/l。随后将该材料加载到c18反相柱上，每升树脂最多20g egf(a)，并按以下顺序洗涤：a)用1倍柱体积的包含5％w/w乙醇水溶液的溶液，随后b)10倍柱体积的含有20mm磷酸钠和500mm氯化钠的溶液(ph 7.5)，和c)10倍柱体积的包含5％w/w乙醇的溶液。然后通过使用50％w/w乙醇溶液从柱中洗脱egf(a)。随后通过施加真空蒸发乙醇。随后将溶液喷雾干燥，得到作为钠盐的egf(a)衍生物。
实施例
[0741]
实施例1-组合物的制备
[0742]
根据以下表1制备测试组合物，其包含基于肽的pcsk9抑制剂。所用化合物是ldlr293-332的肽类似物，其包含经由亲水连接体分子连接的脂肪二酸形式的两个取代基。egf(a)衍生物如wo 2017/121850(实施例151/第161页)和wo19016300所述制备。该化合物在本文中被称为化合物151，并且具有以下结构：
[0743][0744]
该组合物通过使用上文所述方法的组合来制备。如wo 2013/139694所述，通过将snac、硬脂酸镁和mcc的掺合物粒化来产生测试组合物1。随后将颗粒与聚维酮、pcsk9抑制剂，并进一步与mcc和硬脂酸镁掺混，之后压片(方法2)。测试组合物2至4通过将snac与硬脂酸镁掺混，之后进行干法制粒来制备(方法1)。所得颗粒随后与pcsk9抑制剂掺混，之后压片(方法2)。测试组合物4进一步包含10mg与本研究无关的glp-1参考分子。所述组合物在表1.1中描述。对于测试组合物1，括号中的数字提供了在snac颗粒中包含的硬脂酸镁和微晶纤维素的量。
[0745]
表1.1 pcsk9抑制剂片剂的组合物
[0746]
[0747][0748]
如以下表1.2所示，用逐渐增加量的pcsk9抑制剂制备另外的组合物。使用通过本文方法3获得的egf(a)衍生物制品，通过掺混化合物151、snac和硬脂酸镁，之后进行干法制粒(方法1)来制备测试组合物5-7。将所得颗粒压制成片剂(方法2)。
[0749]
表1.2 pcsk9抑制剂片剂的组合物
[0750]
组合物测试5测试6测试7snac(mg)300300500硬脂酸镁(mg)7.77.712.8化合物151(mg)50100100
[0751]
实施例2-崩解试验
[0752]
本研究的目的是评价实施例1中描述的一系列测试组合物的崩解。
[0753]
采用自动检测，根据欧洲药典，使用pharmatech ptz自动崩解测试仪，按照试验ii测量崩解。测试组合物1-6在水r中进行测试，并且在展开自动检测时被认为是崩解的。结果被报告为单个值或3片的平均值。表2.1显示了根据以上实施例1制备的测试组合物的结果。
[0754]
表2.1.崩解时间
[0755]
组合物测试1测试2测试3测试5测试6崩解时间15min 18s4min 18s7min 23s7min 00s7min 38s
[0756]
获得的结果表明，测试组合物2、3、4和5显示出比测试组合物1所观察到的显著更快的崩解。
[0757]
实施例3-溶出试验
[0758]
本研究的目的是评价实施例1中描述的一系列测试组合物的溶出。
[0759]
根据试验iii测量溶出，并根据试验iv测量pcsk9抑制剂和snac的量。pcsk9抑制剂和snac的释放量被计算为测试组合物中实际或标称含量的百分比，即100或300或500mg/片的snac和5或50或100mg/片的pcsk9抑制剂。
[0760]
pcsk9抑制剂的释放量被报告为单个值或3片的平均值。
[0761]
表3.1显示了根据以上实施例1制备的测试组合物1、2和3的结果，其中释放被表示为“溶液中的pcsk9抑制剂(％)”，其描述相对于实验开始时片剂中pcsk9抑制剂的总量，在15、30和60min后溶液中pcsk9抑制剂的量。根据试验iv测定片剂中pcsk9抑制剂和snac的总含量。
[0762]
表3.1溶液中的pcsk9抑制剂(％)
[0763][0764]
所获得的结果表明，与测试组合物1的观察结果相比，测试组合物2和3表现出更快的pcsk9抑制剂释放。在早期时间点，即15和30分钟时，观察到明显更快的pcsk9抑制剂释放。60分钟后释放差异不太显著。测试组合物中snac的量不影响15min后pcsk9抑制剂的释放，即，在15min后或以后测量时，包含100mg snac的测试组合物的溶出与包含300mg snac的测试组合物一样快。
[0765]
图1a显示了测试组合物1至3在5、10、15、20、30、45和60min后获得的进一步数据，表明测试组合物2和3在每个时间点都优于测试组合物1。
[0766]
如上所述，测试了测试组合物5-7的溶出，结果在表3.2中提供，并且与测试组合物1一起包括在图1b中。
[0767]
表3.2溶液中的pcsk9抑制剂(％)
[0768][0769]
所获得的结果表明，与测试组合物1的观察结果相比，测试组合物5-7还表现出更快的pcsk9抑制剂释放。
[0770]
实施例4
–
犬中的药代动力学(pk)研究
[0771]
以上实施例1中描述的测试组合物口服给药的药代动力学根据试验v进行评价，以评价在比格犬中的口服暴露，其中使用10ml水对狗进行给药。对每种制剂进行的测试次数以n表示。
[0772]
分析与结果
[0773]
通过lcms分析pcsk9i分子的血浆浓度。通过winnonlin v.5.0或phoenix v.6.2或6.3(pharsight inc.，mountain view，ca，usa)或用于pk分析的其他相关软件中的非房室模型分析单独的血浆浓度-时间谱。确定在t＝30min时测得的化合物暴露，并通过剂量/kg体重进行归一化。
[0774]
口服给药后(通过pharsight程序)计算最初30分钟血浆浓度-时间曲线下面积(auc，[时间x浓度])，并通过((剂量/kg体重))进行归一化，以获得剂量校正的暴露。
[0775]
计算了在施用测试组合物1、4、6和7后获得的血浆暴露、剂量校正的pcsk9i暴露和
cmax。数据包括在以下表4中，所有值均以几何平均值表示。
[0776]
表4-单次施用测试组合物1、4、6和7后在犬中测得的平均暴露。
[0777][0778]
与测试组合物1相比，根据本发明的组合物观察到增加的和加速的暴露。
[0779]
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。