用于治疗疾病的细菌组合物
背景技术：
1.艰难梭菌(clostridium difficile，最近称为clostridioides difficile或c.difficile)是革兰氏阳性棒状、周毛鞭毛、产毒、产孢子细菌，其可引起胃肠道疾病，症状从轻度腹泻至重度危及生命的结肠炎(1)。它的孢子具有坚固耐久性结构，能够使该种属跨时间和空间并且在人与人之间有效传播。这些孢子具有抗氧性，并且不会被许多医疗保健消毒剂杀死，这表示需要严格清洁才能有效净化医院和家庭环境(2)。
2.因此，艰难梭菌是突出的细菌病原体，其被描述为“直接的公共健康威胁”，美国疾病控制中心在最近关于美国抗生素耐药性威胁的报告中要求对其
“……
采取紧急和积极措施”(3)。住院个体，尤其是免疫功能低下或服用抗生素的患者，以及老年人特别易患可能复发的艰难梭菌疾病(1)。
3.在美国，基于2011年期间在10个地理上不同的地点进行的监测，艰难梭菌疾病的国家负担估计为约50万例感染，仅在那一年就导致～29,000例死亡(4)。美国疾病控制和预防中心在2013年发表的另一份报告表明，艰难梭菌疾病每年导致250,000例需要住院的感染和14,000例死亡(3)。在欧洲，2016年，20个不同国家报告了超过7000例艰难梭菌病例，并且与美国相似，这些感染中的大多数与医疗保健相关(5)。治疗艰难梭菌疾病的成本很高。与医疗保健相关的艰难梭菌疾病的平均复发率为～20％，并且治疗复发性疾病的成本通常推高护理成本(4)。因此，迫切寻求预防复发性疾病的干预措施，以减轻艰难梭菌感染(cdi)的经济负担。
4.传统上，抗生素和补液是建议的cdi一线治疗方法，万古霉素、甲硝唑和非达霉素是常用于杀死病原体的抗生素(6)。抗生素耐药性艰难梭菌菌株的出现以及抗生素治疗支持cdi的趋势意味着迫切需要寻找抗生素的替代品(3)。
5.粪便微生物群(microbiota)移植(fmt)是用于复发性艰难梭菌疾病的非常有效治疗，基于随机对照试验的高质量证据，强烈建议用于治疗轻度至重度复发性cdi(7)。fmt被认为通过恢复肠道微生物群系(microbiome)失调的患者的多样性肠道微生物群系从而对定植抗性而起作用。作为治疗选择，fmt的主要获益包括其巨大且持久的有效性、出色的短期安全性和高水平的患者术后满意度(7)。然而，fmt的确切作用机制尚不完全清楚，并且极少的长期安全数据是可用的。
6.此外，就其本质而言，原材料的成分不标准化并且无法大规模生产。此外，粪便仅针对“已知”进行筛查，而不考虑任何非典型或潜伏病原体。供体筛查、粪便处理(7)和向患者递送fmt也因诊所而异，甚至在无人监督的情况下由非专业人士在家中进行(9)。
7.随着fmt从非正统的最后手段转变为著名的主流治疗选择，不可避免地出现了寻求将基于微生物群系的疗法商业化的组织和公司。目前存在粪便库以向医疗专业人员提供fmt材料，而针对cdi和其他适应症的基于全粪便的疗法正在作为药物开发(10)。事实上，即使是宽泛定义的粪便成分(例如耐乙醇细菌孢子)的治疗潜力也已成功用于治疗复发性cdi(11)。尽管这些基于粪便的疗法由具有药物开发思维的公司和组织创造，但与fmt相关的许多缺点也适用于这些产品。
8.这些未定义的基于原始粪便的疗法的逻辑进展是定义的、合理选择的纯化且良好表征的微生物的菌株或联合体(consortia)，其可用于成功治疗疾病。这些“活生物治疗产品”(lbp)是除疫苗之外的生物产品，其中含有旨在预防、治疗或治愈累及人类的疾病的活生物体(12)。虽然目前尚无lpb上市，但存在证明对感染性疾病适应症(包括艰难梭菌)有效的实例(13)。
9.联合体方法的优势主要适用于产品标准化、安全性和生产方面。与受成分和质量变化影响的fmt不同，包含治疗联合体的菌株可以可靠地复制以满足可以进行分析评估的预定义质量标准。这些治疗菌株必须在分类学上明确定义，这意味着期望最终产品中将不出现任何替代或污染类群是现实的。此外，所选择的菌株在生物学上也将进行良好表征，使得任何潜在的致病性或遗传不稳定性均已知。理解菌株代谢和行为能够开发用于大规模生产目标菌株的可重复方法，从而促进lbp的生产。了解治疗菌株的基因型和表型是产品安全性和批次检测的基础。还可以合理地假设患者更容易接受以片剂或胶囊形式口服递送的lbp，因为与fmt相比，这种递送模式对他们的生活方式的侵入性和破坏性更小。
10.因此，需要提供用于艰难梭菌感染的有效治疗，并且本发明旨在解决该需要。
技术实现要素：
11.本发明人已经鉴定了包含可用于治疗艰难梭菌感染的分离的细菌的组合物。因此，本发明涉及治疗性细菌组合物，其各自包含已定义的细菌分离物的联合体，该组合物可用于治疗疾病，特别是用于治疗和预防艰难梭菌感染。本发明还涉及治疗和预防疾病的相关方法，特别是治疗和预防艰难梭菌感染的方法。
12.在一个方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含两种或更多种分离的细菌，该分离的细菌选自以下种属：纤维素类拟杆菌(bacteroides cellulosilyticus)、布劳特氏菌属(blautia sp.)、灵巧粪球菌(coprococcus catus)、伴生粪球菌(coprococcus comes)、多尔氏菌属(dorea sp.)、韦荣球菌ucg-003属(erysipelotrichaceae ucg-003 sp.)、内脏臭气杆菌(odoribacter splanchnicus)、狄氏副拟杆菌(parabacteroides distasonis)、瘤胃梭菌9属(ruminiclostridium 9 sp.)、扭链瘤胃球菌(ruminococcus torques)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、布劳特氏菌属、布劳特氏菌属、毛螺菌科fcs020群属(lachnospiraceae fcs020 group sp.)、毛梭菌属(lachnoclostridium sp.)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)和拟杆菌属(bacteroides sp.)。该组合物可以包含选自该列表的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17种分离的细菌或由其组成。在一个实施方案中，两种或更多种分离的细菌包含与选自seq id no：1至21的核酸序列具有至少95％序列同一性，例如97％、98％、98.7％或99％序列同一性的16s rdna序列。在一个实施方案中，细菌是冻干的。
13.本发明还涉及包含两种或更多种分离的细菌的组合物，其中所述细菌选自具有seq id no.1、2或3的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.4的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.5的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.6的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.7的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.8的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.9的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有以下seq id no.10或11的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.12的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.13的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.14或15的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.16的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.17的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.18的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.19的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.20的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌，以及具有seq id no.21的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌。
14.本发明还提供了一种组合物，其包含一种；例如2至17种或更多种以本文提供的保藏号保藏的分离的菌株。
15.本发明还涉及一种用于治疗或预防受试者疾病的方法，该方法包括施用本文所述的组合物。
16.在另一方面，本发明涉及本文所述的组合物用于治疗疾病。
17.根据该方法和组合物，待治疗的疾病是病原体感染，例如艰难梭菌感染。
18.本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本文所述的细菌组合物。
附图说明
19.图1.存活图。如实施例2所述，在体内模型中检测了具有17种细菌分离物的组合物(组合物a)。还检测了fmt疗法和载体。
20.图2.存活图。如实施例2所述，在体内模型中检测了具有15种细菌分离物的组合物(组合物b)。还检测了载体。
21.图3.存活图。如实施例2所述，在体内模型中检测了具有10种细菌分离物的组合物(组合物c)。还检测了载体。
22.图4. 4a)与接受载体(安慰剂)处理的小鼠相比，接受17株细菌菌株的联合体(组合物a)处理的小鼠在艰难梭菌激发后两天的平均体重减轻，表示为艰难梭菌激发前的小鼠平均体重的百分比。4b)与接受载体(安慰剂)处理的小鼠相比，接受10种细菌菌株的联合体(组合物c)处理的小鼠在艰难梭菌激发后两天的平均体重减轻，表示为艰难梭菌激发前的小鼠平均体重的百分比。4c)与接受载体(安慰剂)处理的小鼠相比，接受4种细菌菌株的联合体(组合物d)处理的小鼠在艰难梭菌激发后两天的平均体重减轻，表示为艰难梭菌激发前的小鼠平均体重的百分比。
具体实施方式
23.现将进一步描述本发明。在以下段中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面均可以与任何其他方面或多个方面组合，除非明确指出相反。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。
24.通常，与本文描述的微生物学、细胞和组织培养、病理学、分子生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学及杂交结合使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。除非另有说明，否则本公开内容的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述。参见，例如，green和sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第4版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2012年)。
25.与本文所述的分析化学、微生物学、生物信息学以及药物和药物化学结合使用的命名法及实验室程序和技术是本领域熟知和常用的那些。
26.本发明涉及治疗性细菌组合物，其各自包含已定义的细菌分离物的联合体。该组合物可用于治疗疾病。因此，该组合物不是粪便微生物群移植物(fmt)并且不含有粪便材料，而是含有已定义的不含粪便材料的细菌分离物的混合物。fmt通常由来自健康人供体的粪便样品组成，其直接施用于接受者例如以灌肠剂的形式，在将fmt施用于接受者之前，不分离粪便样品中存在的细菌。因此，本发明组合物的优点在于它不包含fmt中存在的未定义的组分，从而实现治疗组合物标准化并提高组合物的安全性。
27.术语“分离的”是指从其自然环境分离的细菌。分离的细菌，例如分离的细菌菌株，基本上不含其他细胞物质、化学物质和/或粪便物质。
28.因此，如本文所用，术语“分离的”细菌是指已经与一种或多种非期望的组分(例如另一种细菌或细菌菌株，生长培养基的一种或多种组分，和/或样品(例如粪便样品)的一种或多种组分)相分离的细菌。在一些实施方案中，细菌基本上从来源分离，使得来源的其他组分未检出。如本文所用，术语“种属”是指通常由基因组序列和表型特征定义的分类实体。“菌株”是已根据常规微生物技术分离和纯化的种属的特定实例。
29.在一个实施方案中，组合物的细菌在施用前是无活性的。例如，细菌是冻干的。在一个实施方案中，组合物包括营养(vegetative)细菌细胞并且不包括细菌孢子。在一个实施方案中，组合物包括营养细菌细胞和/或细菌孢子。在一个实施方案中，组合物包括营养细菌细胞并且不包括细菌孢子或基本上没有孢子。在一个实施方案中，组合物包括少于约0.5％、1％、2％、3％、4％或5％的孢子。在一个实施方案中，组合物包括营养细菌细胞和/或细菌孢子。
30.组合物优选为活细菌治疗剂、细菌疗法或活生物治疗产品。如本文所述，活细菌产品(也称为细菌组合物、活细菌联合体或细菌联合体)包含来自如本文所述的一种或多种细菌种属的一种或多种细菌菌株。活细菌产品提供活细菌疗法(lbt)。术语活细菌疗法或lbt在本文中与细菌疗法可互换使用，并定义了使用活细菌来恢复健康或治愈疾病的疗法。
31.在一个实施方案中，组合物可以如上所述，但不包含任何其他种属(即表1a中未列出的种属)的细菌，或者组合物仅包含来自另一种属的微量或生物学不相关量的细菌。生物学不相关是指对艰难梭菌感染的治疗没有影响的细菌。
32.在一个实施方案中，分离的细菌，例如分离的细菌菌株，可以是当施用于受试者时能够在受试者的胃肠道中定植的活细菌。
33.第一方面，本发明涉及包含两种或更多种分离的细菌的组合物，其中所述细菌选自具有seq id no.1、2或3的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.4的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.5的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.6的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.7的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.8的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.9的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有以下seq id no.10或11的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.12的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.13的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.14或15的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的
16s rdna序列的细菌；具有seq id no.16的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.17的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.18的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.19的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌；具有seq id no.20的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌，以及具有seq id no.21的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列的细菌。
34.下表1a列出了17种不同的细菌种属。提供了已鉴定的最密切的细菌种属名称，并基于公共数据库中密切相关的种属还给出了可能的替代名称和/或密切相关的种属。本发明的组合物中存在的分离的细菌选自以下17种种属。提供了分类名称以及每个种属的示例性16s rdna序列。应当理解，seq id no：1-21可以包括全长或部分16s rdna序列。此外，如下文进一步解释，细菌可以具有与以下列出的seq id具有一定序列同一性的16s rdna序列。如下所示，针对第1、8和11行列出的种属，提供了不同的示例性序列。
35.表1a
36.[0037][0038]
表1b列出了表1a中细菌的示例性菌株。包含此类菌株的组合物在本发明的范围内。这些细菌根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约通过microbiotica limited保藏在leibniz-lnstitut dsmz-deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen gmbh(dsmz)，inhoffenstr.7b，38124 braunschweig。保藏号、保藏日期和保藏方参考号如下所示。
[0039][0040]
[0041]
在一个实施方案中，组合物包含17种分离的细菌或由其组成，例如来自表1a中列出的17种不同种属中的每一个的细菌，例如，参考表中所示的序列或与其具有同一性的序列，如下所述。在一个实施方案中，细菌由参考表1a中所示的序列进行定义。针对第1、8和11行中列出的种属，提供了不同的示例性序列。这些中的一种或多种可以被包括在组合物中。在一个实施方案中，细菌选自表1b中的菌株。
[0042]
对于技术人员显而易见的是，选自表1中列出的不同细菌可以组合在单一组合物中。例如，组合物包含至少2种，例如多至3种、多至4种、多至5种、多至6种、多至7种、多至8种、多至9种、多至10种、多至11种、多至12种、多至13种、多至14种、多至15种、多至16种或多至17种分离的细菌或由其组成，该分离的细菌选自表1a中所示的那些或1b中的菌株，例如参考表中所示的序列。
[0043]
在一个实施方案中，组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17种分离的细菌或或由组成，该分离的细菌选自表1a中列出的那些或1b中的菌株，例如参考表中所示的序列。
[0044]
在一个实施方案中，组合物包含4、5、7、10或15种分离的细菌或由其组成，该分离的细菌选自表1a中所示的那些或1b中的菌株，例如参考表中所示的序列。
[0045]
在一个实施方案中，组合物包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种或至少17种分离的细菌或由其组成，该分离的细菌选自表1a中列出的那些或1b中的菌株，例如参考如表中所示的序列。
[0046]
在一个实施方案中，组合物包含不超过4、7、10或15种分离的细菌，该分离的细菌选自表1a中所示的那些或1b中的菌株，例如参考表中所示的序列。
[0047]
在一个实施方案中，组合物包含2至4种、2至5种、2至6种、2至7种、2至8种、2至9种、2至10种、2至11种、2至12种、2至13种、2至14种、2至15种、2至16种、或2至17种分离的细菌或由其组成，该分离的细菌选自表1所示的那些例如参考表1a中所示的序列或1b中的菌株。
[0048]
在一个实施方案中，组合物包含由2至17种分离的细菌(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种分离的细菌)组成的分离的细菌混合物，该分离的细菌与选自seq id no 1至21的16s dna序列具有至少97％序列同一性。示例性组合物在本文中列出，但所有组合均在本发明的范围内。
[0049]
在一个实施方案中，组合物包含分离的细菌或由其组成，该分离的细菌选自以下种属：纤维素类拟杆菌(bacteroides cellulosilyticus)(例如seq id no 1、2或3)、狄氏副拟杆菌(parabacteroides distasonis)(例如seq id no 10或11)、脆弱拟杆菌(例如seq id no 1、2或3)和拟杆菌属(例如seq id no 14或15)。
[0050]
在一个实施方案中，组合物包含如组合物a、b、c或d所示的分离的细菌或由其组成(参见实施例)。
[0051]
技术人员将理解，选自表1a的细菌种属或1b中的菌株以及用于本发明的组合物和方法中可以具有表1a中所示的序列或1b中的菌株或与其具有一定百分比同一性的序列并保持生物活性；即当用于本文所述的组合物中时对艰难梭菌感染具有有效性。
[0052]
确定序列同一性的方法是本领域已知的。已知进化枝、操作分类单位(otu)、种属和菌株在一些实施方案中通过它们的16s rdna序列进行鉴定。相关性可以通过同一性百分
比来确定，并且这可以使用本领域已知的方法来确定。
[0053]
基于16s核酸序列(全长或其部分，例如v区)鉴定用于本文所述组合物中的细菌种属和菌株。16s核糖体rna基因编码细菌核糖体30s亚基的rna组分。它广泛存在于所有细菌种属中。不同细菌种属具有一个至多个拷贝的16s rrna基因。16s rrna基因测序是迄今靶向管家基因以研究细菌种系发生和属/种分类的最常用方法之一。因此，可以基于编码16s核酸序列的基因序列(例如细菌中的核糖体rna(rrna))对细菌进行分类。该基因序列也称为核糖体dna序列(rdna)。细菌16s rdna的长度为约1500个核苷酸。16s的v1-v9区是指16s rrna基因的前9个高变区，其通常用于细菌样品的基因分型。在一些实施方案中，v1至v9中的至少一个用于表征细菌分离物。
[0054]
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”通常是指在比对序列之后以及在一些实施方案中在引入空位(如有必要)以达到最大百分比同源性之后，序列中与与之比较的参考序列的残基相同的核酸残基的百分比，并且不考虑将任何保守置换作为序列同一性的一部分。因此，两个核酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。用于比对的方法和计算机程序是熟知的。可以使用熟知的数学算法确定两个序列之间的同一性百分比。提及两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比表示，在比对时，在比较两个序列中，核苷酸相同的百分比。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为100至500个或1000个或更多个核苷酸的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于如本文提供的16s rrna或16s rdna序列的长度上。
[0055]
在一个实施方案中，查询序列和参考序列之间的序列同一性程度可以借助可商购的序列比较程序来确定。这通常涉及使用默认评分矩阵和默认空位罚分，识别精确匹配的数量，并将精确匹配的数量除以参考序列的长度来比对两个序列。用于确定同一性的合适的计算机程序包括，例如，blast(blast.ncbi.nlm.nih.gov)。一种比对由smith-waterman同源搜索算法或needleman-wunsch算法确定。在又一个实施方案中，全局比对程序选自由emboss needle和emboss stretcher组成的组，并且通过识别由程序识别的精确匹配的数量除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是整个比对(包括序列的空位和突出部分)的长度。
[0056]
因此，用于本发明的组合物和方法的表1列出的细菌种属的全长或部分16s rdna与表1中列出的相应16s rdna(即seq id 1至21)具有至少90％序列同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述序列同一性为至少95％。在一个实施方案中，所述序列同一性为至少97％。在一个实施方案中，所述序列同一性为至少98.7％。
[0057]
一方面，因此，组合物包含两种或更多种细菌，该细菌包含选自seq id.no.1至21的16s rdna序列或包含与选自seq id no.1至21的核酸序列具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。在一个实施方案中，存在于组合物中的细菌与本文公开的细菌属于同一种属，与选自seq id no.1至21的核酸序列具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性，并保留抗艰难梭菌感染的活性。抗艰难梭菌感染的活性可以使用体外、离体或体内评估法进行评估，例如使用如实施例中所述的鼠模型。
[0058]
在一个实施方案中，组合物包含来自17种不同种属的细菌或由其组成，这些细菌具有选自seq id no.1至21的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。如上所述，对于一些种属，提供了超过一个序列。在一个实施方案中，选择seq id no.1或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。在一个实施方案中，选择seq id no.10或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。在一个实施方案中，选择seq id no.14或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。因此，组合物包含选自seq id no.1、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、18、19、20、21或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的序列的细菌，或由这些细菌组成。
[0059]
在一个实施方案中，组合物包含以下15种细菌(例如来自15种不同种属)或由其组成，该细菌具有以下seq id no.的16sdna：
[0060]
seq id no.1或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0061]
seq id no.4或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0062]
seq id no.5或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0063]
seq id no.6或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0064]
seq id no.7或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0065]
seq id no.8或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0066]
seq id no.9或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0067]
seq id no.10或与其序列具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna，
[0068]
seq id no.12或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0069]
seq id no.13或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0070]
seq id no.14或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0071]
seq id no.16或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0072]
seq id no.17或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0073]
seq id no.18或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，以及
[0074]
seq id no.19或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0075]
在一个实施方案中，seq id no.1可以替换为seq id no.2或3，或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列；seq id no.10可以替换为seq id no.11或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，以及seq id no.14可以替换为seq id no.15或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0076]
在另一个实施方案中，组合物包含以下10种细菌或由其组成，该细菌具有以下seq id no.的16sdna：
[0077]
seq id no.1或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0078]
seq id no.4或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0079]
seq id no.5或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0080]
seq id no.6或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0081]
seq id no.7或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0082]
seq id no.8或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0083]
seq id no.9或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0084]
seq id no.10或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0085]
seq id no.12或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，以及
[0086]
seq id no.13或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0087]
在一个实施方案中，seq id no.1可以替换为seq id no.2或3，或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列；seq id no.10可以替换为seq id no.11或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例
如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0088]
在另一个实施方案中，组合物包含以下7种细菌或由其组成，该细菌具有以下seq id no的16sdna：
[0089]
seq id no.1或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列
[0090]
seq id no.4或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0091]
seq id no.5或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0092]
seq id no.6或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0093]
seq id no.7或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0094]
seq id no.8或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，以及
[0095]
seq id no.9或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0096]
在一个实施方案中，seq id no.1可以替换为seq id no.2或3，或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0097]
在另一个实施方案中，组合物包含以下5种细菌或由其组成，该细菌具有以下seq id no的16sdna：
[0098]
seq id no.1或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0099]
seq id no.4或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0100]
seq id no.5或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0101]
seq id no.6或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，以及
[0102]
seq id no.7或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0103]
在一个实施方案中，seq id no.1可以替换为seq id no.2或3，或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0104]
在另一个实施方案中，组合物包含以下4种细菌或由其组成，该细菌具有以下seq id no.的16sdna：
[0105]
seq id no.3或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0106]
seq id no.11或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，
[0107]
seq id no.15或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，以及
[0108]
seq id no.21或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0109]
在一个实施方案中，seq id no.3可以替换为seq id no.1或2，或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列；seq id no.11可以替换为seq id no.10，或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列，以及seq id no.15可以替换为seq id no.14，或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0110]
在一个实施方案中，组合物选自表2、3或4中所示的组合物b、c或d，例如具有如这些组合物所示的种属或序列的细菌。在一个实施方案中，组合物选自表2、3或4中所示的组合物b、c或d，其中该组合物的细菌具有各表中提供的seq id no的16sdna或与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；例如97％或98.7％同一性的16s rdna序列。
[0111]
在一个实例中，组合物中使用的种属基于它们的16s rdna序列(例如，全长序列或部分序列)进行鉴定。在一些情况下，可用于本发明的细菌种属的菌株，例如本文公开的种属的菌株，可以从公共生物资源中心(例如atcc(atcc.org)、dsmz(dsmz.de)或riken bioresource中心(en.brc.riken.jp))获得。用于鉴定种属或本发明其他方面的16s rdna序列可以从公共数据库(例如人类微生物群系计划(hmp)网站或genbank)获得。
[0112]
技术人员将理解本文所述的组合物可以包括任何菌株。技术人员将理解，组合物可以包括一种或多于一种的特定细菌种属的菌株，如表中所列。例如，具有核酸序列seq id no 1、2或3的16s rdna序列的细菌菌株均具有纤维素类拟杆菌作为相关的分类种属名称。具有核酸序列seq id no 10或11的16s rdna序列的细菌菌株均具有狄氏副拟杆菌作为相关的分类种属名称。具有核酸序列seq id no 14或15的16s rdna序列的细菌菌株均具有脆弱拟杆菌作为相关的分类种属名称。在一个实施方案中，菌株选自表1b中的菌株中的一种。
[0113]
在一个实施方案中，组合物包含本文列出的细菌种属并且不包括其他细菌种属。然而，组合物可以进一步包含药用赋形剂。在一个实施方案中，细菌组合物包含实施例中列出的细菌或由其组成。在一个实施方案中，细菌组合物包含实施例中列出的细菌菌株或由其组成。
[0114]
在一个实施方案中，组合物的细菌能够定植于受试者的胃肠道。在一个实施方案中，组合物的细菌能够持续植入受试者的胃肠道中。
[0115]
在一个实施方案中，组合物还具有一种或多种以下特征：
[0116]
●
该组合物可有效治疗和/或预防受试者或动物模型中的艰难梭菌感染；
[0117]
●
该组合物的细菌分离物替代艰难梭菌，从而治疗受试者的感染；
[0118]
●
细菌分离物减少艰难梭菌在受试者胃肠道中的定植，从而治疗感染；
[0119]
●
该组合物的细菌分离物比艰难梭菌更快地定植于受试者的胃肠道，因此防止病原体定植或重新定植于胃肠道；
[0120]
●
该组合物的细菌分离物赋予针对艰难梭菌的定植抗性，从而防止受试者的疾病复发；
[0121]
●
该组合物的细菌分离物中和艰难梭菌毒素，从而预防受试者的疾病表现；
[0122]
●
该组合物的细菌分离物降低艰难梭菌的免疫刺激作用，从而预防受试者的疾病表现；
[0123]
●
该组合物的细菌分离物降低艰难梭菌的孢子形成率和/或孢子脱落(shedding)，从而限制受试者的继续传播和感染；
[0124]
●
该组合物的细菌分离物防止艰难梭菌孢子萌发，从而预防受试者感染；
[0125]
●
该组合物的细菌分离物在体外和体内模型中减少艰难梭菌生长和/或艰难梭菌存活；
[0126]
●
该组合物的细菌分离物提高艰难梭菌激发小鼠的存活率(如实施例中所示)和/或
[0127]
●
该组合物的细菌分离物提供对用艰难梭菌激发的艰难梭菌感染相关的体重减轻小鼠的增强保护(如实施例中所示)。
[0128]
以上列出的特征可以使用技术人员已知的方法进行评估。示例性测定在实施例中显示。在一个实施方案中，该组合物在治疗和/或预防艰难梭菌感染、减少艰难梭菌生长和/或存活方面有效，并且该测定是体内艰难梭菌感染的存活模型或艰难梭菌感染的存活模型的体重减轻。存活模型可以如warn等人(14)所述。
[0129]
因此，可以在合适的动物模型(例如，如实施例中所示的小鼠模型)中评估艰难梭菌感染并通过研究存活率和/或体重减轻进行评估。
[0130]
组合物中使用的细菌分离物通常分离自一名或多名健康受试者。
[0131]
在一些实施方案中，一种或多种细菌菌株是人源细菌，意味着一种或多种细菌菌株从人或其样品(例如，人供体)获得或鉴定。在本文提供的组合物的一些实施方案中，所有细菌菌株均是人源细菌。在本文提供的组合物的一些实施方案中，细菌菌株源自多于一个人供体。
[0132]
本文提供的活细菌产品中使用的细菌菌株通常分离自健康个体的微生物群系，但在一些情况下可能不是来自健康个体。在一些实施方案中，活细菌产品包括源自单个个体的菌株。在一些实施方案中，活细菌产品包括源自多个个体的菌株。在一些实施方案中，细菌菌株获自多个个体，单独分离和生长。随后可以组合单独生长的细菌组合物以提供本公开内容的组合物。应当理解，本文提供的活细菌产品的细菌菌株的来源不限于来自健康个体的人微生物群系。
[0133]
细菌分离物可以如wo2013/171515中所述进行检测。在一个实施方案中，细菌菌株被单独培养和生长，然后组合在组合物中。
[0134]
组合物中使用的细菌分离物优选是非致病菌株。换言之，当将细菌施用于健康人个体时，该细菌优选在所述个体中不引起疾病。
[0135]
在一个实施方案中，组合物中存在的每种细菌对一种或多种抗生素的治疗敏感。换言之，该细菌对至少一种抗生素的治疗没有抗性。这允许在向个体施用的治疗组合物中
包括的一种或多种细菌导致个体疾病的情况下对个体进行抗生素治疗，这与预期相反。因此，在一个实施方案中，细菌对一种或多种选自由以下项组成的组的抗生素治疗敏感：β-内酰胺、夫西地酸、厄法霉素(elfamycin)、氨基糖苷、磷霉素、衣霉素、甲硝唑和/或万古霉素。用于筛选细菌的抗生素抗性的体外和计算机方法是本领域已知的。
[0136]
在一个实施方案中，组合物中包括的分离的细菌可以不包含编码一种或多种毒力因子的一种或多种基因和/或优选不产生一种或多种毒力因子。在这种情况下，毒力因子是增强细菌在个体中引起疾病的潜力的特性。毒力因子包括细菌毒素(例如细菌的内毒素和外毒素)的产生，以及可能导致细菌致病性的水解酶的产生。筛选细菌中编码毒力因子的基因的方法是本领域已知的。
[0137]
本发明的各个方面，即组合物、方法、试剂盒和用途，还涵盖根据国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约保藏在dsmz的一种或多种菌株。具体地，一方面，本发明的治疗组合物包含至少一种分离的细菌菌株，其中该细菌是根据国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约由microbiotica limited保藏在leibniz-lnstitut dsmz-deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen gmbh(dsmz)，inhoffenstr.7b，38124 braunschweig的细菌，保藏号如上表1b所列以及还如下所示。
[0138]
因此，本发明的治疗组合物可以包含至少一种分离的细菌，其中该细菌是根据布达佩斯条约保藏在dsmz并且分配以下保藏号之一的细菌(每种保藏的细菌在dsmz保藏的日期显示在保藏号后的括号中)：dsm 33265(2019年9月13日)、dsm 33263(2019年9月13日)、dsm 33261(2019年9月13日)、dsm 33266(2019年9月13日)、dsm 33277(2019年9月13日)、dsm 33278(2019年9月13日)、dsm 33267(2019年9月13日)，dsm 33268(2019年9月13日)，dsm 33269(2019年9月13日)、dsm 33270(2019年9月13日)、dsm 33264(2019年9月13日)、dsm 33271(2019年9月13日)、dsm 33279(2019年9月13日)、dsm 33272(2019年9月13日)、dsm 33262(2019年9月13日)、dsm 33282(2019年9月13日)、dsm 33283(2019年9月13日)、dsm 33280(2019年9月13日)、dsm 33281(2019年9月13日)、dsm 33273(2019年9月13日)、dsm 33274(2019年9月13日)。
[0139]
如上所述，组合物可以包含分离的菌株的组合，例如如上通过保藏号列出的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17种分离的菌株。
[0140]
对于技术人员显而易见的是，选自以上所列菌株的不同细菌菌株可以组合在单一组合物中。例如，该组合物包含至少2种，例如多至3种、多至4种、多至5种、多至6种、多至7种、多至8种、多至9种、多至10种、多至11种、多至12种、多至13种、多至14种、多至15种、多至16种、或多至17种选自表1中所示的那些(例如参考表中所示的序列)的分离的细菌，或由其组成。通常，每个种属包括一种细菌菌株，但每个种属也可能包括超过1种，例如2、3、4、5种。
[0141]
在一个实施方案中，组合物包含按以上保藏号列出的4、5、7、10或15种分离的细菌菌株，或由其组成。在一个实施方案中，组合物包含如组合物b、c和d所示的菌株或由其组成(参见实施例)。
[0142]
在一个实施方案中，组合物包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、或至少17种按以上保藏号列出的分离的菌株，或由其组成。
[0143]
在一个实施方案中，组合物包含不超过4、7、10或15种按以上保藏号列出的分离的菌株。
[0144]
在一个实施方案中，组合物包含2至4种、2至5种、2至6种、2至7种、2至8种、2至9种、2至10种、2至11种、2至12种、2至13种、2至14种、2至15种、2至16种、或2至17种按以上保藏号列出的菌株，或由其组成。
[0145]
在一个实施方案中，组合物包含分离的细菌菌株或由其组成，该分离的细菌菌株选自以下菌株：通过参考它们的保藏号dsm 33265、dsm 33263、dsm 33261、dsm 33270、dsm 33264、dsm 33272和/或dsm 33262。在一个实施方案中，组合物包含如实施例中所述的分离的细菌菌株或由其组成(参见组合物a、b、c或d)。
[0146]
然而，如上所述，本发明不限于特定菌株，而是涵盖由16s rdna定义的细菌。因此，本文公开的并且以公开的保藏号保藏的菌株的衍生物可以例如在遗传水平上进行修饰，而不消除生物活性。特别地，本发明的衍生菌株具有治疗活性。衍生菌株将具有与原始保藏菌株相当的活性。特别地，衍生菌株将对艰难梭菌疾病模型产生相当的作用，这可以通过使用实施例中描述的培养和施用方案来鉴定。保藏菌株的衍生物具有相同的生物型。生物型是密切相关的菌株，其具有相同或非常相似的生理和生化特征。在某些实施方案中，作为根据本文所列保藏号保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株是当通过扩增的核糖体dna限制性分析(ardra)进行分析时(例如在使用sau3ai限制酶分析时)提供与根据本文所列保藏号保藏的细菌相同模式的菌株。
[0147]
如本文所解释的，本发明的细菌组合物在施用于受试者时具有治疗效果并且可以用于治疗或预防艰难梭菌感染。特别地，本发明的细菌组合物在用于实施例中描述的艰难梭菌疾病模型时具有治疗效果。因此，本文所述的组合物是药物组合物。
[0148]
在一个实施方案中，组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、运载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。这样的材料应该是无毒的并且不应该干扰治疗组合物中存在的分离的细菌的有效性。药学上可接受的赋形剂或其他材料的确切性质将取决于施用途径，其可以经口服或直肠施用。用于制备治疗组合物的许多方法是本领域技术人员已知的。
[0149]
本发明的细菌组合物可以包含益生元(prebiotic)、药学上可接受的运载体、不溶性纤维、缓冲剂、渗透剂、消泡剂和/或防腐剂。组合物中包括的赋形剂的具体实例在下文公开。
[0150]
益生元可以为存在于细菌组合物中的分离的细菌提供营养，以助于它们在施用于个体后早期生长和定植。可以使用本领域已知的任何益生元。益生元的非限制性实例包括寡糖，例如，低聚果糖(例如果寡糖和菊粉)、低聚甘露聚糖和低聚半乳糖、可溶性富含低聚果糖的菊粉和可溶性纤维。不溶性纤维可以作为运载体包含在治疗组合物中，例如以在运输或储存期间提供保护。细菌组合物中可以包含缓冲剂以促进存在的分离细菌的活力。抗真菌剂可以作为防腐剂包含在细菌组合物中。
[0151]
在一个实施方案中，治疗性细菌组合物可以不包含除本文所述的细菌分离物之外的其他活性成分(包括不包含其他分离的细菌)，并且任选地包含益生元。因此，治疗组合物的活性成分可以由如本文所述的细菌分离物组和任选的益生元组成。
[0152]
本发明的细菌组合物可以以本文别处更详细描述的多种方式(包括以片剂、胶囊、
锭剂或液体的形式)施用于受试者。
[0153]
本发明的细菌组合物可以用于向受试者口服或直肠施用。当组合物用于口服施用时，组合物可以是胶囊或片剂的形式。当治疗组合物用于直肠施用时，治疗组合物可以是灌肠剂的形式。合适的胶囊、片剂和灌肠剂的制备是本领域熟知的。胶囊或片剂可以包含包衣以保护胶囊或片剂免受胃酸的影响。例如，胶囊或片剂可以是肠溶衣的、ph依赖性的、缓释的和/或耐胃的。此类胶囊和片剂用于例如使胶囊或片剂在胃中的溶解最小化但允许在小肠中溶解。当计划用于口服施用时，组合物可以是固体或液体形式，其中半固体、半液体、混悬液和凝胶形式作为固体或液体包括在本文考虑的形式内。
[0154]
作为用于口服施用的固体组合物，该组合物可以配制成粉末剂、颗粒剂、压制片剂、丸剂、胶囊、咀嚼剂、薄片等。这种固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂。此外，可以存在以下一项或多项：粘合剂(例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶)、赋形剂(例如淀粉、乳糖或糊精)、崩解剂(例如海藻酸、海藻酸钠、玉米淀粉等)；润滑剂(例如硬脂酸镁)、助流剂(例如胶态二氧化硅)、甜味剂(例如蔗糖或糖精)、调味剂(例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂)；和着色剂。当组合物为胶囊形式(例如明胶胶囊)时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有液体运载体，例如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。
[0155]
当计划用于口服施用时，组合物可以包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在用于注射施用的组合物中，还可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
[0156]
细菌组合物可以包括药学上可接受的运载体或载体可以是颗粒状的，使得组合物例如是片剂或粉末形式。术语“运载体”是指稀释剂、佐剂或赋形剂，组合物与它们一起施用。这样的药物运载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。运载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素等。此外，还可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，组合物和药学上可接受的运载体是无菌的。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体运载体，特别是用于注射液。合适的药物运载体还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，本发明的组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。
[0157]
组合物可以采取一种或多种剂量单位的形式。在一个实施方案中，剂量单位包含至少1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
或大于1
×
10
11
个菌落形成单位(cfu)的营养细菌细胞。在一个实施方案中，剂量单位包含药学上可接受的赋形剂、肠溶衣或其组合。细菌分离物或组合物可以以1-100g/天(例如5、10、15、20、30、40、50、60、70、80或90g/天)的剂量提供。
[0158]
可以应用处理或特定加工来提高组合物中细菌分离物的稳定性或活力。细菌组合物可以以干形式或湿形式施用。细菌组合物可以是冻干的。冻干的治疗组合物可以包含一种或多种稳定剂和/或冷冻保护剂。冻干的细菌组合物可以在施用于个体之前使用合适的稀释剂重构。
[0159]
在另一方面，提供了一种用于治疗或预防受试者疾病的方法，该方法包括施用本文所述的细菌组合物。在另一方面，提供了本文所述的细菌组合物用于治疗疾病。在另一方
面，提供了本文所述的细菌组合物在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途。
[0160]
在一个实施方案中，该疾病是肠道病原体感染。肠道感染的病原体可以是：艰难梭菌(c.difficile)、产生超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌科、第三代耐头孢菌素肠杆菌科、耐碳青霉烯类肠杆菌科、耐氟喹诺酮类肠杆菌科、沙门氏菌属(salmonella spp.)(包括伤寒沙门氏菌(s.typhi)、副伤寒沙门氏菌(s.paratyphi)、肠炎沙门氏菌(s.enteritidis))、大肠杆菌(escherichia coli)(包括侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、产志贺氏菌毒素大肠杆菌)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、弯曲杆菌属(campylobacter spp.)(包括空肠弯曲杆菌(campylobacter jejeuni)、大肠弯曲杆菌(c.coli)、红嘴鸥弯曲杆菌(c.lari)、胎儿弯曲杆菌(c.fetus))、志贺氏菌属(shigella spp.)(包括痢疾志贺氏菌(s.dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(s.flexneri)、鲍氏志贺氏菌(s.boydii)、宋内氏志贺氏菌(s.sonnei))、隐孢子虫属(cryptosporidium spp.)、微孢子虫属(microsporidium spp.)、溶组织内阿米巴(entamoeba histolytica)、蓝氏贾第鞭毛虫(giardia lamblia)、芽囊原虫属(blastocystis spp.)(包括人芽囊原虫(b.hominis))。
[0161]
在一个实施方案中，该疾病是艰难梭菌感染。
[0162]
如本文所用，“治疗(treat、treating或treatment)”是指抑制或缓解疾病或病症。例如，治疗可以包括延迟与疾病或病症相关的症状的发展，和/或降低将要或预期与所述疾病一起发展的此类症状的严重程度。这些术语包括改善现有症状、预防另外的症状以及改善或预防这些症状的根本原因。因此，这些术语表示对至少一些正在接受治疗的哺乳动物(例如人患者)产生有益结果。许多药物治疗对接受治疗的一些患者有效，但并非对所有患者有效。
[0163]
术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅举例来说，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，例如非人灵长类动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物、犬科动物、羊或猫科动物。
[0164]
根据本发明的细菌组合物可以单独施用或与其他治疗联合施用，同时或序贯或作为与另一种或多种治疗剂的联合制剂施用。
[0165]
施用可以是以“治疗有效量”，这足以显示个体获益。这种获益可以是至少改善至少一种症状。因此，特定疾病的“治疗”是指至少一种症状的改善。实际施用量、施用的速率和时程将取决于所治疗的性质和严重程度、所治疗的特定患者、个体患者的临床状况、组合物的递送部位、治疗组合物的类型、施用方法、施用的时间安排和医生已知的其他因素。治疗处方，例如剂量等的决定，是全科医生和其他医生的责任，并且可能取决于症状的严重程度和/或所治疗的疾病的进展。本发明的治疗组合物的治疗有效量或合适剂量可以通过在动物模型中比较其体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他试验动物的有效剂量外推至人的方法是已知的。精确剂量将取决于许多因素，包括治疗组合物是用于预防还是用于治疗。
[0166]
在一个实施方案中，受试者在接受本文所述的组合物治疗之前未进行抗生素治疗。在另一个实施方案中，受试者在接受本文所述的组合物治疗之前已经进行抗生素治疗。
[0167]
本文所述的方法和组合物可用于治疗艰难梭菌感染或预防艰难梭菌感染。例如，该方法可以降低对艰难梭菌感染的易感性。在一个实施方案中，艰难梭菌感染是首次出现的艰难梭菌感染。在一个实施方案中，艰难梭菌感染是复发性艰难梭菌感染。
[0168]
在另一方面，本发明涉及一种用于增加受试者胃肠道微生物群多样性的方法，该方法包括施用本文所述的组合物。
[0169]
在另一方面，本发明涉及一种改变受试者胃肠道微生物群的方法，该方法包括施用本文所述的组合物。
[0170]
在需要施用组合物的方法的一个实施方案中，该方法包括在施用后检测已在受试者中施用的一种或多种细菌菌株的存在的进一步步骤。检测方法包括例如在所述受试者中检测至少一种施用的细菌分离物的如本文定义的16s核酸序列。
[0171]
本发明的组合物可以通过以下方法制备，该方法包括在一种或多种合适的培养基中培养组合物中存在的两种或更多种分离的细菌。适用于培养将在本发明的治疗组合物中包含的细菌的培养基和条件在本文别处详细描述。例如，制备根据本发明的治疗组合物的方法可以包括以下步骤：
[0172]
(i)培养如本文所述的第一分离的细菌；
[0173]
(ii)培养第二和任选地另一分离的细菌；和
[0174]
(iii)将(i)和(ii)中获得的细菌混合以制备治疗组合物。
[0175]
可以在单独的步骤中培养组合物中待包含的分离的细菌。换言之，优选制备在治疗组合物中待包含的每种细菌的单独培养物。这允许评价每种细菌的生长并且根据需要控制药物组合物中包含的每种细菌的量。在步骤(i)和(ii)中培养的细菌优选具有不同的16s核酸序列，即具有小于99％、98％、97％、96％或95％序列同一性的16s核酸序列。
[0176]
上述方法可以包括培养在组合物中待包含的每种分离的细菌的步骤。
[0177]
该方法可以任选地包括一个或多个进一步的步骤，其中将细菌与一种或多种另外的成分(例如药学上可接受的赋形剂、益生元、运载体、不溶性纤维、缓冲剂、渗透剂、消泡剂和/或防腐剂)混合。此外，或可选地，该方法可以包括将在(i)和任选地(ii)中获得的细菌悬浮在恒化器培养基或盐水(例如0.9％盐水)中。(i)和任选地(ii)中获得的细菌可以在还原气氛(例如n2、co2、h2或它们的混合物，例如n2∶co2∶h2)下提供。为了保护存在于治疗组合物中的细菌，气体可以以适当的比例存在。例如，还原气氛可以包括80％n2、10％co2和10％h2。此外，或可选地，该方法可以包括冻干在(i)和任选地(ii)中获得的细菌的步骤，任选地在存在稳定剂和/或冷冻保护剂的情况下。该方法还可以包括制备包含在(i)和任选地(ii)中获得的细菌的胶囊、片剂或灌肠剂的步骤。胶囊或片剂可以是肠溶衣的、ph依赖性的、缓释的和/或耐胃的。
[0178]
本发明的组合物还可以以食品补充剂的形式提供以促进健康和平衡的微生物群系，例如作为饮料或其他食品。
[0179]
在进一步的方面，本发明涉及一种试剂盒。该试剂盒包括本文所述的组合物。在实例中，试剂盒可以包括在不损害样品的情况下运送收集的材料的材料(例如，以冻干形式包装，或包装在水性介质中等)。该试剂盒可以包括在无菌容器中的经处理的材料或治疗，例如鼻饲(ng)管、小瓶(例如，用于保留灌肠剂)、胃抗性胶囊(例如，生物抗酸以到达肠道，具有无菌外部)等。该试剂盒还可以包括使用说明。
[0180]
在另一方面，本发明涉及一种或多种选自表1的细菌在鉴定fmt疗法供体的方法中的用途。
[0181]
在另一方面，本发明涉及用于在施用于受试者之前处理粪便移植物的方法，该方
法包括用一种或多种选自表1a或b的分离的细菌补充粪便移植物。
[0182]
鉴于本公开内容包括以下实验示例，本发明的其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。
[0183]
除非本文另有定义，否则与本公开内容相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。尽管前述公开内容提供了对本发明涵盖的主题的一般描述，包括制造和使用本发明的方法及其最佳方式，提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实践本发明并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，其范围应由本公开内容所附的权利要求及其等同物来理解。鉴于本公开内容，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。
[0184]
本说明书中提及的所有文件均通过引用以其全文并入本文，包括对基因保藏号的任何引用和对专利出版物的引用。
[0185]
本文所用的“和/或”将被视为两个特定特征或组件中的具有或不具有其他的每一个的具体公开。例如，“a和/或b”将被视为(i)a、(ii)b以及(iii)a和b中的每一个的具体公开，如同每一个在本文中单独列出。除非上下文另有说明，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
[0186]“基本上”一词不排除“完全”，例如“基本上不含”y的组合物可以完全不含y。
[0187]
在非限制性实例中进一步描述本发明。
[0188]
实施例
[0189]
实施例1细菌分离物的鉴定和分离
[0190]
进行了一项实验，以筛选健康人供体的肠道微生物群在无菌小鼠中预防艰难梭菌感染的能力。使用用从健康供体粪便制备的粪便浆体接种的c57bl/6无菌小鼠进行实验。通过灌胃向小鼠施用艰难梭菌m7404(血清型o27)。为了生成具有人源化微生物群的小鼠，使用人粪便(相当于每只小鼠20mg粪便)的fmt每周进行一次，连续三周，随后是“安置(settling in)”期。在引入艰难梭菌后，在第1天至第28天之间经常采集粪便样品，用于基于培养的艰难梭菌负荷计数和通过鸟枪法宏基因组学评价微生物群组成。在计划的任何干预措施(例如灌胃)之前采集粪便样品。
[0191]
如果在直到第21天(包括第21天)的每个时间点，没有证据表明单个鼠笼中的任何小鼠有艰难梭菌脱落的证据，则认为微生物群对艰难梭菌疾病具有保护作用。通过在ccey琼脂上选择性铺板粪便匀浆，然后在37℃下厌氧孵育，计算每只小鼠承受的艰难梭菌负荷。
[0192]
根据供体，出现几种艰难梭菌脱落表型。一个供体完全防止艰难梭菌脱落直至第21天。该队列用于进一步分析以鉴定具有治疗获益的细菌。
[0193]
假设在接种艰难梭菌孢子之前的第0天，每个鼠笼中小鼠的微生物群分布可预测对艰难梭菌脱落的保护作用。研究了供体中细菌之间的差异。因此，对在d0时采集的所有粪便样品进行鸟枪法宏基因组学。使用机器学习方法分析宏基因组数据。这种方法整合了微生物群系数据和小鼠的艰难梭菌脱落表型，以鉴定可能有助于保护性表型的细菌列表。
[0194]
这产生15种可能赋予保护性作用的不同细菌菌株的列表。
[0195]
产生来自一个人供体的共生细菌的培养物集合，以提供可以从中建立细菌疗法联合体的资源。从单个健康人供体获得候选治疗细菌的主要优点是这些细菌天然地一起出
现，因此很可能彼此相容。此外，它们均源自已知对艰难梭菌运送(carriage)具有保护作用的微生物群，为它们的治疗功能提供了基础。
[0196]
基于它们的16s rrna基因与通过上述机器学习方法鉴定为具有治疗效果的分离株的16srrna基因相匹配，选择将菌株包含在细菌疗法混合物中。
[0197]
两种菌株(长双歧杆菌和拟杆菌属)也从其微生物群完全防止艰难梭菌脱落直至第21天的供体中回收，它们作为主要定植菌另外包含在治疗组合物中。包含它们的理由是通过可能是肠道二级和三级定植菌的候选治疗分离株来改善定植。随后在体内测定中检测了17种分离的细菌和亚群的联合体。
[0198]
实施例2体内测定
[0199]
1)在艰难梭菌感染的存活模型中体内测试17种细菌分离物和17种细菌分离物亚群的组合物
[0200]
在动物模型中测试了具有如表1中列出的17种分离的细菌的组合物(组合物a)。分离物的16s rdna序列id见表1。对于纤维素分解拟杆菌，使用seq id no.1(dsm 33265)。对于狄氏副拟杆菌，使用seq id no.10(dsm 33270)。对于脆弱拟杆菌，使用seq id no.14(dsm 33272)。
[0201]
如前所述(14)，建立鼠艰难梭菌感染模型。该模型基于使用抗生素抑制常驻小鼠微生物群，为艰难梭菌的生长创造营养生态位，从而导致疾病发展。
[0202]
全程使用约6周龄的雌性无特定病原体(spf)c57/bl6n小鼠。通过用在无菌饮用水中制备的头孢哌酮(0.5mg/ml，从相对于感染的第-12天开始直至第-2天)处理而对小鼠进行预适应10天。允许小鼠自由饮用含有抗生素的水。在剩余的研究期间，小鼠在感染前48小时恢复饮用不含头孢哌酮的饮用水。在感染艰难梭菌前48小时，通过腹腔注射单次施用克林霉素(10mg/kg)。
[0203]
在感染艰难梭菌前一天，将小鼠用两个剂量的1-2
×
107cfu组合物a处理，施用间隔11小时。在第0天，小鼠通过施用来自艰难梭菌菌株atcc 43255(vpi 10463)的100μl孢子制剂(对应于106cfu的孢子)感染艰难梭菌。
[0204]
感染后，根据临床需要频繁监测小鼠艰难梭菌感染体征，目的是没有小鼠出现长期重度疾病或死亡。感染体征包括发热、稀便和体重减轻。发现出现重度湿尾、腹泻、体温过低、俯卧或无反应的小鼠被实施安乐死，并记录死亡时间和临床状况。
[0205]
存活结果在图1中显示。测试了组合物a与用fmt疗法和单独载体的处理相比的有效性。用载体小鼠建立艰难梭菌atcc 43255感染的稳健模型，在载体处理组中载体小鼠显示感染后34小时的平均存活时间。用组合物a和fmt处理的小鼠分别显示～122和～121小时的平均存活时间。与载体处理的小鼠相比，这两个处理组均显示优越的存活时间，并具有统计学显著性(时序检验，p＝0.0008)。这表明该组合物是有效的并且提高了存活率。
[0206]
在存活模型中测试了具有如表2中所列的15种分离的细菌的组合物(组合物b)。表2中提供了分离物的16s rdna序列id no。小鼠接受两个剂量的0.6-1
×
107cfu组合物b处理，施用间隔11小时。
[0207]
测试组合物b与载体处理相比的有效性，评估为期7天的存活率(图2)。用载体小鼠建立艰难梭菌atcc 43255感染的稳健模型，载体处理组的平均存活时间为感染后91小时。接受组合物b处理的小鼠显示～128小时的平均存活时间。感染后7天，载体处理的小鼠的存
活率为38％，相比于组合物b处理的小鼠的存活率为63％。这表明组合物b是有效的并且提高了存活率。
[0208]
表2.组合物b中的细菌菌株。
[0209][0210][0211]
在存活模型中测试具有如表3中列出的10种分离的细菌的组合物(组合物c)。分离物的16s rdna序列id no在表3中提供。小鼠接受两个剂量的0.9-2
×
108cfu组合物c，在第-1天和第1天间隔11小时施用(小鼠在第0天感染艰难梭菌孢子)。在感染艰难梭菌前11小时，在第0天，给予小鼠0.7
×
108cfu的单剂量组合物c。
[0212]
测试了组合物c与载体处理相比的有效性，评估为期7天的存活率(图3)。建立艰难梭菌atcc 43255感染的稳健模型，载体处理组的小鼠显示平均存活时间为感染后55小时。组合物c处理的小鼠显示平均存活107小时。感染后7天，载体处理的小鼠的存活率为13％，相比于组合物c处理的小鼠的存活率为50％。这表明组合物c是有效的并且提高了存活率。
[0213]
表3.组合物c中的细菌菌株。
[0214]
编号分类16s rdna序列-序列标识符dsmz保藏号1纤维素类拟杆菌seq id no.1dsm 332652布劳特氏菌属seq id no.4dsm 332663灵巧粪球菌seq id no.5dsm 332774伴生粪球菌seq id no.6dsm 332785多尔氏菌属seq id no.7dsm 332676韦荣球菌ucg-003属seq id no.8dsm 332687内脏臭气杆菌seq id no.9dsm 332698狄氏副拟杆菌seq id no.10dsm 332709瘤胃梭菌9属seq id no.12dsm 3327110扭链瘤胃球菌seq id no.13dsm 33279
[0215]
2)在艰难梭菌感染的体重减轻模型中体内测试17种细菌分离物和17种细菌分离
物的亚群
[0216]
在进一步的实验中，在艰难梭菌感染的动物模型中测试组合物a和分别包含表1中所示的分离物的10个和4个菌株亚群的另外两种细菌组合物(组合物c和组合物d)。组合物c和d中的细菌分离物分别在表3和表4中显示，具有各自的16s rdna序列。
[0217]
表4.组合物d中的细菌菌株。
[0218][0219]
基于先前描述的模型建立鼠艰难梭菌感染模型(14)。该模型基于使用抗生素混合物抑制常驻小鼠微生物群，为艰难梭菌的生长创造营养生态位，从而导致疾病发展。
[0220]
使用5-9周龄的雌性spf小鼠(品系c57bl/6)。小鼠饮用(自由)补充有卡那霉素(0.4mg/ml)、庆大霉素(0.035mg/ml)、粘菌素(850u/ml)、甲硝唑(0.215mg/ml)和万古霉素(0.045mg/ml)的水，持续三天(第-7天至第-4天)，然后换用不含抗生素的水(自由饮用)。在第-2天，通过口服强饲法给予小鼠单剂量的克林霉素(10mg/kg)。
[0221]
在第-1天，或在第-1天和第0天，小鼠通过口服强饲法接受lbp或载体处理。在第0天，每只雄鼠接受1
×
105cfu的艰难梭菌菌株m7404(核糖型027)的孢子激发。监测小鼠的体重减轻，作为疾病体征。
[0222]
与载体对照相比，在艰难梭菌感染前一天施用的包含6-8
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107cfu的单剂量17种菌株联合体组合物a提供了对小鼠体重减轻的保护，艰难梭菌激发后两天组合物a处理组小鼠的体重平均减轻6.4％，相比于载体处理组减轻13.8％(图4a)，其具有统计学显著性(t检验，p＝＜0.006)。与载体处理的小鼠相比，这种对艰难梭菌感染相关体重减轻的增强保护表明组合物a是有效的。
[0223]
在同一模型中测试了10菌株联合体(组合物c)，其在感染前一天和感染当天在感染前5小时施用于小鼠，两种情况下均以1-2
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107cfu给药。与载体处理相比，组合物c对由艰难梭菌感染引起的体重减轻具有保护作用：在艰难梭菌激发后两天，组合物c处理组中的小鼠的体重平均减轻11.7％，相比于载体处理组减轻14.9％(图4b)。与载体处理的小鼠相比，这种对艰难梭菌感染相关体重减轻的保护增加表明组合物c是有效的。
[0224]
从用组合物a处理的小鼠分离粪便样品，并从粪便样品提取和纯化总dna。对粪便dna样品进行pcr，在单独的反应中使用17对引物，每对对组合物a的17种菌株中的一种菌株具有特异性。pcr扩增产物获自施用后3天或更长时间获得的粪便样品，其中4个引物集对来自表1中列出的17种菌株的纤维素类拟杆菌、狄氏副拟杆菌、脆弱拟杆菌、拟杆菌属
(bacteroies sp)具有特异性。认为这些特定菌株可能能够防止艰难梭菌在胃肠道中的生长。这4种菌株被配制成组合物d，并且在如上所述的艰难梭菌感染的体重减轻模型中对该组合物进行测试。组合物d在艰难梭菌感染前一天施用两次，施用两个剂量的5
×
107cfu，间隔8小时。与载体处理相比，组合物d对艰难梭菌感染引起的体重减轻具有保护作用：在艰难梭菌激发后两天，组合物d处理组中的小鼠的体重平均减轻7.4％，相比于载体处理组减轻12.2％(图4c)，具有统计学显著性(t检验，p＝0.03)。与载体处理的小鼠相比，这种对艰难梭菌感染相关体重减轻的增加保护表明组合物d是有效的。
[0225]
参考文献
[0226]
1.leffler da，lamont jt.clostridium difficile infection.n engl j med.2015；372(16)：1539-48.
[0227]
2.speight s，moy a，macken s，chitnis r，hoffman pn，davies a，et al.evaluation of the sporicidal activity of different chemical disinfectants used in hospitals against clostridium difficile.j hosp infection.2011；79(1)：18-22.
[0228]
3.control cfd.antibiotic resistance threats in the united states，2013.2013.
[0229]
4.lessa fc，mu y，bamberg wm，beldavs zg，dumyati gk，dunn jr，et al.burden of clostridium difficile infection in the united states.n engl j med.2015；372(9)：825-34.
[0230]
5.control ecfdpa.annual epidemiological report for 2016：healthcare-associated infections：clostridium difficile infections.stockholm；2018june 2018.
[0231]
6.nelson rl，suda kj，evans ct.antibiotic treatment for clostridium difficile-associated diarrhoea in adults.cochrane database syst rev.2017；3：cd004610.
[0232]
7.cammarota g，laniro g，tilg h，rajilic-stojanovic m，kump p，satokari r，et al.european consensus conference on faecal m icrobiota transplantation in clinical practice.gut.2017；66(4)：569-80.
[0233]
8.mamo y，woodworth mh，wang t，dhere t，kraft cs.durability and long-term clinical outcomes of fecal microbiota transplant treatment in patients with recurrent clostridium difficile infection.clin infect dis.2018；66(11)：1705-11.
[0234]
9.sachs re，edelstein ca.ensuring the safe and effective fda regulation of fecal microbiota transplantation.j law biosci.2015；2(2)：396-415.
[0235]
10.orenstein r，dubberke e，hardi r，ray a，mullane k，pardi ds，et al.safety and durability of rbx2660(microbiota suspension)for recurrent clostridium difficile infection：results of the punch cd study.clin infect dis.2016；62(5)：596-602.
[0236]
11.khanna s，pardi ds，kelly cr，kraft cs，dhere t，henn mr，et al.a novel microbiome therapeutic increases gut microbial diversity and prevents recurrent clostridium difficile infection.j infect dis.2016；214(2)：173-81.
[0237]
12.u.s.department of health and human services fada.early clinical trials with live biotherapeutic products：chemistry，manufacturing，and control information：guidance for industry.2016february 2012.
[0238]
13.lawley td，clare s，walker aw，stares md，connor tr，raisen c，et al.targeted restoration of the intestinal microbiota with a simple，defined bacteriotherapy resolves relapsing clostridium difficile disease in mice.plos pathog.2012；8(10)：e1002995.
[0239]
14.warn，p.，thommes，p.，sattar，a.，corbett，d.，flattery，a.，zhang，z.，black，t.，hernandez，l.d.and therien，a.g.，2016.disease progression and resolution in rodent models of clostridium difficile infection and impact of antitoxin antibodies and vancomycin.antimicrobial agents and chemotherapy，60(11)，pp.6471-6482.
[0240]
15.chen，x.，katchar，k.，goldsmith，j.d.，nanthakumar，n.，cheknis，a.，gerding，d.n.and kelly，c.p.，2008.a mouse model of clostridium difficile-associated disease.gastroenterology，135(6)，pp.1984-1992.
[0241]
序列
[0242]
》纤维素类拟杆菌seq id no.1
[0243][0244]
[0245]
》纤维素类拟杆菌seq id no.2
[0246][0247]
》纤维素类拟杆菌seq id no.3
[0248][0249]
》布劳特氏菌属seq id no.4
[0250]
[0251]
》灵巧粪球菌seq id no.5
[0252][0253][0254]
》伴生粪球菌seq id no.6
[0255][0256]
》多尔氏菌属seq id no.7
[0257][0258]
》韦荣球菌ucg-003属seq id no.8
[0259]
[0260]
》内脏臭气杆菌seq id no.9
[0261][0262][0263]
》狄氏副拟杆菌seq id no.10
[0264]
[0265]
》狄氏副拟杆菌seq id no.11
[0266][0267]
》瘤胃梭菌9属seq id no.12
[0268][0269]
》扭链瘤胃球菌seq id no.13
[0270][0271]
》脆弱拟杆菌seq id no.14
[0272][0273]
》脆弱拟杆菌seq id no.15
[0274][0275][0276]
》布劳特氏菌属seq id no.16
[0277][0278]
》布劳特氏菌属seq id no.17
[0279][0280]
》毛螺菌科fcs020群属seq id no.18
[0281]
[0282]
》毛梭菌属seq id no.19
[0283][0284]
》长双歧杆菌seq id no.20
[0285][0286]
》拟杆菌属seq id no.21
[0287]