用于核酸递送的脂化阳离子肽-PEG组合物的制作方法

用于核酸递送的脂化阳离子肽-peg组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年8月9日提交的美国临时申请第62/885,022号以及于2019年9月27日提交的美国临时申请第62/907,470号的优先权和权益，所述美国临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开涉及用于递送核酸和其它聚阴离子货物的阳离子化合物与低质量百分比的聚乙二醇化化合物(如聚乙二醇化脂质或聚乙二醇化二酰基甘油衍生物)组合的复合物和组合物。更具体地，本公开涉及叔氨基脂化和/或聚乙二醇化类肽，及其与少量聚乙二醇化脂质组合用于核酸递送的复合物和组合物。本公开还提供了用于制备包括一种或多种阳离子化合物和低质量百分比的聚乙二醇化化合物与聚阴离子化合物如核酸的复合物和其组合物的方法，以及用于将聚阴离子化合物递送到细胞的方法。


背景技术：

4.持续有效地将核酸递送到细胞中的能力是在临床环境中切实实施基因疗法、基于sirna、mirna、反义或mrna的疗法的关键要求。已经探索了多种阳离子化合物作为递送媒剂，其可以包封聚阴离子核酸并在体内稳定核酸以抵抗核酸酶。类脂1(在图1中示出)是阳离子类肽-磷脂缀合物构建体的实例，其已被广泛评估为独立的阳离子递送媒剂。然而，类脂与核酸的复合物仍可能在体内遭受进一步的并发症，包含例如颗粒不稳定性和聚集。
5.多组分脂质混合物，如脂质纳米颗粒调配物，已成为实现支持核酸体内递送所需的药代动力学性质(包含改进的调配物(颗粒)稳定性)的一大焦点。脂质纳米颗粒将阳离子化合物与许多相容的脂质共组分(例如，屏蔽脂质、结构脂质和磷脂)结合，在生理条件下提供电荷绝缘并向递送媒剂-核酸复合物赋予结构和化学稳定性。
6.然而，尽管脂质纳米颗粒调配物有望实现体内核酸转移所需的性质，但由于许多变量的相互作用，脂质调配物的优化通常很困难，包含为要递送的核酸鉴定相容的共组分并仔细调整每种组分的相对量以达到期望的药代动力学性质。此外，大多数基于脂质的调配物通常涉及不少于四种不同的组分，并且现有调配物的大部分主要由递送组分制成，而不是核酸材料本身。因此，活性治疗剂仅占整个调配物重量的一小部分。
7.因此，仍然需要实现有效、高效递送更高质量百分比的活性核酸材料而不损害体内施加所需的药代动力学性质的基因疗法调配物。


技术实现要素：

8.本公开提供了包括阳离子化合物(如类脂或叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物)与聚乙二醇化化合物(如peg脂质)组合的复合物和组合物，作为聚阴离子化合物的递送系统。本文所描述的复合物和组合物利用相对于阳离子化合物和聚阴离子化合物的含量以重量计最小量的peg化合物以稳定颗粒聚集，从而提供具有高质量百分比的活性聚
阴离子材料的易于优化的稳定调配物。
9.一方面，本公开包含一种组合物，其包括以下的复合物：
10.(i)一种或多种聚阴离子化合物；
11.(ii)一种或多种peg化合物；以及
12.(iii)一种或多种阳离子化合物，其中所述一种或多种阳离子化合物选自由以下组成的组：
13.(a)一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物或其盐：
[0014][0015]
其中：
[0016]
m为0；
[0017]
n为0到5的整数；
[0018]
s为0到5的整数；
[0019]
t为0；
[0020]
其中n和s中的至少一个是非零的；
[0021]
r为1到20的整数；
[0022]
每个o独立地为整数0、1、2、3或4；
[0023]
每个q独立地为整数0、1、2、3或4；
[0024]
每个p独立地为整数1或2；
[0025]
r1为
–
h、烷基、烷基芳基、-cor
1a
或脂质部分，
[0026]
其中r
1a
为-h、-oh、烷基、芳基、烷基芳基、-o-烷基或-o-烷基芳基；
[0027]
每个r2独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)uch3的乙二醇部分，并且其中每个u独立地为1到200的整数；
[0028]
每个r3独立地为脂质部分；
[0029]
每个r4独立地为中性间隔子部分或脂质部分；
[0030]
每个r5独立地为阳离子部分；
[0031]
每个r6独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)vch3的乙二醇部分，并且其中每个v独立地为1到200的整数；
[0032]
r7为-h、烷基、酰基、-oh、-or
7a
、-nh2、-nhr
7a
或脂质部分，其中r
7a
为烷基、酰基或脂质部分；并且
[0033]
每个ra和rb独立地为
–
h、c
1-c4烷基或在天然或非天然存在的氨基酸上发现的侧链部分；
[0034]
(b)一种或多种式(ii)类脂：
[0035][0036]
其中：
[0037]
x为1到100的整数；
[0038]
每个r9独立地为脂质部分；并且
[0039]
每个r
10
独立地为阳离子或中性间隔子部分；
[0040]
(c)一种或多种式(iii)脂质样化合物：
[0041][0042]
其中：
[0043]
每个r
11
独立地为经取代的或未经取代的烷基；
[0044]
每个r
12
独立地为经取代的或未经取代的烷基；
[0045]
每个r
13
独立地为氢或经取代的或未经取代的烷基；并且
[0046]
每个y独立地为1到8的整数；
[0047]
或者
[0048]
(d)其任何组合；
[0049]
并且其中所述一种或多种阳离子化合物、所述一种或多种peg化合物和所述一种或多种聚阴离子化合物的组合质量百分比为所述复合物的至少90％w/w。
[0050]
在此方面的一些实施例中，所述一种或多种阳离子化合物是一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物。在某些实施例中，所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化氨基酸残基嵌段，其中n或s为至少2。在某些实施例中，所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化氨基酸残基嵌段，其中n或s为4。在本发明方面的其它实施例中，每个r3独立地为c
4-c
22
烷基或c
4-c
22
烯基，并且其中所述c
4-c
22
烯基任选地是单不饱和的或多不饱和的。在可以与前述实施例中的一个或多个实施例组合的某些实施例中，每个r3独立地为c
8-c
12
烷基。在可以与前述实施例中的一个或多个实施例组合的仍又其它实施例中，每个r3独立地选自由以下组成的组：2-乙基己-1-基、己酰基、油烯基、硬脂酰基、亚油烯基、肉豆蔻基和月桂基。在可以与前述实施
例中的一个或多个实施例组合的一些实施例中，所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化氨基酸残基嵌段，所述n-脂化氨基酸残基嵌段包括具有两个不同脂质部分r
3a
和r
3b
之一的一组混合的n-脂化氨基酸残基。在可以与前述实施例中的一个或多个实施例组合的仍其它实施例中，至少一个脂质部分r3(或r
3a
或r
3b
)是支链脂肪族部分。在可以与前述实施例中的一个或多个实施例组合的某些实施例中，至少一个脂质部分r3(或r
3a
或r
3b
)是2-乙基己-1-基。
[0051]
在本发明方面的一些实施例中，所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的至少一种包括阳离子结构域，所述阳离子结构域包括具有阳离子部分r5的至少两个阳离子氨基酸残基。在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的其它实施例中，每个r5独立地为氨基烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基氨基烷基、胍基烷基、n-杂环基烷基或n-杂芳基。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的某些实施例中，每个r5独立地选自由以下组成的组：地选自由以下组成的组：在其它实施例中，每个r5为-(c
1-c4亚烷基)-nr
5ar5b
，其中r
5a
和r
5b
独立地为h、c
1-c3烷基或c
6-c
10
芳基，或者r
5a
和r
5b
与其所连接的氮原子一起形成4-7元n-杂环烷基环，其中所述n-杂环烷基环可以任选地包含一个另外的杂原子，所述一个另外的杂原子选自由n和o组成的组。在仍其它实施例中，每个r5为在一些实施例中，每个r5独立地为其中r
5a
和r
5b
独立地为h、c
1-c3烷基或c
6-c
10
芳基，或者r
5a
和r
5b
与其所连接的氮原子一起形成4-7元n-杂环烷基环，其中所述n-杂环烷基环可以任选地包含一个另外的杂原子，所述一个另外的杂原子选自由n和o组成的组。在某些实施例中，每个r5为
[0052]
在本发明方面的又其它实施例中，每个中性间隔子部分r4独立地为c
1-c5直链烷基、被环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基取代的c
1-c4烷基，其中每个环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基任选地被一个或多个取代基-oh、卤基或烷氧基取代。在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的一些实施例中，每个中性间隔子部分r4独立地选自由以下组成的组：-ch3、、在某些实施例中，每个中性间隔子部分r4为
[0053]
在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的又进一步的实施例中，所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的至少一种包
括阳离子结构域，所述阳离子结构域包括具有r5阳离子部分的至少两个氨基酸残基，并且其中所述阳离子结构域内的所述至少两个阳离子氨基酸残基中的每个阳离子氨基酸残基被至少一个具有中性间隔子或脂质部分r4的氨基酸残基隔开。在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的本发明方面的一些实施例中，所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的至少一种包括至少一个三聚体亚基-r
阳离子-r
中性-r
中性
，并且其中r
阳离子
是包括阳离子部分r5的氨基酸残基并且每个r
中性
是包括中性间隔子部分r4的氨基酸残基。在本发明方面的其它实施例中，所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的至少一种包括至少一个三聚体亚基-r
阳离子-r
中性-r
脂质
，并且其中r
阳离子
是包括阳离子部分r5的氨基酸残基，每个r
中性
是包括中性间隔子部分r4的氨基酸残基，并且每个r
脂质
是脂质部分r4。在前述实施例中的任何实施例中的某些实施例中，每个阳离子部分r5为并且每个中性间隔子部分r4为
[0054]
在可以与前述实施例中的一个或多个实施例组合的此方面的其它实施例中，ra和rb独立地选自由
–
h和-ch3组成的组。在可以与前述实施例中的一个或多个实施例组合的此方面的某些其它实施例中，ra和rb为
–
h。
[0055]
在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的本发明方面的仍其它实施例中，所述一种或多种阳离子肽化合物和一种或多种peg化合物以介于90:10与99:1之间的肽化合物与peg化合物的质量比存在。在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的本发明方面的又进一步的实施例中，所述一种或多种阳离子肽化合物和所述一种或多种peg化合物以介于95:5与98:2之间的肽化合物与peg化合物的质量比存在。在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的本发明方面的某些实施例中，所述一种或多种peg化合物包括dmg-peg2000。在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的此方面的仍又其它实施例中，所述一种或多种peg化合物包括一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物或其盐：
[0056][0057]
其中：
[0058]
m为0到15的整数；
[0059]
n为0到5的整数；
[0060]
s为0到5的整数；
[0061]
t为0到15的整数；
[0062]
其中m和t中的至少一个是非零的；
[0063]
r为1到20的整数；
[0064]
每个o独立地为整数0、1、2、3或4；
[0065]
每个q独立地为整数0、1、2、3或4；
[0066]
每个p独立地为整数1或2；
[0067]
r1为
–
h、烷基、烷基芳基、-cor
1a
或脂质部分，
[0068]
其中r
1a
为-h、-oh、烷基、芳基、烷基芳基、-o-烷基或-o-烷基芳基；
[0069]
每个r2独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)uch3的乙二醇部分，并且其中每个u独立地为1到200的整数；
[0070]
每个r3独立地为脂质部分；
[0071]
每个r4独立地为中性间隔子部分或脂质部分；
[0072]
每个r5独立地为阳离子部分；
[0073]
每个r6独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)vch3的乙二醇部分，并且其中每个v独立地为1到200的整数；
[0074]
r7为-h、烷基、酰基、-oh、-or
7a
、-nh2、-nhr
7a
或脂质部分，其中r
7a
为烷基、酰基或脂质部分；并且
[0075]
每个ra和rb独立地为
–
h、c
1-c4烷基或在天然或非天然存在的氨基酸上发现的侧链部分。
[0076]
在本发明方面的又其它实施例中，其中所述一种或多种peg化合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，当m为0到3的整数时，每个u独立地为30到50的整数；并且当m为4到15的整数时，每个u独立地为1到10的整数。在仍又其它实施例中，其中所述一种或多种peg化合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，其可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合，所述组合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，其中当t为0到3的整数时，每个v独立地为30到50的整数；当t为4到15的整数时，每个v独立地为1到10的整数。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的某些实施例中，m为1，并且u为40到45的整数；或者t为1，并且v为40到45的整数。
[0077]
在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的本发明方面的又其它实施例中，所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸。在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的本发明方面的仍又另一个实施例中，所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中所述一种或多种阳离子肽化合物与所述核酸的质量比介于0.5:1与20:1之间。在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的本发明方面的一些实施例中，所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中所述核酸是对多肽进行编码的mrna。在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的本发明方面的某些实施例中，所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中所述核酸是对蛋白质进行编码的mrna。
[0078]
在可以与前述实施例中的任何实施例中的一个或多个实施例组合的本发明方面的仍另外的实施例中，所述复合物进一步包括一种或多种第二试剂。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的又其它实施例中，所述一种或多种第二试剂选自由以下组成的组：聚乙二醇、靶向元件和其组合。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的仍又另一个实施例中，所述复合物进一步包括一种或多种小分子活性剂或药物物质。
[0079]
在本公开的又另一方面，本文提供了将聚阴离子化合物递送到细胞，其包括使所述细胞与其任何和所有的各个实施例中的前述方面的组合物接触。在此方面的某些实施例中，所述接触是通过内吞作用进行的。在可以与前述方面组合的此方面的其它实施例中，所
述细胞在体内或体外接触。在可以与前述实施例中的任一个或两个实施例组合的此方面的包含对多肽进行编码的核酸的某些实施例中，所述细胞在与所述组合物接触之后表达所述多肽。在可以与前述实施例中的一个或多个实施例组合的包含对蛋白质进行编码的核酸的仍另外的实施例中，所述细胞在与所述组合物接触之后表达所述蛋白质。
[0080]
本公开的另外的方面提供了通过使一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与一种或多种peg化合物和一种或多种聚阴离子化合物接触来制备前述方面的组合物的方法，所述组合物涉及组合物和其各个实施例中的任何和所有实施例。在此方面的实施例中，通过使包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种peg化合物的溶液与包括一种或多种聚阴离子化合物的溶液接触来形成组合物。
[0081]
在本公开的仍另一方面，本文提供了一种将聚阴离子化合物递送到受试者的肺的方法，所述方法包括向所述受试者施用前述方面的组合物，其中所述一种或多种阳离子化合物是一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，其中所述一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与所述聚阴离子化合物的所述质量比介于1:1与10:1之间。在本发明方面的一些实施例中，所述一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括化合物8、化合物24、化合物28、化合物73、化合物79、化合物93、化合物98或化合物112或其任何组合。在本发明方面的一些实施例中，所述一种或多种阳离子肽化合物和一种或多种peg化合物以介于90:10与99:1之间的肽化合物与peg化合物的质量比存在。在可以与前述实施例组合的其它实施例中，所述施用是静脉内(iv)(例如团注注射或静脉内输注)、皮下(sc)、肌内(im)、鞘内或瘤内注射。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的其它实施例中，所述聚阴离子化合物包括所述核酸，所述核酸是对多肽进行编码的mrna，并且所述细胞在与所述组合物接触之后表达所述多肽。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的某些实施例中，所述聚阴离子化合物包括所述核酸，所述核酸是对蛋白质进行编码的mrna，并且所述细胞在与所述组合物接触之后表达所述蛋白质。
[0082]
另一方面，本文提供了一种将聚阴离子化合物递送到受试者的肺和/或脾的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种阳离子化合物是一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，其中所述一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与所述聚阴离子化合物的质量比介于1:1与10:1之间。在本发明方面的一些实施例中，所述一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括化合物8、化合物19、化合物24、化合物28、化合物73、化合物79、化合物93、化合物98或化合物112或其任何组合。在本发明方面的一些实施例中，所述一种或多种阳离子肽化合物和一种或多种peg化合物以介于90:10与99:1之间的肽化合物与peg化合物的质量比存在。在可以与前述实施例组合的其它实施例中，所述施用是静脉内(iv)(例如团注注射或静脉内输注)、皮下(sc)、肌内(im)、鞘内或瘤内注射。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的其它实施例中，所述聚阴离子化合物包括所述核酸，所述核酸是对多肽进行编码的mrna，并且所述细胞在与所述组合物接触之后表达所述多肽。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的某些实施例中，所述聚阴离子化合物包括所述核酸，所述核酸是对蛋白质进行编码的mrna，并且所述细胞在与所述组合物接触之后表达所述蛋白质。
附图说明
[0083]
本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
[0084]
图1示出了示例性仲胺磷脂化阳离子肽“类脂1”。
[0085]
图2a-2f总体上示出了叔氨基脂化阳离子类肽。图2a示出了叔氨基脂化类肽的通用结构。图2b示出了示例性叔氨基脂化阳离子类肽。图2c示出了示例性脂质单体。图2d示出了示例性阳离子单体。图2e示出了示例性间隔子单体和聚乙二醇单体。图2f示出了示例性叔氨基脂化阳离子类肽化合物8。
[0086]
图3a-3e示出了用于通过在固相中连续添加氨基酸残基来制备叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的示例性方法。图3a示出了树脂结合的仲胺与酰化剂溴乙酸的通用酰化反应。图3b示出了所得酰化产物与合适的胺通过亲核置换反应以产生对应的n-取代的氨基酸残基。图3c和图3d示出了酰化和亲核置换反应的连续迭代以产生期望的树脂结合的阳离子肽化合物。图3e示出了阳离子肽化合物从固体树脂载体中切割以提供游离肽。
[0087]
图4a和4b示出了用单独的fluc mrna(无peg化合物)或用2％w/w或5％w/w下的dmg-peg2000掺入调配的示例性氨基脂化类肽化合物8的调配物中粒度稳定性随时间的变化和转染效率。图4a示出了在调配后立即(调配后30分钟)和调配后8小时观察到的三种调配物中的每种调配物的数均粒度图。图4b示出了处理之后8小时记录的用三种调配物处理的海拉(hela)细胞的平均生物发光条形图。
[0088]
图5a-5d示出了氨基脂化类肽化合物28与fluc mrna和2％w/w dmg-peg2000的调配物的体内全身分布随注射前在4℃下储存持续时间的变化。图5a-5c示出了储存1小时(图5a)、3天(图5b)和7天(图5c)之后的全身发光。图5d示出了对于每个时间点观察到的总光子通量的绘图。
[0089]
图6a-6e示出了在有和没有peg掺入(dmg-peg2000)的情况下，在用氨基脂化类肽和fluc mrna的调配物处理之后24小时在海拉细胞中记录的生物发光(rlu)。图6a描绘了用氨基脂化类肽化合物(1-18)和单独的fluc mrna(无dmg-peg2000)的调配物处理的细胞所观察到的生物发光。图6b和6c描绘了用添加有2％w/w dmg-peg2000的氨基脂化类肽化合物(1-36)和fluc mrna的调配物处理的细胞所观察到的生物发光。图6d和6e描绘了用类肽:mrna比率为5:1并添加有2％w/w dmg-peg2000的氨基脂化类肽化合物1-72和fluc mrna的调配物处理的海拉细胞的观察到的平均生物发光。
[0090]
图7a-7c示出了氨基脂化类肽与fluc mrna和2％w/w dmg-peg2000的调配物的体内全身分布和器官特异性分布，如通过生物发光强度和总光子通量所表示的。图7a示出了调配物在balb/c小鼠中的全身分布。图7b示出了调配物的对应器官特异性生物分布(在肺、肾、肝、脾、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结中)。图7c描绘了对调配物的器官特异性生物分布随总光子通量的变化进行定量的条形图。
[0091]
图8a-8c描绘了在用氨基脂化类肽与2％w/w dmg-peg2000和fluc mrna的调配物的皮下和肌内注射处理的balb/c小鼠中观察到的总光子通量。图8a示出了具有2％w/w dmg-peg 2000和fluc mrna的氨基脂化类肽化合物28的调配物在不同类肽:mrna比率(1:1、2:1、5:1、7.5:1和10:1)下皮下(sc)或肌内(im)向balb/c小鼠施用的总光子通量的绘图。图8b和8c示出了在用具有2％dmg-peg 2000和fluc mrna的氨基脂化类肽化合物1-72的调配
物在类肽:mrna比率为5:1下处理的小鼠中观察到的总光子通量图。
[0092]
图9a-9c描绘了对各种细胞类型(图9a中的海拉；图9b中的hepg2；以及图9c中的jawsii)的fluc mrna转染效率的体外评价中的归一化总光子通量(cps)，如以氨基脂化类肽(化合物24和79)与可商购获得的peg脂质(dmg-peg2000；18:0peg1000pe；14:0peg2000 pe；14:0peg5000 pe)、线性氨基聚乙二醇化类肽(化合物48、56、64和72)和支化氨基聚乙二醇化类肽(化合物106、107、108和109)组合的不同调配物提供的。
具体实施方式
[0093]
以下描述阐述了示例性方法、参数等。然而，应当认识到，此描述并非旨在限制本公开的范围，而是作为示例性实施例的描述而提供。
[0094]
本公开涉及用于递送核酸和其它聚阴离子货物的阳离子化合物如叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与低质量百分比的聚乙二醇化化合物如聚乙二醇化脂质的复合物和组合物。更具体地，本公开涉及叔氨基脂化和/或聚乙二醇化类肽，以及其具有用于核酸递送的低浓度聚乙二醇化脂质的复合物和组合物。本公开还提供了用于制备包括叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽和低质量百分比的聚乙二醇化化合物中的一种或多种与聚阴离子化合物如核酸的复合物和组合物的方法，以及用于将聚阴离子化合物递送到细胞的方法。一方面，本文提供了包括一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种peg化合物和一种或多种阳离子化合物的复合物和组合物。
[0095]
应当认识到，由于其有利的电荷-电荷相互作用，一种或多种阳离子化合物可以与组合物内的一种或多种聚阴离子化合物形成复合物。应当进一步认识到，一种或多种聚乙二醇化化合物可以进一步与阳离子化合物-聚阴离子化合物的电荷复合物组合以形成复合物。除了不与阳离子化合物和聚阴离子化合物形成复合物的任何另外的组分之外，本文提供的组合物应理解为含有存在于包括聚阴离子化合物与阳离子化合物和聚乙二醇化化合物的复合物中的所有组分。
[0096]
出人意料地，观察到将聚乙二醇化化合物(如peg脂质dmg-peg2000)添加到包括阳离子递送媒剂化合物和聚阴离子化合物的复合物和组合物中可以提供随时间改善的颗粒稳定性而无需进一步掺入结构脂质和用作标准脂质纳米颗粒调配物的共组分的磷脂。此外，还观察到，相对于整个复合物，通过仅掺入少量质量百分比的聚乙二醇化化合物即可实现长期稳定化效果，从而提供稳定的、易于优化的调配物，能够支持将复合物中更大重量分数的活性聚阴离子材料递送到细胞。包括小质量百分比的聚乙二醇化化合物的复合物以及因此也包括所述复合物的组合物示出了对于其聚阴离子货物具有与阳离子化合物和单独的聚阴离子化合物的复合物相当的转染效率，但具有显著改善的调配物稳定性。
[0097]
如本文所用，“烯基”是指不饱和直链或支链单价烃链或其组合，其具有至少一个烯属不饱和位点(即，具有式c＝c的至少一个部分)并且具有指定碳原子数(即，c
2-c
10
意指二到十个碳原子)。烯基可以是“顺式”或“反式”构型或可替代地是“e”或“z”构型。特定的烯基是具有2到20个碳原子的烯基(“c
2-c
20
烯基”)、具有2到8个碳原子的烯基(“c
2-c8烯基”)、具有2到6个碳原子的烯基(“c
2-c6烯基”)或具有2到4个碳原子的烯基(“c
2-c4烯基”)。烯基的实例包含但不限于如乙烯基(ethenyl或vinyl)、丙-1-烯基、丙-2-烯基(或烯丙基)、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯基等
基团、其同系物和异构体等。
[0098]
术语“烷基”是指并包含具有指定碳原子数(即，c
1-c
10
意指一到十个碳)的饱和的直链和支链一价烃结构及其组合。特定的烷基是具有1到20个碳原子的烷基(“c
1-c
20
烷基”)。更特定的烷基是具有1到8个碳原子的烷基(“c
1-c8烷基”)、具有3到8个碳原子的烷基(“c
3-c8烷基”)、具有1到6个碳原子的烷基(“c
1-c6烷基”)、具有1到5个碳原子的烷基(“c
1-c5烷基”)或具有1到4个碳原子的烷基(“c
1-c4烷基”)。烷基的实例包含但不限于如以下的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同源物和异构体。
[0099]
如本文所用，“亚烷基”是指与烷基相同的残基，但是具有双价。特定的亚烷基是具有1到6个碳原子的亚烷基(“c
1-c6亚烷基”)、具有1到5个碳原子的亚烷基(“c
1-c5亚烷基”)、具有1到4个碳原子的亚烷基(“c
1-c4亚烷基”)或具有1到3个碳原子的亚烷基(“c
1-c3亚烷基”)。亚烷基的实例包含但不限于如亚甲基(-ch
2-)、亚乙基(-ch2ch
2-)、亚丙基(-ch2ch2ch
2-)、亚丁基(-ch2ch2ch2ch
2-)等基团。
[0100]
如本文所用，“炔基”是指不饱和直链或支链单价烃链或其组合，其具有至少一个炔属不饱和位点(即，具有式c≡c的至少一个部分)并且具有指定碳原子数(即，c
2-c
10
意指二到十个碳原子)。特定的炔基是具有2到20个碳原子的炔基(“c
2-c
20
炔基”)、具有2到8个碳原子的炔基(“c
2-c8炔基”)、具有2到6个碳原子的炔基(“c
2-c6炔基”)或具有2到4个碳原子的炔基(“c
2-c4炔基”)。炔基的实例包含但不限于如乙炔基(ethynyl或acetylenyl)、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基等基团、其同系物和异构体等。
[0101]
术语“芳基”是指并包含多不饱和芳香烃基团。芳基可以含有另外的稠合环(例如，1到3个环)，包含额外的稠合芳基、杂芳基、环烷基和/或杂环基环。在一个变形中，芳基含有6到14个环状碳原子。芳基基团的实例包含但不限于苯基、萘基、联苯基等。
[0102]“羰基”是指基团c＝o。
[0103]
如本文所用，“复合物”包含两个或更多个分子之间的任何化学缔合，其可以由离子相互作用、氢键、范德华相互作用、金属-配体配位、其它化学力以及前述中的一种或多种的组合介导。复合物可以形成更高级的结构，包含例如复合物、凝聚复合物、纳米复合物、纳米颗粒和微颗粒。
[0104]
术语“环烷基”是指并包含环状一价烃结构，其可以是完全饱和的、单不饱和或多不饱和的，但其是非芳香族的，具有指定的碳原子数(例如，c
1-c
10
表示一到十个碳)。环烷基可以由一个环组成(如环己基)，或由多个环组成(如金刚烷基)，但不包括芳基。包括多于一个环的环烷基可以是稠合、螺环或桥连的，或其组合。优选的环烷基是具有3到13个环状碳原子的环烃。更优选的环烷基是具有3到8个环状碳原子的环烃(“c
3-c8环烷基”)。环烷基的实例包含但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、降冰片基等。
[0105]“卤基”或“卤素”是指原子序数为9到85的第17族系列元素。优选的卤基包含氟、氯、溴和碘。如果残基被多于一个卤素取代，则可以通过使用与所连接的卤素部分的数目相对应的前缀来进行指代，例如，二卤代芳基、二卤代烷基、三卤代芳基等是指被两个(“di”)或三个(“tri”)卤基取代的芳基和烷基，所述卤基可能是相同的卤素但不一定是相同的卤
基；因此4-氯-3-氟苯基在二卤代芳基的范围内。其中每个氢均被卤基替代的烷基被称为“全卤代烷基”。优选的全卤代烷基是三氟烷基(-cf3)。类似地，“全卤代烷氧基”是指这样的烷氧基：在构成烷氧基的烷基部分的烃中，卤素取代每个h。全卤代烷氧基的实例是三氟甲氧基(-ocf3)。
[0106]
术语“杂芳基”是指并包含具有1到10个环状碳原子和至少一个环状杂原子的不饱和芳香族环状基团，包含但不限于如氮、氧和硫等杂原子，其中氮和硫原子被任选地氧化，并且氮原子被任选地季铵化。杂芳基可以在环状碳或环状杂原子处连接到分子的其余部分。杂芳基可以含有另外的稠合环(例如，1到3个环)，包含额外的稠合芳基、杂芳基、环烷基和/或杂环基环。杂芳基的实例包含但不限于吡啶基、嘧啶基、噻吩基、呋喃基、噻唑基等。
[0107]
术语“杂环(heterocycle)”或“杂环基(heterocyclyl)”是指具有1到10个环状碳原子和1到4个环状杂原子的饱和或不饱和非芳香族基团，如氮、硫或氧等，其中氮和硫原子被任选地氧化，并且氮原子被任选地季铵化。杂环基可以具有一个环或多个稠合环，但不包括杂芳基。包括多于一个环的杂环可以是稠合、螺环或桥连的，或其任何组合。在稠合环系统中，一个或多个稠合环可以是芳基或杂芳基。杂环基的实例包含但不限于四氢吡喃基、二氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、2,3-二氢苯并[b]噻吩-2-基、4-氨基-2-氧嘧啶-1(2h)-基等。
[0108]“氧代基”是指部分＝o。
[0109]“硫代羰基”是指基团c＝s。
[0110]
除非另外说明，否则“任选地经取代的”是指基团可以是未被取代的或被所述基团列出的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个或5个)取代基取代，其中取代基可以是相同的或不同的。在一个实施例中，任选地经取代的基团具有一个取代基。在另一个实施例中，任选地经取代的基团具有两个取代基。在另一个实施例中，任选地经取代的基团具有三个取代基。在另一个实施例中，任选地经取代的基团具有四个取代基。在一些实施例中，任选地经取代的基团具有1到2个、2到5个、3到5个、2到3个、2到4个、3到4个、1到3个、1到4个或1到5个取代基。
[0111]
术语“经取代的”是指一个部分的一个或多个氢原子被一价或二价基团取代。“任选地经取代的”指示所述部分可以被取代或未被取代。合适的取代基包含例如羟基、硝基、氨基(例如-nh2或二烷基氨基)、亚氨基、氰基、卤基(如f、cl、br、i)、卤代烷基(如-ccl3或-cf3)、硫代、磺酰基、硫代酰氨基、脒基、亚氨基、氧代、恶脒基、甲恶脒基、亚氨基、胍基、磺酰胺基、羧基、甲酰基、烷基、烷氧基、烷氧基-烷基、烷基羰基、烷基羰氧基(-ocor)、氨基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、羰基氨基、杂芳基羰基、杂芳烷基-羰基、烷硫基、氨基烷基、氰基烷基、氨基甲酰基(-nhcoor-或-oconhr-)、脲(-nhconhr-)、芳基等，其中r是任何合适的基团，例如烷基或亚烷基。在一些实施例中，如所描述的，任选地经取代的部分仅被选择的基团任选地取代。在一些实施例中，上述基团(例如，烷基)任选地被例如烷基(例如，甲基或乙基)、卤代烷基(例如-ccl3、-ch2chcl2或-cf3)、环烷基(例如，-c3h5、-c4h7、-c5h9)、氨基(例如，-nh2或二烷基氨基)、烷氧基(如甲氧基)、杂环烷基(例如吗啉、哌嗪、哌啶、氮杂环丁烷)、羟基和/或杂芳基(例如，恶唑基)。在一些实施例中，取代基本身是任选地被取代的。在一些实施例中，取代基本身没有被取代。取代基团上经取代的基团可以是例如羧基、卤基、硝基、氨基、氰基、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、氨基羰基、-sr、硫代酰胺基、-so3h、-so2r或环烷
基，其中r是任何合适的基团，例如氢或烷基。
[0112]
阳离子化合物作为递送媒剂
[0113]
如上文详述，本文提供的复合物和组合物包括一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种聚乙二醇化化合物和一种或多种阳离子化合物。凭借其正电荷，复合物和组合物中的阳离子化合物可以抵消聚阴离子货物上的负电荷并形成电荷中性复合物(也被称为阳离子化合物-聚阴离子化合物复合物)，从而促进阴离子材料的传输通过亲脂性细胞膜进入靶细胞。
[0114]
如本文所描述的阳离子化合物具有净零电荷或净正电荷。在其中复合物或组合物包括一种或多种阳离子化合物的一些实施例中，一种或多种阳离子化合物独立地具有净零电荷或净正电荷。在某些实施例中，一种或多种阳离子化合物独立地具有至少+1的净正电荷。在其它实施例中，一种或多种阳离子化合物独立地具有至少+2的净正电荷。在其它实施例中，一种或多种阳离子化合物独立地具有小于或等于+4或小于或等于+3的净正电荷。应该认识到存在于一种或多种阳离子化合物上的净电荷可以根据环境条件而变化。例如，在一些实施例中，一种或多种阳离子化合物在生理相关的ph范围内独立地具有稳定的净正电荷。例如，生理ph为至少约5.5，并且通常至少约6.0。更通常地，生理ph为至少约6.5。通常，生理ph小于约8.5，并且通常小于约8.0。更通常地，生理ph小于约7.5。
[0115]
应当认识到，有多种阳离子化合物可以用作核酸的递送媒剂并且适用于本文所描述的复合物和组合物。本文所描述的复合物和组合物中的阳离子化合物可以包含离散的小分子以及更大的聚合构建体。合适的阳离子化合物可以包含但不限于阳离子脂质、阳离子脂质-肽缀合物(例如，类脂)、阳离子肽、阳离子聚合物和脂质样(亲脂)阳离子化合物。在一些实施例中，本公开的复合物和组合物包括一种或多种阳离子化合物，其中所述一种或多种阳离子化合物选自由以下组成的组：阳离子脂质、阳离子脂质-肽缀合物(例如类脂)、阳离子肽、阳离子聚合物和脂质样(亲脂)阳离子化合物，以及其任何组合。
[0116]
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物
[0117]
一些实施例中，本公开的复合物和组合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物。叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是包括n-取代的氨基酸残基的肽链。本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括寡肽骨架，其中所述寡肽骨架包括n-取代的阳离子氨基酸残基的重复亚基，任选地与n-取代的中性(“间隔子”)和/或脂质氨基酸残基交错。寡肽骨架在n端和/或c端进一步由被脂质部分n-取代(“n-脂化”)和/或被低聚乙二醇和/或聚乙二醇n-取代的氨基酸残基加帽(“n-聚乙二醇化”)。
[0118]
一方面，本文提供了式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物或其盐：
[0119][0120]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的特征可以在于肽化合物中存在的氨基酸残基的总数，其中每个氨基酸残基由通用结构
–
(nr-crar
b-c(o))
–
表示。在一些实施例中，氨基酸残基的总数介于2与40个氨基酸残基之间、介于2与30个氨基酸残基之间、介于3与25个氨基酸残基之间、介于5与20个氨基酸残基之间或介于7与15个氨基酸残基之间。在某些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括介于5与20个氨基酸残基之间。在某些实施例中，氨基酸残基的总数是m、n、s、t和[r
×
(o+p+q)]的总和。
[0121]
在其它实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物具有净零电荷或净正电荷。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基脂化阳离子肽化合物的某些实施例中，叔氨基脂化阳离子肽化合物的净正电荷为至少+1。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基聚乙二醇化阳离子肽化合物或叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子肽化合物的其它实施例中，阳离子肽化合物具有净零电荷(即，是电荷中性的)或净正电荷。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基聚乙二醇化阳离子肽化合物或叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子肽化合物的一些实施例中，阳离子肽化合物的净正电荷为+1。在某些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的净正电荷为(r
×
p)+。
[0122]
在某些实施例中，本文所描述的阳离子肽化合物的氨基酸残基为天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸的n-取代的变体，其中碳侧链由ra和rb表示。氨基酸残基可以d-构型或l-构型存在。另外，应当认识到氨基酸残基n位的取代可以限制酰胺键的自由旋转。因此，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物也可以各种旋转异构构象(旋转异构体)存在。
[0123]
在一些实施例中，每个ra和每个rb独立地是在天然或非天然存在的氨基酸上发现的侧链部分。如本文所用，术语“天然存在的氨基酸”是指gly、ala、val、leu、ile、ser、thr、cys、met、asp、glu、asn、gln、lys、arg、phe、tyr、his或trp。术语“非天然存在的氨基酸”是指通常不存在于自然界中的氨基酸，包含例如天然存在的氨基酸的d-异构体、2-氨基己二酸、2-氨基丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在某些实施例中，每个ra和rb独立地为
–
h、-ch3或或
[0124]
在其它实施例中，每个ra和每个rb独立地为
–
h或c
1-c4烷基。在某些实施例中，每个ra和每个rb独立地为
–
h或ch3。在其它实施例中，ra和rb为
–
h。在其中ra和rb是-h的实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物也可以被称为n-脂化和/或聚乙二醇化聚甘
氨酸化合物或n-脂化和/或聚乙二醇化类肽化合物。在某些实施例中，每个ra和每个rb独立地为
–
h、c
1-c4烷基或在天然或非天然存在的氨基酸上发现的侧链部分。
[0125]
寡肽骨架或重复亚基和结构基序
[0126]
如本文所描述的，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以用于与聚阴离子化合物如核酸复合，并且用于将此类聚阴离子化合物递送到细胞中。本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括任选地与n-取代的中性间隔子氨基酸残基和/或n-脂化的氨基酸残基交错的n-取代的阳离子氨基酸残基的重复亚基的寡肽骨架，如下式(i)的片段所示：
[0127][0128]
寡肽骨架的重复亚基中的阳离子氨基酸残基赋予本公开的化合物正电荷，这允许与聚阴离子物质如核酸的有利静电相互作用和电荷中和。阳离子残基之间的中性或脂化氨基酸残基的交错允许更好地控制整个叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中正电荷的空间分布，这使得阳离子肽化合物与具有特定的长度、电荷分布和/或构象的聚阴离子物质的复合被改善。
[0129]
在寡肽骨架中，r表示叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的阳离子和中性和/或脂化氨基酸残基的重复亚基的数量。在一些实施例中，r为1到25的整数。在某些实施例中，r为1到20的整数。在其它实施例中，r为1到15的整数。在一些实施例中，r为1到5的整数。在某些实施例中，r为2到4的整数。
[0130]
应当认识到，每个亚基r可以或可以不与整个叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的其它亚基严格相同。例如，在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物内，每个亚基r可以包括阳离子氨基酸残基，并且任选地还包括中性和/或脂化氨基酸残基，其相对于存在于其它亚基中的阳离子和中性和/或脂化氨基酸残基是独立选择的。
[0131]
阳离子部分
[0132]
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的每个重复亚基包括至少一个阳离子氨基酸残基。阳离子氨基酸残基通过与核酸或聚阴离子化合物上的负电荷相互作用，提供使本文所描述的肽化合物能够与核酸或其它聚阴离子化合物形成静电复合物的正电荷。核酸的复合部分或完全地屏蔽了核酸的负电荷，并且促进通过细胞的脂质膜转运到细胞内部。
[0133]
在每个亚基r内，p表示所述亚基中存在的阳离子氨基酸残基的数量。在一些实施例中，每个p独立地为整数1或2。在某些实施例中，p为1。
[0134]
每个阳离子氨基酸残基在n位包括阳离子部分r5。应当认识到，每个阳离子部分r5不仅可以在阳离子肽化合物的重复亚基内独立选择，而且可以在整个寡肽骨架中独立选择。
[0135]
如本文所描述的阳离子部分可以是在生理相关ph范围内具有稳定的净正电荷的取代基。例如，生理ph为至少约5.5，并且通常至少约6.0。更通常地，生理ph为至少约6.5。通常，生理ph小于约8.5，并且通常小于约8.0。更通常地，生理ph小于约7.5。阳离子部分的特征在于，例如，所述部分中存在的官能团的阈值pka值足以在生理ph下产生正电荷。在某些
实施例中，阳离子部分的pka值为至少7.5。在其它实施例中，阳离子部分具有介于生理ph与更酸性ph例如ph 4.5-5.5之间的pka。在另外的实施例中，使用具有多个独立pka值的取代基。
[0136]
应当认识到，本文所描述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以包括沿着彼此紧密接近的寡肽骨架的多个阳离子部分。当沿着寡肽骨架存在多个阳离子部分时，某些阳离子部分的质子化或去质子化状态可能会影响紧邻的其它阳离子部分的pka值。通过此机制，本文所描述的阳离子肽化合物中的特定阳离子部分的pka可以相对于其单独测量的pka值而改变。例如，寡肽骨架中的一种胺质子化，其pka为约8，可以将附近阳离子部分的pka值从约7.5的正常值降低至pka为约5-6。
[0137]
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物以不同的彼此接近度容纳多个阳离子部分的能力使得这些阳离子肽化合物和其任何复合物能够以高灵敏度响应生理ph的变化。这些化合物和其复合物对生理ph值变化的敏感性可能对促进内体转运后核酸递送和释放到胞质溶胶中很重要(内体隔室ph为约4.5到5.5)。
[0138]
阳离子或带正电荷的部分可以包含例如基于氮的取代基，如含有以下官能团的那些：氨基、胍基、酰肼基和脒基。这些官能团可以是芳香族、饱和环状或脂肪族。在一些实施例中，每个r5独立地为氨基烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基氨基烷基、胍基烷基、n-杂环基烷基或n-杂芳基。在其它实施例中，每个r5独立地为独立地为
[0139]
在某些实施例中，每个r5独立地选自由以下组成的组：独立地选自由以下组成的组：在仍其它实施例中，每个r5为
[0140]
在某些实施例中，每个r5为-(c
1-c4亚烷基)-nr
5ar5b
，其中r
5a
和r
5b
独立地为h、c
1-c3烷基或c
6-c
10
芳基，或者r
5a
和r
5b
与其所连接的氮原子一起形成4-7元n-杂环烷基环，其中所述n-杂环烷基环可以任选地包含一个另外的杂原子，所述一个另外的杂原子选自由n和o组
成的组。在某些实施例中，每个r5为在一些实施例中，每个r5独立地为其中r
5a
和r
5b
独立地为h、c
1-c3烷基或c
6-c
10
芳基，或者r
5a
和r
5b
与其所连接的氮原子一起形成4-7元n-杂环烷基环，其中所述n-杂环烷基环可以任选地包含一个另外的杂原子，所述一个另外的杂原子选自由n和o组成的组。在某些实施例中，每个r5独立地选自由以下组成的组：地选自由以下组成的组：
[0141]
在仍某些其它实施例中，每个r5为
[0142]
在其中阳离子残基是整个肽化合物的末端残基的又另外的实施例中，可以利用与合成或脱保护条件(如酸不稳定接头)不相容或适合的保护基策略不可用(例如聚胺)的另外的阳离子部分r5。例如，在一些实施例中，末端阳离子残基的阳离子部分r5是聚胺。在其中末端残基的r5是聚胺的一些实施例中，聚胺为是聚胺的一些实施例中，聚胺为是聚胺的一些实施例中，聚胺为在某些实施例中，聚胺选自由以下组成的组：在某些实施例中，聚胺选自由以下组成的组：
[0143]
在其它实施例中，末端阳离子残基的阳离子部分r5是羟基烷基、羟基醚、烷氧基烷基或羟基杂烷基。在某些实施例中，末端阳离子残基的阳离子部分r5为
[0144]
在仍另外的实施例中，末端阳离子残基的阳离子部分r5为
[0145]
应当进一步认识到，肽链中的未经取代的氮原子，即其中r5为氢，在生理条件下也可以用作可电离的阳离子部分。在一些实施例中，阳离子部分r5是氢原子。
[0146]
中性间隔子部分
[0147]
在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的寡肽骨架内，阳离子氨基酸残基可以任选地与中性间隔子氨基酸残基交错，在n位具有中性间隔子部分。中性氨基酸残基可以用于调节叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的正电荷的空间分布，以改善与要与阳离子肽化合物复合的聚阴离子化合物(包含多核苷酸)的静电相互作用。
[0148]
在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的每个重复亚基中，中性氨基酸残基可以作为一个或多个r4基团存在于阳离子氨基酸残基的n端或c端上。在其中亚基r包括中性间隔子部分r4的一些实施例中，存在的每个中性间隔子部分的对应o和/或q表示与亚基r内的阳离子氨基酸残基的n端和c端键合的中性间隔子残基的对应数量。在一些实施例中，每个o独立地为整数0、1、2、3或4。在其它实施例中，每个q独立地为整数0、1、2、3或4。
[0149]
每个中性间隔子氨基酸残基包括在n位处的中性间隔子部分r4。与本文所描述的阳离子部分一样，应当认识到每个中性间隔子部分r4独立地选择在阳离子肽化合物的重复亚基内以及寡肽骨架的重复亚基r中。
[0150]
还应当认识到，中性间隔子部分可以包含在生理相关ph范围内为中性或具有零净电荷的任何取代基。在一些实施例中，每个中性部分r4独立地为c
1-c5直链烷基、被环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基取代的c
1-c4烷基，其中每个环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基任选地被一个或多个取代基-oh、卤基或烷氧基取代。在仍一些实施例中，每个中性间隔子部分r4独立地选自由以下组成的组：-ch3、、、在某些实施例中，每个中性间隔子部分r4为
[0151]
在仍其它实施例中，中性间隔子部分可以包含在生理相关的ph范围内可能变成阴离子(即，具有负电荷)的取代基。例如，在一些实施例中，间隔子部分r4为
[0152]
脂质部分
[0153]
除了在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的寡肽骨架内任选地将中性氨基酸残基与阳离子氨基酸残基交错外，在n位具有脂质部分的n-脂化氨基酸残基可以还任选地与阳离子(和任选的中性间隔子)氨基酸残基交错。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化氨基酸残基的一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是n-脂化的。与中性氨基酸残基类似，寡肽骨架内的n-脂化氨基酸残基可以用于调节叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的正电荷的空间分布，并增强其亲脂性以改进聚阴离子材料的包封和细胞内递送。脂质沿类肽骨架的间距也可能影响已知会影响细胞摄取和内体释放的脂质流动性/结晶度。
[0154]
与中性间隔子残基一样，在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的每个重复亚基中，n-脂化氨基酸残基可以存在于阳离子氨基酸残基的n端或c端或两端上作为一个或多个r4基团。在其中亚基r包括脂质部分r4的一些实施例中，存在的每个脂质部分的对应o和/或q还可以表示与亚基r内的阳离子氨基酸残基的n端和c端键合的脂化残基的对应数量。在一些实施例中，每个o独立地为整数0、1、2、3或4。在其它实施例中，每个q独立地为整数0、1、2、3或4。
[0155]
每个n-脂化氨基酸残基包括在n-位处的脂质部分r4。与本文所描述的阳离子部分和中性部分一样，应当认识到每个脂质部分r4独立地选择在阳离子肽化合物的重复亚基内以及寡肽骨架的重复亚基r中。
[0156]
合适的脂质部分可以包含例如任选地经取代的支链或直链脂肪族部分，或衍生自天然脂质化合物(包含脂肪酸、甾醇和类异戊二烯)的任选地经取代的部分。
[0157]
在一些实施例中，脂质部分可以包含具有约6到约50个碳原子或约10到约50个碳原子，任选地包括一个或多个杂原子，并且任选地包括一个或多个双或三键(即，饱和或单不饱和或多不饱和)的支链或直链脂肪族部分。在某些实施例中，脂质部分可以包含任选地经取代的脂肪族、直链或支链部分，每个疏水尾独立地具有约8到约30个碳原子或约6到约30个碳原子。在某些实施例中，脂质部分可以包含例如衍生自脂肪酸和脂肪醇的脂肪族碳链。在一些实施例中，每个脂质部分r4独立地为c
8-c
24
烷基或c
8-c
24
烯基，其中所述c
8-c
24
烯基任选地是单不饱和的或多不饱和的。在一些实施例中，每个脂质部分r4为c
6-c
18
烷基或c
6-c
18
烯基。在某些实施例中，每个脂质部分r4是c
6-c
18
烷基或c
6-c
18
烯基，其中所述c
6-c
18
烯基是单不饱和的。在某些其它实施例中，每个脂质部分r4为c
6-c
17
烷基或c
6-c
17
烯基。在某些实施例中，每个脂质部分r4为c
8-c
12
烷基。在仍其它实施例中，每个脂质部分r4为c
10-烷基，如正癸基。在一些实施例中，每个r4独立地选自由以下组成的组：2-乙基己-1-基、辛酰基、己酰基、油烯基、硬脂酰基、亚油烯基、肉豆蔻基和月桂基。在其它实施例中，每个脂质部分r4独立地选自由以下组成的组：2-乙基己-1-基、己酰基、油烯基、硬脂酰基、亚油烯基、肉豆蔻基和月桂基。在某些实施例中，每个脂质部分r4独立地选自由以下组成的组：2-乙基己-1-基、己酰基、油烯基、肉豆蔻基和月桂基。
[0158]
在可以与前述实施例中的任何实施例组合的又其它实施例中，每个脂质部分r4独
立地为立地为在可以与前述实施例中的任何实施例组合的仍又其它实施例中，每个脂质部分r4独立地为式独立地为式的脂质，其中r8是具有约6到约50个碳原子或约10到约50个碳原子，任选地包括一个或多个杂原子，并且任选地包括一个或多个双键或三键的支链或直链脂肪族部分。在某些实施例中，每个脂质部分r4独立地为地为
[0159]
用于实施本发明的天然脂质部分可以衍生自例如磷脂、甘油酯(如甘油二酯或甘油三酯)、糖基甘油酯、鞘脂、神经酰胺以及饱和和不饱和甾醇、类异戊二烯等天然脂质。
[0160]
其它合适的脂质部分可以包含亲脂性碳环或芳香族基团，如任选地经取代的芳基、环烷基、环烷基烷基或芳烷基部分，包含例如萘基或乙基苄基，或包括酯官能团的脂质，包含例如甾醇酯和蜡酯。在仍其它实施例中，脂质部分r4为为
[0161]
结构基序
[0162]
在一些实施例中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以包括阳离子、中性间隔子和脂化氨基酸残基相对于彼此的特定序列或布置，其描述可以类似于线性共聚物的各种分类(无规、嵌段、交替、周期性、立体嵌段等)。
[0163]
例如，在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子化合物包括通用部分r
阳离子
、r
中性
和r
脂质
的一些实施例中，氨基酸残基可以以随机序列、交替序列或嵌段序列布置。应当理解，r
阳离子
和r
中性
的表示分别等同于包括阳离子部分r5和中性部分r4的氨基酸残基。通用部分r
脂质
可以理解为包含具有脂质部分r4和脂质部分r3的两个氨基酸残基，这取决于叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的n-脂化残基的位置。
[0164]
阳离子和中性间隔子氨基酸残基的交替序列的一个实例可以由r
阳离子-r
中性-r
阳离子-r
中性
或r
中性-r
阳离子-r
中性-r
阳离子
表示。阳离子和脂化氨基酸残基的交替序列的另一个实例可以由r
阳离子-r
脂质-r
阳离子-r
脂质
或r
中性-r
阳离子-r
中性-r
阳离子
表示。嵌段序列的一些实例可以由r
阳离子-r
阳离子-r
阳离子-r
中性-r
中性-r
中性
、r
中性-r
中性-r
中性-r
阳离子-r
阳离子-r
阳离子
、r
阳离子-r
阳离子-r
阳离子-r
脂质-r
脂质-r
脂质
或r
脂质-r
脂质-r
脂质-r
阳离子-r
阳离子-r
阳离子
表示。在仍一些实施例中，阳离子部分、中性间隔子部分和脂化部分可以以嵌段序列和交替序列布置，用于整个寡肽化合物内的不同重复亚基区段。例如，在一些实施例中，在阳离子肽化合物中可以存在较大寡聚体单元的重复基序，如r
阳离子-r
中性-r
中性-r
阳离子-r
中性-r
中性
。在其它实施例中，阳离子肽化合物可以包括与交替的阳离子和中性残基的嵌段组合的n-脂化残基嵌段。
[0165]
如本文所描述的，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽包括至少一个具有阳离子部分r5的阳离子氨基酸残基。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的骨架包括“阳离子结构域”或“阳离子嵌段”。阳离子结构域可以广义地理解为寡肽链内具有多个阳离子部分r5，例如至少两个阳离子残基的连续氨基酸残基的区段。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括阳离子结构域，其中所述阳离子结构域包括至少两个、至少三个或至少四个阳离子氨基酸残基。
[0166]
阳离子结构域可以包含，例如，在连续线性序列中具有多个r5阳离子部分的氨基酸残基嵌段(例如，r5r5r5或r
阳离子r阳离子r阳离子
)。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括“阳离子结构域”，其中所述叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括至少两个、至少三个或至少四个具有r5阳离子部分的连续氨基酸残基。
[0167]
在其它实施例中，“阳离子结构域”可以包含相邻氨基酸残基的嵌段，其中所述多个阳离子残基以另外的非阳离子(即中性或脂化)残基为特征，间隔在两个阳离子残基之间，使得嵌段内没有阳离子残基并直接与另一个阳离子残基键合。例如，在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括“阳离子结构域”，其中所述阳离子结构域包括至少两个具有阳离子部分r5的阳离子氨基酸残基，并且其中阳离子结构域内的至少两个阳离子氨基酸残基中的每个阳离子氨基酸残基被至少一个或至少两个具有中性间隔子或脂质部分r4的氨基酸残基隔开。在一些实施例中，非阳离子残基在阳离子结构域内的两个阳离子残基之间以均匀长度的规则间隔间隔交错。在其中阳离子结构域包括在阳离子残基之间交错的非阳离子残基的一些实施例中，阳离子结构域可以描述为包括重复(二聚体、三聚体、四聚体等)亚基的结构域。这些亚基可以包含但不限于-r
阳离子r中性-、-r
阳离子r中性r中性-、-r
阳离子r脂质-、-r
阳离子r脂质r脂质-、-r
脂质r阳离子r脂质-、-r
脂质r脂质r阳离子-、-r
阳离子r中性r脂质-或-r
阳离子r脂质r中性-。在其它实施例中，非阳离子残基散布在阳离子结构域内的两个阳离子残基之间，其中每对阳离子残基之间具有不同数量的非阳离子残基。在其中阳离子结构域包括散布在阳离子残基之间的非阳离子残基的某些实施例中，每对阳离子残基独立地被至少一个非阳离子残基隔开。在一些实施例中，一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的
至少一种包括至少一个三聚体亚基-r
阳离子-r
中性-r
中性
。在其它实施例中，一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的至少一种包括至少一个三聚体亚基-r
阳离子-r
中性-r
脂质
。
[0168]
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括阳离子结构域的一些实施例中，每个r5为在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽包括阳离子结构域的其它实施例中，每个阳离子部分r5为并且每个中性间隔子部分为在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽包括包含一个或多个二聚体或三聚体亚基的阳离子结构域的某些实施例中，每个阳离子部分r5为并且每个中性间隔子部分为在仍其它实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽包括包含一个或多个三聚体亚基-r
阳离子r中性r中性-的阳离子结构域，其中每个阳离子部分r5为并且每个中性间隔子部分为在又其它实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽包括至少一个三聚体亚基-r
阳离子r中性
r脂质-，其中每个阳离子部分r5为并且每个中性间隔子部分为
[0169]
如本文所描述的，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以包括一种或多种不同的阳离子部分(r
阳离子1
、r
阳离子2
、r
阳离子3
等)、一种或多种不同的中性间隔子部分(r
中性1
、r
中性2
、r
中性3
等)和/或一种或多种不同的脂质部分(r
脂质1
、r
脂质2
、r
脂质3
等)。应当认识到，上述通用阳离子和中性间隔子氨基酸残基的序列或布置的实例并非旨在限制本公开的肽化合物。可以以如上文所描述的随机、交替或嵌段序列存在的阳离子、中性间隔子和脂质部分也可以存在于较大嵌段或交替结构基序内的单独阳离子部分、中性部分和脂质部分的特定序列中。例如，残基的一些示例性布置可以包含但不限于以下：r
阳离子1r中性1r中性1r脂质1r阳离子1r中性1r中性1r脂质1r阳离子1r中性1r中性1
、r
阳离子1r中性1r中性1r阳离子1r中性1r中性1r阳离子1r中性1r中性1r脂质1r脂质1
、r
脂质1r阳离子1r中性1r脂质1r阳离子1r中性1-r
脂质2r阳离子2r中性2r脂质2r阳离子2r中性2
、r
脂质1r脂质2r脂质3r脂质4r中性1r中性2r阳离子1r中性1r中性2r脂质1r脂质2r脂质3r脂质4
或r
脂质1r脂质2r脂质1r脂质2r阳离子1r中性1r阳离子1r中性1r脂质1r脂质2r脂质1r脂质2
。
[0170]
侧链官能化和肽缀合物化合物
[0171]
如上文所描述的，寡肽骨架主要包括具有侧链部分的氨基酸残基，所述侧链部分存在于天然或非天然存在的氨基酸(ra和rb)上，在n位具有阳离子、中性间隔子或脂质部分(r4和r5)。
[0172]
一方面，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的ra、rb、r4和r5基团可以进一步包括可以用于与治疗剂和/或靶向元件，如小分子或抗体共价结合的反应性连接基。这些另外的官能团还可以包括与合成或脱保护条件不相容的或无法获得合适的保护基团策略(例如聚胺)的阳离子基团(如酸不稳定接头)。反应性基团可以，例如，通过本领域已知的化学方法在n位处连接到现有侧链ra和/或rb或r5处的阳离子部分、r4处的中性间
隔子或脂质部分。可替代地，如果具有期望的反应性部分的ra、rb、r4或r5基团可作为对应的游离胺商购获得，则可在肽链的一般合成期间(例如，在亚单体合成期间)掺入对应的游离胺。
[0173]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽包括一个或多个氨基酸残基，所述一个或多个氨基酸残基包括反应性基团或连接基。合适的反应性基团可以包含但不限于酯、酰胺、异氰酸酯、硫醇或“点击”化学相容部分(例如，叠氮基、炔基)。
[0174]
另一方面，本公开进一步提供作为阳离子化合物的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，其中所述肽化合物与治疗剂和/或靶向元件共价结合或缀合。在某些实施例中，治疗剂和/或靶向元件是小分子、肽序列、抗体或抗体片段、适体、单糖或寡糖(例如，半乳糖)或聚糖。
[0175]
对某些生理条件环境敏感或在某些生理条件环境下不稳定的连接基或键可以用于实现靶向递送到某些器官或细胞，然后选择性释放治疗剂和/或聚阴离子材料到细胞中。此外，不稳定的连接也可促进在递送聚阴离子材料后从细胞(或器官，或全身)中消除和清除叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子化合物。在某些实施例中，选择连接基使得叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与治疗剂或靶向元件之间的共价键是水解不稳定的、化学不稳定的、ph不稳定的、光不稳定的、热不稳定的或酶促的可裂解的。
[0176]
末端(封端)残基和保护端基
[0177]
如本文所描述的，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括寡肽骨架，所述寡肽骨架在其n端和/或c端处被用脂质部分n-取代(“n-脂化”)和/或用低聚乙二醇和/或聚乙二醇n-取代(“n-聚乙二醇化”)的氨基酸残基封端。阳离子肽化合物的n-脂化赋予化合物以及在化合物与聚阴离子物质之间形成的任何复合物有利的亲脂性。n-聚乙二醇化提供了对体内颗粒形成和聚集的更大控制。n端和c端的末端氨基和羧酸部分可以进一步用保护端基封端。
[0178]
如本文所描述的，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以包括n-脂化和/或n-聚乙二醇化氨基酸残基。本文提供的阳离子肽化合物包括至少一个n-脂化或n-聚乙二醇化氨基酸残基。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基脂化阳离子肽化合物。在其它实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基聚乙二醇化阳离子肽化合物。在仍又其它实施例中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化和n-聚乙二醇化氨基酸残基两者。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子肽化合物。
[0179]
脂质部分
[0180]
如上文所描述的，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以包括在n端和/或c端处的氨基酸残基，其中所述氨基酸残基被脂质部分n-取代，或“n-脂化”。在本文所描述的阳离子肽化合物的n端和/或c端掺入n-脂化氨基酸残基增加了化合物的亲脂性。阳离子肽化合物增加的亲脂性增强了其对疏水环境如细胞膜的脂质双层的亲和力，因此增加了叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和其与聚阴离子化合物的任何复合物的被运送到细胞中的倾向。
[0181]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是n-脂化的。在一
些实施例中，本公开的叔胺脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在n端包括n-脂化氨基酸残基。在其它实施例中，本公开的叔胺脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在c端包括n-脂化氨基酸残基。在某些实施例中，本公开的叔胺脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在n端和c端包括n-脂化氨基酸残基。
[0182]
在一些实施例中，本文所描述的阳离子肽化合物的n端处的n-脂化氨基酸残基的数量由n表示。在其它实施例中，本文所描述的阳离子肽化合物的n端处的n-脂化氨基酸残基的数量由s表示。
[0183]
在一些实施例中，n为从0到8的整数。在某些实施例中，n为0到5的整数。在其它实施例中，n为整数0、1、2、3、4、5、6或7。在一些实施例中，n为小于或等于4的整数。在又其它实施例中，n为整数1、2、3或4。在某些实施例中，n为4。在一些实施例中，s为0到8的整数。在某些实施例中，s为0到5的整数。在其它实施例中，s为整数0、1、2、3、4、5、6或7。在一些实施例中，s为小于或等于4的整数。在仍其它实施例中，s为整数1、2、3或4。在某些实施例中，s为4。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是n-脂化的一些实施例中，n或s中的至少一个是非零的。在一些实施例中，n为非零的。在某些实施例中，n为非零的，并且s为0。在其它实施例中，t为非零的。在某些实施例中，s为非零的，并且n为0。在某些实施例中，n和s两者均为非零的。
[0184]
在一些实施例中，n和s之和是1到8、2到7或4到6的整数。在其它实施例中，n和s之和为至少2、至少3或至少4。
[0185]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化残基嵌段或“n-脂质嵌段”，其中所述叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽包括至少两个、至少三个或至少四个彼此相邻的n-脂化残基(例如，r
脂质r脂质r脂质
)。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化残基嵌段，其中n为至少2、至少3或至少4。在其它实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化残基嵌段，其中s为至少2、至少3或至少4。
[0186]
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽中的n-脂化氨基酸残基是被脂质部分r3进行n-取代的。本公开的脂质部分可以包含中性的疏水或亲脂部分(即，不带电荷或净电荷为零)。本文所描述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子化合物的脂质部分可以是天然或合成衍生的。每个r3独立地是脂质部分，其可以相同或不同。在一些实施例中，每个r3是相同的。在其它实施例中，每个r3是不同的。在其中n和s之和为至少2(即，n+s≥2)的仍又其它实施例中，脂质部分r3中的至少两个脂质部分彼此不同。
[0187]
应当认识到，n-脂化氨基酸残基的特定序列或布置可以对改善与核酸的复合和递送特别有用。例如，在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子化合物包括具有两个不同脂质部分r
3a
和r
3b
之一的一组混合n-脂化氨基酸残基的一些实施例中，n-脂化氨基酸残基可以布置在交替序列或嵌段序列中的n端或c端上。n-脂化氨基酸残基的交替序列的一个实例可以由r
3a-r
3b-r
3a-r
3b
或r
3b-r
3a-r
3b-r
3a
表示。嵌段序列的实例可以由r
3a-r
3a-r
3b-r
3b
或r
3b-r
3b-r
3a-r
3a
表示。在其它实施例中，n-脂化氨基酸残基的序列可以随机排序。应当认识到，上述两个n-脂化氨基酸残基的序列或布置的实例并非旨在是限制性的。此外，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以包括两个或更多个不同的r3脂质部分，其可以如上文总体上描述的以随机、交替或嵌段序列存在。
[0188]
合适的脂质部分可以包含例如任选地经取代的支链或直链脂肪族部分，或衍生自天然脂质化合物(包含脂肪酸、甾醇和类异戊二烯)的任选地经取代的部分。
[0189]
在一些实施例中，脂质部分可以包含具有约6到约50个碳原子或约10到约50个碳原子，任选地包括一个或多个杂原子，并且任选地包括一个或多个双或三键(即，饱和或单不饱和或多不饱和)的支链或直链脂肪族部分。在某些实施例中，脂质部分可以包含任选地经取代的脂肪族、直链或支链部分，每个疏水尾独立地具有约8到约30个碳原子或约6到约30个碳原子。在某些实施例中，脂质部分可以包含例如衍生自脂肪酸和脂肪醇的脂肪族碳链。在一些实施例中，每个r3独立地为c
8-c
24
烷基或c
8-c
24
烯基，其中所述c
8-c
24
烯基任选地是单不饱和的或多不饱和的。在一些实施例中，每个r3为c
6-c
18
烷基或c
6-c
18
烯基。在某些实施例中，每个脂质部分r3是c
6-c
18
烷基或c
6-c
18
烯基，其中所述c
6-c
18
烯基是单不饱和的。在某些其它实施例中，每个脂质部分r3为c
6-c
17
烷基或c
6-c
17
烯基。在某些实施例中，每个r3为c
8-c
12
烷基。在仍其它实施例中，每个r3为c
10-烷基，如正癸基。在一些实施例中，每个r3独立地选自由以下组成的组：2-乙基己-1-基、辛酰基、己酰基、油烯基、硬脂酰基、亚油烯基、肉豆蔻基和月桂基。在其它实施例中，每个脂质部分r3独立地选自由以下组成的组：2-乙基己-1-基、己酰基、油烯基、硬脂酰基、亚油烯基、肉豆蔻基和月桂基。在某些实施例中，每个脂质部分r3独立地选自由以下组成的组：2-乙基己-1-基、己酰基、油烯基、肉豆蔻基和月桂基。在其它实施例中，每个r3独立地选自由以下组成的组：油烯基、硬脂酰基、亚油烯基、肉豆蔻基和月桂基。
[0190]
在可以与前述实施例中的任何实施例组合的又其它实施例中，每个r3独立地为
[0191]
在一些实施例中，每个r3独立地为具有约6到50个碳原子的支链或直链脂肪族部分。在某些实施例中，每个r3独立地为直链脂肪族部分。在某些其它实施例中，每个r3独立地为支链脂肪族部分。在其中n和s之和为至少2(即，n+s≥2)的仍又其它实施例中，每个r3独立地是支链或直链脂肪族部分并且脂质部分r3中的至少两个脂质部分彼此不同(r
3a
和r
3b
)。在一些实施例中，脂质部分r3为，两个不同脂质部分r
3a
和r
3b
之一。在其中n和s之和为至少2(即，n+s≥2)的其它实施例中，至少一个r3是或包括支链脂肪族部分并且至少一个r3是或包括直链脂肪族部分。在一些实施例中，至少一个脂质部分r3(或r
3a
或r
3b
)是支链脂肪族部分。
在可以与前述实施例中的任何实施例组合的某些实施例中，至少一个脂质部分r3(或r
3a
或r
3b
)是2-乙基己-1-基。
[0192]
在可以与前述实施例中的任何实施例组合的仍又其它实施例中，每个r3独立地为式的脂质，其中r8是具有约6到约50个碳原子或约10到约50个碳原子，任选地包括一个或多个杂原子，并且任选地包括一个或多个双键或三键的支链或直链脂肪族部分。在某些实施例中，每个r3独立地为独立地为
[0193]
用于实施本发明的天然脂质部分可以衍生自例如磷脂、甘油酯(如甘油二酯或甘油三酯)、糖基甘油酯、鞘脂、神经酰胺以及饱和和不饱和甾醇、类异戊二烯等天然脂质。
[0194]
其它合适的脂质部分可以包含亲脂性碳环或芳香族基团，如任选地经取代的芳基、环烷基、环烷基烷基或芳烷基部分，包含例如萘基或乙基苄基，或包括酯官能团的脂质，包含例如甾醇酯和蜡酯。在仍其它实施例中，脂质部分r4为
[0195]
乙二醇部分
[0196]
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽可以包括在n端和/或c端处被乙二醇的低聚物或聚合物n-取代的(即，用低聚乙二醇和/或聚乙二醇进行n-取代的)封端氨基酸残基。将低聚和/或聚乙二醇部分掺入到本文所描述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以促进与核酸形成的复合物的颗粒稳定性并预防体内颗粒聚集。
[0197]
应当认识到，术语“聚乙二醇化”在本文中用于描述包括末端氨基酸残基的阳离子肽化合物，所述末端氨基酸残基可以用低聚乙二醇或聚乙二醇或其组合进行n-取代。在一些实施例中，本文提供的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是n-聚乙二醇化的。
[0198]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在n端处包括n-聚乙二醇化氨基酸残基，如下式(i)的片段所示：
[0199][0200]
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在n端处包括n-聚乙二醇化氨基酸残基的某些实施例中，m表示在n端处的n-聚乙二醇化氨基酸残基的数量，并且每个r2独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)
ur2a
的乙二醇部分，其中r
2a
为-h或c
1-c4烷基。在一些实施例中，r
2a
为
–
h、-ch3或ch2ch3。在某些实施例中，r
2a
为
–
h。在其它实施例中，r
2a
为-ch3。在仍又其
它实施例中，r
2a
为
–
ch2ch3。
[0201]
在一些实施例中，m为0到15的整数、0到10的整数、0到3的整数、4到10的整数或4到15的整数。在一些实施例中，每个u独立地为1到200的整数、2到200的整数、2到100的整数、2到50的整数、50到200的整数、50到100的整数、100到200的整数或150到200的整数。
[0202]
在某些实施例中，m为0到3的整数，并且每个u为20到200，或任选地30到50的整数。在某些实施例中，m为0到3的整数，并且u为40到45的整数。在仍又其它实施例中，m为1，并且u为40到45的整数。在其它实施例中，m为4到10的整数时，并且每个u为2到10的整数。在某些实施例中，m为4到10的整数，并且u为2到5的整数。在仍又其它实施例中，m为7到10的整数，并且u为3。在其它实施例中，m为4到15的整数时，并且每个u为2到10的整数。在某些实施例中，m为4到15的整数，并且u为2到5的整数。在一些实施例中，m为10到15的整数，并且u为1到10的整数。在某些实施例中，m为10到15的整数，并且u为1到5的整数。在其它实施例中，m为10到15的整数，并且u为2到10的整数。在某些实施例中，m为10到15的整数，并且u为2到5的整数。
[0203]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在c端处包括n-聚乙二醇化氨基酸残基，如下式(i)的片段所示：
[0204][0205]
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在c端处包括n-聚乙二醇化氨基酸残基的某些实施例中，t表示在n端处的n-聚乙二醇化氨基酸残基的数量，并且每个r6独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)
vr6a
的乙二醇部分，其中r
6a
为-h或c
1-c4烷基。在一些实施例中，r
6a
为
–
h、-ch3或ch2ch3。在某些实施例中，r
6a
为
–
h。在其它实施例中，r
6a
为-ch3。在仍又其它实施例中，r
6a
为
–
ch2ch3。
[0206]
在一些实施例中，t为0到15的整数、0到10的整数、0到3的整数、4到10的整数或4到15的整数。在一些实施例中，每个v独立地为1到200的整数、2到200的整数、2到100的整数、2到50的整数、50到200的整数、50到100的整数、100到200的整数或150到200的整数。
[0207]
在一些实施例中，t为0到3的整数时，并且每个v为30到50的整数。在某些实施例中，t为0到3的整数，并且v为40到45的整数。在仍又其它实施例中，t为1，并且v为40到45的整数。在其它实施例中，t为4到10的整数时，并且每个v为2到10的整数。在某些实施例中，t为4到10的整数，并且v为2到5的整数。在仍又其它实施例中，t为7到10的整数，并且v为3。在其它实施例中，t为4到15的整数时，并且每个v为2到10的整数。在某些实施例中，t为4到15的整数，并且v为2到5的整数。在一些实施例中，t为10到15的整数，并且v为1到10的整数。在某些实施例中，t为10到15的整数，并且v为1到5的整数。在其它实施例中，t为10到15的整数，并且v为2到10的整数。在某些实施例中，t为10到15的整数，并且v为2到5的整数。
[0208]
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是n-脂化的一些实施例中，m或t中的至少一个是非零的。在一些实施例中，m为非零的。在其它实施例中，t是非零的。在某些实施例中，m和t两者均为非零的。
[0209]
n-脂化和/或n-聚乙二醇化
[0210]
如本文所描述的，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以包
括n-脂化和/或n-聚乙二醇化氨基酸残基。本文提供的阳离子肽化合物包括至少一个n-脂化或n-聚乙二醇化氨基酸残基。在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的一些实施例中，m、n、s或t中的至少一个是非零的。
[0211]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基脂化阳离子肽化合物，其中n和s中的至少一个是非零的。在某些实施例中，n和s两者均为非零的。在仍某些实施例中，式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是式(ia)叔氨基脂化阳离子肽化合物：
[0212][0213]
其中n和s中的至少一个为非零的，并且其中r1、r3、r4、r5、r7、ra、rb、o、p、q和r如针对式(i)所定义。在式(ia)化合物的某些实施例中，n和s两者均为非零的。
[0214]
在其它实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基聚乙二醇化阳离子肽化合物，其中m和t中的至少一个是非零的。在某些实施例中，m和t两者均为非零的。在某些实施例中，m和t两者均为非零的。在其它实施例中，式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是式(ib)叔氨基聚乙二醇化阳离子肽化合物：
[0215][0216]
其中m和t中的至少一个为非零的，并且其中r1、r2、r4、r5、r6、r7、ra、rb、o、p、q和r如针对式(i)所定义。在式(ib)化合物的某些实施例中，m和t两者均为非零的。
[0217]
在仍又其它实施例中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化和n-聚乙二醇化氨基酸残基两者。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子肽化合物。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子肽化合物的某些实施例中，m和t中的至少一个为非零的，并且n和s中的至少一个为非零的。
[0218]
在仍另外的实施例中，式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是式(ic)叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子肽化合物：
[0219][0220]
其中m和t中的至少一个为非零的，并且n和s中的至少一个为非零的，并且其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、ra、rb、o、p、q和r如针对式(i)所定义。
[0221]
在其它实施例中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物还可以包括n-取代的氨基酸残基，所述氨基酸残基在n端或c端具有提供与n-聚乙二醇化残基类似
的屏蔽效果的其它中性屏蔽聚合物或部分。这些可以包含此类实例，如羟烷基、透明质酸、多糖、多磷酸盐和多磷酸酯、聚(乙烯基吡咯烷酮)、多元醇、亲水多肽或其它合成亲水聚合物。
[0222]
n端和c端端基
[0223]
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以分别以其游离胺和游离酸形式或以受保护形式提供n端和c端。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在n端和/或c端残基处包括另外的保护或封端基团。
[0224]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在n端残基处包括保护或封端基团r1。在一些实施例中，r1为-h、烷基、烷基芳基、-cor
1a
、-ch
2-cor
1a
、阳离子部分、脂质部分或低聚乙二醇或聚乙二醇部分，其中r
1a
为-h、-oh、烷基、芳基、烷基芳基、-o-烷基、-o-烷基芳基或脂质部分。在某些实施例中，r1为-h、烷基、烷基芳基、-cor
1a
或脂质部分，其中r
1a
为-h、-oh、烷基、芳基、烷基芳基、-o-烷基或-o-烷基芳基。在其中r1为脂质部分的某些实施例中，脂质部分不是磷脂。在其中r1为烷基或-cor
1a
其中r
1a
为烷基的仍其它实施例中，烷基任选地被-oh或卤基取代。
[0225]
在其它实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在c端残基处包括保护或封端基团r7。在一些实施例中，r7为-h、烷基、酰基、-oh、-or
7a
、-nh2、-nhr
7a
、阳离子部分、脂质部分或低聚乙二醇或聚乙二醇部分，其中r
7a
为烷基、酰基或脂质部分。在一些实施例中，r7为-h、烷基、酰基、-oh、-or
7a
、-nh2、-nhr
7a
或脂质部分，其中r
7a
为烷基、酰基或脂质部分。在其中r7为脂质部分的某些实施例中，脂质部分不是磷脂。
[0226]
在仍另外的实施例中，可以选择或进一步修饰叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的n端和c端，使得r1和r7具有另外的官能团，如反应性连接基。
[0227]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽的r1和/或r7独立地包括一个或多个反应性连接基。合适的反应性基团可以包含但不限于酯、酰胺、异氰酸酯、硫醇或“点击”化学相容部分(例如，叠氮基、炔基)。
[0228]
反应性连接基进而可以用于将其它有用的化合物(包含靶向元件或治疗剂)与肽化合物共价结合。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与治疗剂和/或靶向元件共价结合或缀合。在某些实施例中，治疗剂和/或靶向元件是小分子、抗体或抗体片段。
[0229]
另外，r1和r7的另外的官能团还可以包括与合成或脱保护条件不相容的或无法获得合适的保护基团策略(例如聚胺)的阳离子基团(如酸不稳定接头)。在又另外的实施例中，r1为聚胺。在其中r1是聚胺的一些实施例中，聚胺为是聚胺的一些实施例中，聚胺为
在某些实施例中，聚胺选自由以下组成的组：在某些实施例中，聚胺选自由以下组成的组：
[0230]
如上文所描述的，对某些生理条件环境敏感或在某些生理条件环境下不稳定的连接基或键可以促进将聚阴离子材料靶向递送到特定细胞并改善某些药代动力学性质，如消除。在某些实施例中，选择连接基使得叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与治疗剂或靶向元件之间的共价键是水解不稳定的、化学不稳定的、ph不稳定的、光不稳定的、热不稳定的或酶促的可裂解的。
[0231]
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的组合
[0232]
本公开的复合物和组合物可以包括一种或多种阳离子化合物。在一些实施例中，本文所描述的复合物可以包括一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物。在单一复合物中使用本公开的多种阳离子肽化合物的混合物和组合可以制备针对特定药代动力学和药效学性质定制的调配物。相关的药代动力学和药效学性质可以包含但不限于生物分布、免疫原性、调配物稳定性、包封百分比、转染效率、血浆半衰期等。不同的应用可能需要这些性质的不同组合。
[0233]
例如，在某些实施例中，复合物或组合物可以包括一种或多种富含阳离子的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与是高度脂化的和/或含有至少一个peg部分的一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的组合。理论上，此类组合可以通过提供更大的电荷稳定性(通过富含阳离子的肽化合物)以及更大的亲脂性屏蔽(通过脂化肽化合物)来赋予改善的聚阴离子化合物的递送。应当进一步认识到，可以调整单独的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的每种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的单独的量以实现期望的性质。
[0234]
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的合成
[0235]
另一方面，本文提供了制备本文所描述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的方法。
[0236]
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以在不需要另外的连接物质以将脂质部分与寡肽核心缀合的情况下合成。对于本文所描述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，脂质部分和乙二醇部分与肽本身内的氮原子共价且直接结合，也就是说，在氨基酸残基中的酰胺氮或n位处。因此，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽可以完全通过本领域已知的用于在肽链中产生n-取代的残基的方法来合成。
[0237]
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以通过对每个要添加的氨基酸残基进行一系列酰化(酰胺化)和亲核置换(胺化)反应来制备，无论残基是否具有阳离子、中性、脂质，或n位上的低聚/聚乙二醇部分。本文所描述的阳离子肽化合物是通过向肽链连续添加单独的残基来合成的。残基的顺序添加可以重复进行，直到达到期望的氨基酸序列和
长度。
[0238]
本发明的化合物可以通过固相法和溶液相法来合成。用于通过固相合成制备n-取代的肽(包含本文所描述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物)的示例性方法在下文讨论并在图3a-3e中示出。
[0239]
如图3a所示，在合成开始时提供具有末端仲胺的固体树脂载体。将酰化剂与合适的肽偶联试剂和溶剂一起添加到末端仲胺中，以在末端仲胺与酰化剂之间形成酰胺键。酰化剂优选地是乙酰化剂。酰化剂包括至少两个合适的离去基团以促进α-碳处的酰胺化和随后的胺化。在某些实施例中，酰化剂是卤基乙酸。在其它实施例中，酰化剂是溴乙酸。
[0240]
在图3b中，图3a中产生的酰化产物与期望的经取代的伯胺或仲胺反应以提供对应的n-取代的末端氨基酸残基。所选伯胺或仲胺取代α-碳上的离去基团，如溴乙酸中的溴，以产生对应的胺化产物。在一些实施例中，伯胺或仲胺是选自由以下组成的组的胺：nhr
p
r2、nhr
p
r3、nhr
p
r4、nhr
p
r5和nhr
p
r6，其中r
p
为
–
h或保护基，并且其中r2、r3、r4、r5和r6如针对如本文所描述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物所定义。
[0241]
连续重复酰胺化和胺化反应(图3c)，直到获得期望的肽序列(图3d)。应当认识到，制备如本文所描述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的方法可以进一步包括保护和去保护步骤以在连续的酰胺化/胺化反应过程中，防止与肽链中的反应性部分发生任何不期望的反应。例如，保护基团r
p
可以在合成期间沿本文所描述的肽化合物的任何位置添加到α-碳和/或n-取代基的侧链。合适的保护基团r
p
可以包含本领域已知的任何保护基团，特别是适合于正交保护方案中的肽合成的那些，如boc/bzl或fmoc/tbu。
[0242]
可以通过本领域已知的方法在n端和c端(r1和r7)掺入端基以及对端基和/或沿着寡肽骨架的氨基酸残基(ra、rb、r4、r5)的侧链进行官能化。本领域普通技术人员将认识到，相对于整个固相合成而言，合适方法的选择和另外的官能化步骤的时间安排将取决于要添加的端基和/或连接基，以及所述方法与肽化合物上存在的其它部分和/或保护基团的相容性。
[0243]
根据在如上文所描述的合成中使用的任何保护方案，在合适的反应条件下，如包含盐酸、氢溴酸或三氟乙酸的酸性条件下，将期望的肽化合物从固体树脂载体上切割(图3e)。从固体树脂载体上切割叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物在溶液中产生对应的游离阳离子肽化合物。
[0244]
可以进行进一步的步骤以从溶液中分离和纯化阳离子肽化合物，包含例如从固体树脂载体过滤含肽的溶液和冷冻干燥分离的滤液以提供固体产物。
[0245]
由于用于实现树脂切割的酸性条件，应当认识到叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以以对应的酸式盐形式存在。例如，在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物是其盐形式。在某些实施例中，盐形式是酸加成盐。在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的盐是盐酸盐(盐酸加成盐)、氢溴酸盐(氢溴酸加成盐)或三氟乙酸盐(三氟乙酸加成盐)。在某些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的盐是叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的三氟乙酸加成盐或三氟乙酸盐。
[0246]
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的酸加成盐形式可以通过本领域中的方法(例如离子交换)进一步修饰以获得一种或多种药学上可接受的盐形式。短语“药学
上可接受的”指示物质或组合物必须在化学和/或毒理学上与包括调配物的其它成分和/或施用调配物的受试者相容。术语“药学上可接受的酸加成盐”可以包含但不限于与无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸和有机酸形成的那些药学上可接受的盐，所述有机酸选自以下：脂肪族、脂环族、芳香族、芳基脂肪族、杂环族、羧酸和磺酸类有机酸，如甲酸、乙酸、丙酸、葡萄糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、苯甲酸、苯乙酸、甲磺酸“甲磺酸盐”、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。
[0247]
在一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的盐是药学上可接受的盐。在某些实施例中，盐是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、抗坏血酸盐、谷氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、对甲苯磺酸盐或水杨酸盐。
[0248]
类脂
[0249]
在一些实施例中，本文所描述的复合物和组合物的一种或多种阳离子化合物包括一种或多种阳离子类肽-磷脂缀合物构建体，也被称为类脂。类脂是n取代的聚甘氨酸化合物(也被称为“类肽”)，其在甘氨酸残基的n位沿类肽骨架具有阳离子和/或中性侧链的组合，其进一步与类肽链的单末端磷脂基团缀合。类脂和其合成通常在以下中进行了描述：simon r.j.等人,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》89,9367-9371(1992)；lobo,b.a.；vetro,j.a.；suich,d.m.；zuckermann,r.n.；middaugh,c.r.类肽/类脂的结构/功能分析：dna复合物(structure/function analysis of peptoid/lipitoid:dna complexes.)《药物科学杂志(journal of pharmaceutical sciences)》2003,92(9),1905
–
1918；以及utku,y.；dehan,e.；ouerfelli,o.；piano,f.；zuckermann,r.n.；pagano,m.；kirshenbaum,k.一种用于高效基因沉默的拟肽sirna转染试剂(a peptidomimetic sirna transfection reagent for highly effective gene silencing.)《分子生物系统(molecular biosystems)》2006,2(6
–
7),312。示例性类脂是如图1所示的九聚体“类脂1”。类脂化合物的通用结构如下式(ii)所示，其中x是1到100的整数，每个r9独立地为脂质部分并且每个r
10
独立地为阳离子或中性部分。
[0250][0251]
在上述式(ii)中，x为1到100的整数。特定数量的残基可以特别适用于本文所描述的复合物和组合物中。例如，在一些实施例中，x为1到50、2到25或3到15的整数。
[0252]
如上文式(ii)所示，r9表示脂质部分，所述脂质部分包含但不限于包含具有约6到约50个碳原子或约10到约50个碳原子，任选地包括一个或多个杂原子，并且任选地包括一
个或多个双或三键(即，饱和或单不饱和或多不饱和)的支链或直链脂肪族部分。在某些实施例中，脂质部分r9可以包含任选地经取代的脂肪族、直链或支链部分，每个疏水尾独立地具有约8到约30个碳原子或约6到约30个碳原子。在某些实施例中，脂质部分可以包含例如衍生自脂肪酸和脂肪醇的脂肪族碳链。在一些实施例中，每个脂质部分r9独立地为c
8-c
24
烷基或c
8-c
24
烯基，其中所述c
8-c
24
烯基任选地是单不饱和的或多不饱和的。在其它实施例中，每个脂质部分r9独立地选自由以下组成的组：油烯基、硬脂酰基、亚油烯基、肉豆蔻基和月桂基。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的又其它实施例中，每个脂质部分r9独立地为地为
[0253]
在氨基甘氨酸残基的n-位处的基团r
10
包含阳离子部分和中性部分，所述阳离子部分和中性部分与上文描述的用于叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的那些类似。
[0254]
阳离子或带正电荷的部分可以包含例如基于氮的取代基，如含有以下官能团的那些：氨基、胍基、酰肼基和脒基。这些官能团可以是芳香族、饱和环状或脂肪族。在类脂的一些实施例中，每个阳离子部分独立地为氨基烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基氨基烷基、胍基烷基或n-杂环基烷基。在其它实施例中，每个阳离子部分独立地为杂环基烷基。在其它实施例中，每个阳离子部分独立地为
在某些实施例中，每个阳离子部分独立地选自由以下组成的组：成的组：在仍其它实施例中，每个阳离子部分为
[0255]
中性部分可以包含但不限于被环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基取代的c
1-c4烷基，其中每个环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基任选地被一个或多个取代基-oh、卤基或烷氧基取代。在类脂的一些实施例中，每个中性部分独立地选自由以下组成的组：在某些实施例中，每个中性间隔子部分为在仍其它实施例中，每个中性间隔子部分为
[0256]
在仍其它实施例中，每个阳离子部分为并且每个中性间隔子部分为在又另外的实施例中，一种或多种类脂包括类脂1。
[0257]
与上述叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物类似，本文所描述的类脂可以包含可以以随机序列布置的氨基酸残基，或以交替序列或嵌段序列布置的重复基序。在一些实施例中，式(ii)类脂可以包括在x残基链内的重复(二聚体、三聚体、四聚体等)亚基。这些亚基可以包含但不限于-r
阳离子r中性-或-r
阳离子r中性r中性-，其中r
阳离子
是包括阳离子部分的氨基酸残基并且每个r
中性
是包括中性间隔子部分的氨基酸残基。在其它实施例中，式(ii)类脂包括至少一个三聚体亚基-r
阳离子-r
中性-r
中性
，并且其中r
阳离子
是包括阳离子部分的氨基酸残基并且每个r
中性
是包括中性间隔子部分的氨基酸残基。
[0258]
在其中式(ii)类脂包括阳离子结构域的一些实施例中，每个阳离子部分r
10
为在前述实施例中的其它实施例中，每个阳离子部分r
10
为并且每个中性间隔子部分r
10
为在某些实施例中，式(ii)类脂包括一个或多个二聚体或三聚体亚基，其中每个阳离子部分为并且每个中性间隔子部分为
在仍其它实施例中，式(ii)类脂包括包含一个或多个三聚体亚基-r
阳离子r中性r中性-的阳离子结构域，其中r
阳离子
是包括阳离子部分的氨基酸残基并且每个r
中性
是包括中性间隔子部分的氨基酸残基，其中每个阳离子部分为并且其中每个中性间隔子部分为
[0259]
与叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物一样，本文所描述的复合物和组合物可以包括一种或多种类脂。在某些实施例中，一种或多种阳离子化合物包括一种或多种类脂。在其它实施例中，一种或多种阳离子化合物包括类脂1。
[0260]
脂质样阳离子化合物
[0261]
在仍其它实施例中，本文所描述的复合物和组合物的一种或多种阳离子化合物可以包括一种或多种脂质样阳离子化合物。
[0262]
脂质样阳离子化合物是包括一种或多种可电离(阳离子)含氮部分和一种或多种亲脂尾部的两亲化合物。脂质样阳离子化合物交替地被称为“阳离子脂质”或“可电离脂质”。脂质样阳离子化合物中的可电离(阳离子)部分可以包含在合适的生理ph水平下被电离成带正电荷的部分的中性叔胺。可替代地，可电离(阳离子)原子可以是季铵基团，作为带正电荷的基团与合适的抗衡离子一起提供。亲脂性尾部可以包含例如包含具有约6到约50个碳原子或约10到约50个碳原子，任选地包括一个或多个杂原子，并且任选地包括一个或多个双或三键(即，饱和或单不饱和或多不饱和)的支链或直链脂肪族部分。
[0263]
脂质样阳离子化合物的实例在美国专利公开us2018/0147166a1中描述并如下式(iii)所示。
[0264]
在一些实施例中，一种或多种阳离子化合物包括一种或多种式(iii)脂质样阳离子化合物：
[0265][0266]
其中每个r
11
独立地为经取代的或未经取代的烷基；每个r
12
独立地为经取代的或未经取代的烷基；每个r
13
独立地为氢或经取代的或未经取代的烷基；并且每个y独立地为1到8的整数。
[0267]
聚乙二醇化化合物
[0268]
如本文所描述的，本公开的复合物和组合物包括一种或多种聚乙二醇化化合物，
如聚乙二醇化脂质或具有peg(以及任选地还有脂质)官能团的化合物。本文所描述的聚乙二醇化化合物可以可替代地被称为“peg化合物”。将聚乙二醇化化合物掺入到包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种聚阴离子货物的复合物中，通过阻止颗粒聚集、屏蔽颗粒表面电荷和提供针对内源性降解途径(包含例如通过核酸酶的攻击)的保护来促进阳离子化合物-货物的细胞内摄取。
[0269]
聚乙二醇化脂质
[0270]
在一些实施例中，本文所描述的复合物和组合物包括一种或多种聚乙二醇化化合物，其中所述一种或多种聚乙二醇化化合物包括一种或多种聚乙二醇化脂质。应当认识到，术语“聚乙二醇化脂质”也可以互换地被称为“peg脂质”或“peg修饰的脂质”。如本文所描述的，聚乙二醇化脂质可以理解为包含与聚乙二醇部分共价结合的任何脂质或脂质样化合物。
[0271]
用于聚乙二醇化脂质的合适的脂质部分可以包含例如任选地经取代的支链或直链脂肪族部分，或衍生自天然脂质化合物(包含脂肪酸、甾醇和类异戊二烯)的任选地经取代的部分。
[0272]
在一些实施例中，脂质部分可以包含具有约6到约50个碳原子或约10到约50个碳原子，任选地包括一个或多个杂原子，并且任选地包括一个或多个双或三键(即，饱和或单不饱和或多不饱和)的支链或直链脂肪族部分。在某些实施例中，脂质部分可以包含任选地经取代的脂肪族、直链或支链部分，每个疏水尾独立地具有约8到约30个碳原子或约6到约30个碳原子。在某些实施例中，脂质部分可以包含例如衍生自脂肪酸和脂肪醇的脂肪族碳链。在一些实施例中，每个脂质部分独立地为c
8-c
24
烷基或c
8-c
24
烯基，其中所述c
8-c
24
烯基任选地是单不饱和的或多不饱和的。
[0273]
用于实施本发明的天然脂质部分可以衍生自例如磷脂、甘油酯(如甘油二酯或甘油三酯)、糖基甘油酯、鞘脂、神经酰胺以及饱和和不饱和甾醇、类异戊二烯等天然脂质。
[0274]
其它合适的脂质部分可以包含亲脂芳香族基团，如任选地经取代的芳基或芳基烷基部分，包含例如萘基或乙基苄基，或包括酯官能团的脂质，包含例如甾醇酯和蜡酯。
[0275]
在其它实施例中，一种或多种peg脂质选自由以下组成的组：peg修饰的磷脂酰乙醇胺、peg修饰的磷脂酸、peg修饰的神经酰胺、peg修饰的二烷基胺、peg修饰的二酰基甘油、peg修饰的二烷基甘油和其任何组合。
[0276]
在一些实施例中，peg脂质包括peg修饰的甾醇。在某些实施例中，peg脂质包括peg修饰的胆固醇。
[0277]
在一些实施例中，peg脂质是peg修饰的神经酰胺。在某些实施例中，peg修饰的神经胺选自由以下组成的组：n-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]}和n-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]}，以及其任何组合。
[0278]
在一些实施例中，peg修饰的磷脂的磷脂选自由以下组成的组：1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dupc)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1,2-二-o-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1-油酰-2-胆固醇半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷
酸胆碱(c 16溶血pc)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二)碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(me 16.0pe)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二)碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(dopg)、鞘磷脂和其混合物。在某些实施例中，磷脂是dope。
[0279]
在一些实施例中，一种或多种peg脂质包括peg修饰的磷脂酰乙醇。在一些实施例中，peg脂质是选自由以下组成的组的peg修饰的磷脂酰乙醇：peg修饰的dmpe(dmpe-peg)、peg修饰的dspe(dspe-peg)、peg修饰的dppe(dppe-peg)和peg修饰的dope(dope-peg)。
[0280]
在某些实施例中，peg脂质选自由以下组成的组：二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇(dmg-peg)、二硬脂酰甘油-聚乙二醇(dsg-peg)、二棕榈酰甘油-聚乙二醇(dpg-peg)和二油酰甘油-聚乙二醇(dog-peg)。在某些实施例中，peg脂质是dmg-peg。
[0281]
应当进一步认识到，前述peg脂质中的peg链的特定分子量对于掺入到本公开中的复合物中可能是特别有利的。例如，在一些实施例中，peg链的分子量为介于350与6,000g/mol之间、介于1,000与5,000g/mol之间或介于2,000与5,000g/mol之间。在某些实施例中，peg脂质的peg链的分子量为约350g/mol、500g/mol、600g/mol、750g/mol、1,000g/mol、2,000g/mol、3,000g/mol、5,000g/mol或10,000g/mol。在某些其它实施例中，peg脂质的peg链的分子量为约500g/mol、750g/mol、1,000g/mol、2,000g/mol或5,000g/rmol。例如，在某些实施例中，聚乙二醇化脂质是二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000(dmg-peg 2000)。
[0282]
叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子肽
[0283]
在仍另外的实施例中，一种或多种聚乙二醇化化合物包括包含至少一个低聚乙二醇或聚乙二醇部分的式(i)叔氨基聚乙二醇化阳离子肽化合物。由于其在沿着肽链的骨架容纳脂质部分和peg部分两者的灵活性并且取决于器特定取代基的性质，本公开的式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以不仅用作阳离子递送媒剂，而且用作合适的聚乙二醇化化合物以稳定阳离子化合物-聚阴离子化合物复合物。应当认识到，式(i)叔氨基聚乙二醇化阳离子肽化合物可以与其它种类的阳离子化合物如类脂或脂质样化合物以及其它式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物组合。
[0284]
在一些实施例中，聚乙二醇化化合物是如本文所描述的式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，其中m和t中的至少一个为非零的(即，n-聚乙二醇化的)。在仍另外的实施例中，聚乙二醇化化合物是式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，其中m和t独立地为0到15的整数，并且其中m和t中的至少一个为非零的。在一些实施例中，聚乙二醇化化合物是式(ib)叔氨基聚乙二醇化阳离子肽化合物。在又其它实施例中，聚乙二醇化化合物是式(ic)叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子化合物。
[0285]
与上文描述的聚乙二醇化脂质一样，前述叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子肽化合物中的peg链的特定分子量对于掺入到本公开的复合物中可能是特别有利的。例如，在一些实施例中，peg链的分子量为介于350与6,000g/mol之间、介于1,000与5,000g/mol之间或介于2,000与5,000g/mol之间。在某些实施例中，叔氨基脂化和聚乙二醇化阳离子肽化合物的
peg链的分子量为约350g/mol、500g/mol、600g/mol、750g/mol、1,000g/mol、2,000g/mol、3,000g/mol或5,000g/mol。在某些其它实施例中，peg脂质的peg链的分子量为约500g/mol、750g/mol、1,000g/mol、2,000g/mol或5,000g/rmol。
[0286]
然而，应当认识到，式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物可以包括若干个短的低聚乙二醇部分来代替较少的较长的聚乙二醇部分，并为复合物提供类似的颗粒稳定性。在其中聚乙二醇化化合物是式(i)n-聚乙二醇化阳离子肽化合物的一些实施例中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)
ur2a
的至少一个乙二醇部分r2，其中每个r
2a
独立地为
–
h或c
1-c4烷基。在其它实施例中，式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)
vr6a
的至少一个乙二醇部分r6，其中每个r
6a
独立地为
–
h或c
1-c4烷基。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的其中m为非零的一些实施例中，m为0到15的整数，其中每个u独立地为1到200的整数。在可以与前述实施例中的任何实施例组合的其中t为非零的仍另外的实施例中，t为0到15的整数，其中每个v独立地为1到200的整数。
[0287]
在一些实施例中，聚乙二醇化化合物是如本文所描述的式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，其中m和t中的至少一个为非零的，并且n和s中的至少一个为非零的(即，n-脂化的)。在其中式(i)n-聚乙二醇化阳离子肽化合物也是n-脂化的某些实施例中，n和s中的至少一个为非零的。在一些实施例中，n和s之和为至少1、2、3或4。在某些实施例中，s为4。在又另外的实施例中，n为4。
[0288]
聚阴离子化合物和其它递送货物
[0289]
如本文所描述的，本公开的复合物和组合物可以包括与阳离子化合物复合的一种或多种聚阴离子化合物，如核酸。本公开的复合物和组合物包括一种或多种阳离子化合物，如叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物，并且具有聚阴离子化合物的一种或多种聚乙二醇化脂质可以用于将聚阴离子化合物如核酸递送到细胞内部。除了聚阴离子货物外，本文提供的复合物和组合物还可以用于细胞内递送多种非阴离子货物。根据要递送到细胞中的聚阴离子和非阴离子化合物或货物，本文提供的复合物和组合物可以用于许多不同的应用，包含例如疫苗接种和基因疗法。
[0290]
在一些实施例中，所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸。如本文所用，核酸包含天然存在的核酸，如dna、rna和/或其杂合体，以及具有非天然骨架和经修饰的骨架键如硫代磷酸酯、非天然和经修饰的碱基以及非天然和经修饰的末端的非天然存在的变异。示例性核酸包含基因组dna、cdna、mrna、mirna和sirna。
[0291]
核酸可以是重组产生的或化学合成的分子。核酸可以是单链、双链、三链和四链以及更复杂的三维形式，包含单链和双链区域。
[0292]
取决于核酸的类型，核酸的长度(以核苷酸单位或碱基对(bp)适当定义)可能会有所不同。在其中核酸是mrna的一些实施例中，mrna可以具有100到10,000个核苷酸单位，或1,000到3,000个核苷酸单位。在其中核酸是dna的其它实施例中，dna可以具有5,000bp到20,000bp，或约10,000bp。
[0293]
在其中核酸是mrna的一些实施例中，mrna是对蛋白质或肽进行编码的mrna。在其中核酸是mrna的一些实施例中，mrna是对肽(包含寡肽或多肽)进行编码的mrna。在某些实施例中，mrna是对多肽进行编码的mrna。在又另外的实施例中，mrna是对蛋白质进行编码的mrna。在其它实施例中，mrna是对肽进行编码的mrna。如上文所描述的，mrna可以是天然存
在的(例如，分离的肿瘤rna)或可以是合成的(例如，通过体外转录产生的)。对于mrna的合成或非天然发生的变异，mrna可以包括具有如硫代磷酸酯、非天然和经修饰的碱基等经修饰的骨架键的非天然骨架，和/或非天然和经修饰的末端。在其中核酸是mrna的某些实施例中，mrna可以包括特殊序列，如自扩增序列或内部核糖体进入位点。
[0294]
在一些实施例中，两种或更多种特定核酸的组合递送一起对于治疗应用可能特别有用。例如，在一些实施例中，一种或多种聚阴离子化合物包含作为crispr序列的sgrna(单向导rna)和对cas9进行编码的mrna的组合。在仍另外的实施例中，核酸还可以与蛋白质如与crispr/cas9核糖核蛋白复合物复合。
[0295]
在一些实施例中，一种或多种聚阴离子化合物可以包含不是核酸的阴离子或聚阴离子化合物。合适的阴离子化合物可以包含但不限于蛋白质、多磷酸盐或肝素。在一些实施例中，一种或多种聚阴离子化合物包括一种或多种蛋白质。在一个实施例中，一种或多种聚阴离子化合物包括cas9蛋白。在其它实施例中，一种或多种聚阴离子化合物包括多聚磷酸。在其它实施例中，一种或多种聚阴离子化合物包括肝素或其它糖胺聚糖衍生物。
[0296]
除了本文提供的复合物和组合物适合将聚阴离子货物递送到细胞中之外，应当承认，本文所描述的复合物和组合物也可以用于将其它非阴离子试剂或货物(包含疏水性化合物)递送到细胞中。这些其它货物可以包含但不限于，例如，小分子活性剂(作为独立的治疗剂或与另一种试剂如核酸组合)和/或免疫佐剂。应当进一步认识到，这些其它货物分子可以或可以不与本文所描述的任何聚阴离子化合物组合以进行复合。在一些实施例中，本文所描述的复合物包括内体逃逸调节剂、tlr激动剂和化学治疗剂。在其它实施例中，本公开的复合物包括佐剂或免疫共刺激剂。例如，在一些实施例中，复合物或组合物包括选自由以下组成的组的免疫佐剂：cpg寡脱氧核苷酸(odn)、脂多糖(lps)和其任何组合。
[0297]
另外的组分
[0298]
本公开的复合物和组合物可以包括包含聚乙二醇和/或靶向剂的一种或多种另外的组分。
[0299]
在一些实施例中，复合物和组合物包括一种或多种另外的组分，其中所述一种或多种另外的组分包括聚乙二醇(peg)。应当进一步认识到，特定分子量的聚乙二醇可以特别适合掺入到本公开的复合物和组合物中。例如，在一些实施例中，聚乙二醇的分子量为介于350与6,000g/mol之间、介于1,000与5,000g/mol之间或介于2,000与5,000g/mol之间。在某些实施例中，聚乙二醇的分子量为约350g/mol、500g/mol、600g/mol、750g/mol、1,000g/mol、2,000g/mol、3,000g/mol、5,000g/mol或10,000g/mol。在某些其它实施例中，聚乙二醇的分子量为约500g/mol、750g/mol、1,000g/mol、2,000g/mol或5,000g/rmol。在其中组合物包括聚乙二醇作为另外的组分的一些实施例中，应当认识到，一种或多种不同分子量的聚乙二醇聚合物可以包含在复合物和组合物中。
[0300]
在其它实施例中，复合物或组合物包括一种或多种另外的组分，其中所述一种或多种另外的组分包括靶向剂。在某些实施例中，靶向剂是小分子、抗体或抗体片段。
[0301]
应当认识到，如本文所描述的组合物可以制备为用于施用的调配物。在一些实施例中，调配物是溶液、悬浮液、胶体悬浮液、喷雾剂或气雾剂。在其它实施例中，所述调配物是脂质复合物调配物。在一些实施例中，所述调配物是肠内调配物、肠胃外调配物或局部调配物。在一些实施例中，调配物是可注射调配物，如静脉内调配物、皮下调配物、肌内调配
物、皮内调配物、眼内调配物、鞘内调配物或瘤内调配物。在其它实施例中，所述调配物是口服调配物。在其它实施例中，所述调配物是粘膜调配物，包含例如鼻腔调配物、肛门内调配物、口腔调配物或阴道内调配物等。
[0302]
应当进一步认识到，用于制备本公开的复合物和调配物的组分，以及用于制备所述复合物或调配物的工艺参数，可以根据复合物和/或调配物是否旨在立即使用而调整(“即时”)或将被存放以备将来使用。具体地，储存的考虑可以包含复合物和/或调配物的保存温度(例如，在室温下、在4℃下、在-20℃下、在-78℃下)和储存持续时间。
[0303]
因此，合适的赋形剂可以包含但不限于促进施用或提高储存稳定性的那些(例如，冷冻保护剂)。例如，除了上文描述的组分之外，本文所描述的调配物可以包括药学上可接受的赋形剂，如载体、溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、稳定剂、防腐剂等。在仍其它实施例中，组合物可以包括药学上可接受的赋形剂或载体，包含例如溶剂、稀释剂、缓冲剂和粘度调节剂。
[0304]
然而，与标准脂质纳米颗粒调配物相比之下，本公开的复合物和组合物不包括任何独立的结构脂质(如胆固醇或相关的甾醇)或独立的磷脂(例如，dope)，除非与如上文所描述的聚乙二醇部分(peg修饰的)缀合。
[0305]
复合物的性质和组成
[0306]
如本文所描述的，本公开的复合物和组合物主要由一种或多种阳离子化合物、一种或多种peg化合物和一种或多种聚阴离子化合物如核酸构成，用于细胞内递送。与许多其它现有的基于脂质的调配物(如标准脂质纳米颗粒调配物)相比之下，本公开的复合物和组合物不包含结构脂质(如胆固醇)或磷脂(如dope)。通常用于提供结构稳定性和改善的细胞膜渗透性的这些另外的共组分构成了整个调配物的很大一部分。传统的脂质纳米颗粒调配物包括大量的非活性成分，并且因此需要施用更大体积的调配物以递送一定量的核酸，例如，以引发期望的治疗或预防效果。相比之下，虽然仅包括与聚阴离子货物复合以中和电荷的阳离子化合物的调配物含有按重量计更大比例的聚阴离子材料，但这些阳离子化合物-聚阴离子化合物复合物在没有任何另外的共组分的益处的情况下遭受颗粒不稳定性和聚集。
[0307]
本公开的复合物和组合物通过将阳离子化合物和聚阴离子化合物与小比例的聚乙二醇化脂质组合，克服了现有脂质调配物的缺点，从而稳定阳离子化合物-聚阴离子化合物复合物，防止体内降解，并促进内吞作用，而不会有害地降低复合物中活性聚阴离子材料的重量比例，并且因此降低整体组合物的重量比例。
[0308]
一方面，本公开的复合物和组合物的特征可以在于复合物中存在的单独组分中的每种组分的质量百分比(或重量百分比)。可替代地，复合物和组合物可以通过两种或更多种组分相对于复合物总质量的组合质量百分比来表征。例如，在一些实施例中，一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种peg化合物和一种或多种阳离子化合物的组合质量百分比为所述复合物的至少90％w/w、至少95％w/w或至少99％w/w。在某些实施例中，一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种peg化合物和一种或多种阳离子化合物的组合质量百分比为所述复合物的至少90％w/w。在其中所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物或其盐的一些实施例中、一种或多种一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种peg化合物和一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物或其盐的组合
质量百分比为所述复合物的至少90％w/w、至少95％w/w或至少99％w/w。在某些实施例中，一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种peg化合物和一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物或其盐的组合质量百分比为所述复合物的至少90％w/w。在其中所述复合物包括包含一种或多种类脂的复合物的其它实施例中，一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种peg化合物和一种或多种类脂的组合质量百分比为所述复合物的至少90％w/w、至少95％w/w或至少99％w/w。在某些实施例中，一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种peg化合物和一种或多种类脂的组合质量百分比为所述复合物的至少90％w/w。
[0309]
在其中所述复合物或组合物包括一种或多种另外的组分如聚乙二醇聚合物或靶向剂的一些实施例中，一种或多种另外的组分以小于或等于10％的复合物的质量百分比存在。
[0310]
另一方面，本公开的复合物和组合物可以通过单独的组分彼此的质量比来表征。例如，如本文所描述的，本公开的复合物包括相对于阳离子递送媒剂的质量百分比的低质量百分比的聚乙二醇化化合物。在其中所述复合物或组合物包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种peg化合物的一些实施例中，一种或多种阳离子肽化合物和一种或多种peg化合物以介于90:10与99:1之间、介于92:8与98:2之间、介于95:5与99:1之间或介于95:5与98:2之间的质量比存在。在其中所述复合物或组合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的某些实施例中，一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种peg化合物以介于90:10与99:1之间、介于92:8与98:2之间、介于95:5与99:1之间或介于95:5与98:2之间的质量比存在。在其中所述复合物或组合物包括一种或多种类脂的其它实施例中，一种或多种类脂和一种或多种peg化合物以介于90:10与99:1之间、介于92:8与98:2之间、介于95:5与99:1之间或介于95:5与98:2之间的质量比存在。
[0311]
在其中所述复合物或组合物包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种peg脂质的一些实施例中，一种或多种阳离子肽化合物和一种或多种peg脂质以介于90:10与99:1之间、介于92:8与98:2之间、介于95:5与99:1之间或介于95:5与98:2之间的质量比存在。在其中所述复合物或组合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的某些实施例中，一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种peg脂质以介于90:10与99:1之间、介于92:8与98:2之间、介于95:5与99:1之间或介于95:5与98:2之间的质量比存在。在其中所述复合物或组合物包括一种或多种类脂的其它实施例中，一种或多种类脂和一种或多种peg脂质以介于90:10与99:1之间、介于92:8与98:2之间、介于95:5与99:1之间或介于95:5与98:2之间的质量比存在。
[0312]
如本文所描述的复合物和包括所述复合物的组合物的特征可以在于一种或多种阳离子化合物上的总阳离子电荷，例如叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽上的阳离子基团的数量，与核酸上的阴离子磷酸基团的数量的比率。在一些实施例中，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种聚阴离子化合物，其阳离子:阴离子电荷比为介于0.5:1与50:1之间、介于0.5:1与20:1之间、介于0.5:1与10:1之间、介于0.5:1与5:1之间、介于1:1与20:1之间、介于1:1与10:1之间、介于1:1与5:1之间、介于2:1与20:1之间、介于2:1与10:1之间或介于2:1与5:1之间。在某些实施例中，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽和一种或多种聚阴离子化合物，如核酸，其阳离子:阴离子电
荷比为介于0.5:1与50:1之间、介于0.5:1与20:1之间、介于0.5:1与10:1之间、介于0.5:1与5:1之间、介于1:1与20:1之间、介于1:1与10:1之间、介于1:1与5:1之间、介于2:1与20:1之间、介于2:1与10:1之间或介于2:1与5:1之间。在某些其它实施例中，所述复合物包括一种或多种类脂和一种或多种聚阴离子化合物，其阳离子:阴离子电荷比为介于0.5:1与50:1之间、介于0.5:1与20:1之间、介于0.5:1与10:1之间、介于0.5:1与5:1之间、介于1:1与20:1之间、介于1:1与10:1之间、介于1:1与5:1之间、介于2:1与20:1之间、介于2:1与10:1之间或介于2:1与5:1之间。
[0313]
在其它实施例中，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种核酸，其阳离子:阴离子电荷比为介于2:1与5:1之间。在一些实施例中，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种核酸，其阳离子:阴离子电荷比为介于2:1与5:1之间。在又其它实施例中，所述复合物包括一种或多种类脂和一种或多种核酸，其阳离子:阴离子电荷比为介于2:1与5:1之间。在一些实施例中，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种核酸，其阳离子:阴离子电荷比为3:1。在其它实施例中，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种核酸，其阳离子:阴离子电荷比为3:1。在仍其它实施例中，所述复合物包括一种或多种类脂和一种或多种核酸，其阳离子:阴离子电荷比为3:1。
[0314]
可替代地，所述复合物和组合物可以通过阳离子化合物与聚阴离子化合物和/或复合物中的其它货物的相对质量比来表征。基于用于制备复合物的每种组分的储备溶液的已知浓度和体积，可以容易地计算复合物中的组分的质量比。此外，如果复合物中存在非阴离子货物，则质量比可以比阳离子:阴离子电荷比更准确地表示阳离子化合物与总货物的相对量，其不考虑非阴离子材料。
[0315]
在一些实施例中，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物，其质量比为介于0.5:1与50:1之间、介于0.5:1与20:1之间、介于0.5:1与10:1之间、介于0.5:1与5:1之间、介于1:1与20:1之间、介于1:1与10:1之间、介于1:1与5:1之间、介于2:1与20:1之间、介于2:1与10:1之间或介于2:1与5:1之间。在某些实施例中，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物，其质量比为介于0.5:1与50:1之间、介于0.5:1与20:1之间、介于0.5:1与10:1之间、介于0.5:1与5:1之间、介于1:1与20:1之间、介于1:1与10:1之间、介于1:1与5:1之间、介于2:1与20:1之间、介于2:1与10:1之间或介于2:1与5:1之间。在其它实施例中，所述复合物包括一种或多种类脂和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物，其质量比为介于0.5:1与50:1之间、介于0.5:1与20:1之间、介于0.5:1与10:1之间、介于0.5:1与5:1之间、介于1:1与20:1之间、介于1:1与10:1之间、介于1:1与5:1之间、介于2:1与20:1之间、介于2:1与10:1之间或介于2:1与5:1之间。
[0316]
在其它实施例中，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物，其质量比为介于2:1与5:1之间。在某些实施例中，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物，其质量比为介于2:1与5:1之间。在一些实施例中，所述复合物包括一种或多种类脂和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物，其质量比为介于2:1与5:1之间。在仍又其它实施例中，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物和一
种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物，其质量比为3:1。在某些实施例中，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物，其质量比为3:1。在又另外的实施例中，所述复合物包括一种或多种类脂和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物，其质量比为3:1。
[0317]
在其中所述复合物包括一种或多种核酸作为一种或多种聚阴离子化合物的一部分的某些实施例中，所述复合物可以包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种核酸，其质量比为介于0.5:1与50:1之间、介于0.5:1与20:1之间、介于0.5:1与10:1之间、介于0.5:1与5:1之间、介于1:1与20:1之间、介于1:1与10:1之间、介于1:1与5:1之间、介于2:1与20:1之间、介于2:1与10:1之间或介于2:1与5:1之间。在一些实施例中，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种核酸，其质量比为介于0.5:1与50:1之间、介于0.5:1与20:1之间、介于0.5:1与10:1之间、介于0.5:1与5:1之间、介于1:1与20:1之间、介于1:1与10:1之间、介于1:1与5:1之间、介于2:1与20:1之间、介于2:1与10:1之间或介于2:1与5:1之间。在其它实施例中，所述复合物包括一种或多种类脂和一种或多种核酸，其质量比为介于0.5:1与50:1之间、介于0.5:1与20:1之间、介于0.5:1与10:1之间、介于0.5:1与5:1之间、介于1:1与20:1之间、介于1:1与10:1之间、介于1:1与5:1之间、介于2:1与20:1之间、介于2:1与10:1之间或介于2:1与5:1之间。在一些实施例中，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种核酸，其质量比为介于2:1与5:1之间。在某些实施例中，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种核酸，其质量比为介于2:1与5:1之间。在某些其它实施例中，所述复合物包括一种或多种类脂和一种或多种核酸，其质量比为介于2:1与5:1之间。在其它实施例中，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物和一种或多种核酸，其质量比为3:1。在某些实施例中，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物和一种或多种核酸，其质量比为3:1。在某些其它实施例中，所述复合物包括一种或多种类脂和一种或多种核酸，其质量比为3:1。
[0318]
制备复合物和组合物的方法
[0319]
阳离子化合物和聚阴离子化合物的复合物和其组合物可以通过多种物理和/或化学方法来制备以调节其物理、化学和生物学性质。这些通常涉及阳离子化合物(例如，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽)在水或水混溶性有机溶剂中与期望的聚阴离子化合物(例如，寡核苷酸)在水或水性缓冲溶液中的快速组合。这些方法可以包含通过移液或微流体混合过程(如涉及t型混合器、涡流混合器或其它混沌混合结构的那些)来简单混合组分。本公开的组合物可以以类似方式制备。
[0320]
一方面，本公开提供了一种制备如本文所描述的复合物和组合物的方法，所述方法包括使一种或多种阳离子化合物与一种或多种聚阴离子化合物和一种或多种peg化合物如peg脂质接触。在一些实施例中，本文提供了一种制备组合物的方法，所述方法包括使一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与一种或多种聚阴离子化合物和一种或多种peg化合物接触。在其它实施例中，本文提供了一种制备组合物的方法，所述方法包括使一种或多种类脂与一种或多种聚阴离子化合物和一种或多种peg化合物接触。
[0321]
在一些实施例中，所述制备包括一种或多种阳离子化合物、一种或多种peg化合物和一种或多种聚阴离子化合物的复合物或其组合物的方法包括使包括所述一种或多种阳
离子化合物的溶液与包括所述一种或多种聚阴离子化合物的溶液和包括所述一种或多种peg化合物的溶液接触。在某些实施例中，所述聚阴离子化合物包括核酸。在一些实施例中，所述一种或多种阳离子化合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物。在其它实施例中，所述一种或多种阳离子化合物包括一种或多种类脂。
[0322]
所述复合物和组合物中的另外的组分，如聚乙二醇和/或靶向剂或赋形剂的另外的组分，可以在阳离子化合物、聚阴离子化合物和peg化合物的主要组分已经进行组合之前、期间或之后与所述组合物混合和组合。
[0323]
可以相应地调整或选择用于制备本文所描述的复合物和组合物的特定工艺条件以提供组合物的期望的物理性质。例如，用于混合组合物的可以影响最终组合物的组分的参数可以包含但不限于混合顺序、混合温度、混合速度/速率、流速、储备溶液的浓度、组分的质量比(例如，肽:货物)和溶剂。
[0324]
使用复合物和其组合物的方法
[0325]
如上文所描述的，本文所描述的组合物促进将聚阴离子化合物递送到细胞，特别是细胞内环境。因此，所述组合物可以用于许多临床应用以及研究应用。将聚阴离子化合物递送到细胞可以用于临床应用，如与预防、诊断和/或治疗方法相关的那些。例如，在一些实施例中，合适的临床应用可以包含疫苗接种、癌症免疫疗法、蛋白质替代疗法和/或体内基因编辑、离体细胞疗法转染、离体干细胞诱导。将聚阴离子化合物递送到细胞的方法也可用于研究或非临床应用，包含用于生物测定和试剂。
[0326]
另一方面，本文提供了将聚阴离子化合物递送到细胞的方法。在一些实施例中，将聚阴离子化合物递送到细胞的方法包括使所述细胞与包括一种或多种阳离子化合物、一种或多种聚乙二醇化化合物和聚阴离子化合物的复合物接触。在其它实施例中，所述将聚阴离子化合物递送到细胞的方法包括使所述细胞与复合物接触，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物、一种或多种聚乙二醇化化合物和聚阴离子化合物。在上述方法的一些实施例中，所述接触是通过内吞作用进行的。在其它实施例中，本文提供了一种将聚阴离子化合物递送到细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与包括复合物的组合物接触，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物、一种或多种聚乙二醇化化合物和聚阴离子化合物。在其它实施例中，本文提供了一种方法，所述方法包括使细胞与包括复合物的组合物接触，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物、一种或多种聚乙二醇化化合物和聚阴离子化合物。
[0327]
在一些实施例中，所述将聚阴离子化合物递送到细胞的方法包括使所述细胞与包括一种或多种阳离子化合物、一种或多种聚乙二醇化化合物和聚阴离子化合物的复合物接触，其中所述细胞在体外、离体或体内接触。在某些实施例中，所述将聚阴离子化合物递送到细胞的方法包括使所述细胞与复合物接触，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物、一种或多种聚乙二醇化化合物和聚阴离子化合物，其中所述细胞在体外、离体或体内接触。在其它实施例中，所述将聚阴离子化合物递送到细胞的方法包括使所述细胞与包括复合物的组合物接触，所述复合物包括一种或多种阳离子化合物、一种或多种聚乙二醇化化合物和聚阴离子化合物，其中所述细胞在体外、离体或体内接触。在某些实施例中，所述将聚阴离子化合物递送到细胞的方法包括使所述细胞与包括复合物的组合物接触，所述复合物包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化
合物、一种或多种聚乙二醇化化合物和聚阴离子化合物，其中所述细胞在体外、离体或体内接触。
[0328]
在其中所述细胞在体外接触的一些实施例中，所述细胞是海拉、hepg2或jawsii细胞。在其中所述细胞在体内接触的其它实施例中，将本公开的复合物或其组合物或其调配物施用于哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以包含但不限于人或小鼠受试者。在其中离体接触所述细胞的其它实施例中，所述细胞从人或小鼠受试者中获得。
[0329]
在其中所述细胞在体内接触的前述方法的一些实施例中，如本文所描述的复合物和组合物可以通过注射施用。在某些实施例中，如本文所描述的复合物和其组合物可以通过注射(静脉内(iv)、皮下(sc)、肌内(im)、鞘内或瘤内)施用。在一些实施例中，所述复合物和组合物通过静脉内(iv)、皮下(sc)、肌内(im)、鞘内或瘤内注射施用。在其它实施例中，如本文所描述的复合物和组合物通过团注注射或静脉输注施用。在其中所述细胞在体内接触的其它实施例中，本公开的复合物和组合物通过鼻或口吸入施用。在其中所述细胞在体内接触的一些实施例中，本文所描述的复合物和组合物是口服施用的。在其中所述细胞在体内接触的其它实施例中，复合物和组合物通过吸收到粘膜(包含局部、肛门内、口腔、阴道内等)中来施用。
[0330]
另一方面，本文提供了将聚阴离子化合物递送到受试者的一个或多个靶器官(例如，肺、脾、肝、肾、腹股沟和/或肠系膜淋巴结)的方法。应当认识到，器官特异性(例如，靶向肺)可能受选择一种或多种阳离子化合物(例如，具有至少2+电荷、具有一定范围内的pka等的式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化化合物)或阳离子化合物与其货物的质量比(例如，更高的类肽:货物比)影响。
[0331]
应当理解，临床应用，如上文公开的诊断、预防和治疗实例，可以涉及给药方案(例如，用于施用的剂量水平和时间过程)，所述给药方案可以根据所使用的特定复合物和组合物、施用途径、复合物和组合物施用的对象和/或期望的生理作用而变化。例如，在一些实施例中，本公开的方法包括以0.001mg/kg到约1mg/kg的体重的剂量施用复合物或组合物。
[0332]
列举的实施例
[0333]
以下列举的实施例代表本发明的一些方面。
[0334]
1.一种组合物，其包括以下的复合物：
[0335]
(i)一种或多种聚阴离子化合物；
[0336]
(ii)一种或多种peg化合物；以及
[0337]
(iii)一种或多种阳离子化合物，其中所述一种或多种阳离子化合物选自由以下组成的组：
[0338]
(a)一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物或其盐：
[0339][0340]
其中：
[0341]
m为0；
[0342]
n为0到5的整数；
[0343]
s为0到5的整数；
[0344]
t为0；
[0345]
其中n和s中的至少一个是非零的；
[0346]
r为1到20的整数；
[0347]
每个o独立地为整数0、1或2；
[0348]
每个q独立地为整数0、1或2；
[0349]
每个p独立地为整数1或2；
[0350]
r1为
–
h、烷基、烷基芳基、-cor
1a
或脂质部分，
[0351]
其中r
1a
为-h、-oh、烷基、芳基、烷基芳基、-o-烷基或-o-烷基芳基；
[0352]
每个r2独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)uch3的乙二醇部分，并且其中每个u独立地为2到200的整数；
[0353]
每个r3独立地为脂质部分；
[0354]
每个r4独立地为中性间隔子部分或脂质部分；
[0355]
每个r5独立地为阳离子部分；
[0356]
每个r6独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)vch3的乙二醇部分，并且其中每个v独立地为2到200的整数；
[0357]
r7为-h、烷基、酰基、-oh、-or
7a
、-nh2、-nhr
7a
或脂质部分，其中r
7a
为烷基、酰基或脂质部分；并且
[0358]
每个ra和rb独立地为
–
h、c
1-c4烷基或在天然或非天然存在的氨基酸上发现的侧链部分；
[0359]
(b)一种或多种式(ii)类脂：
[0360][0361]
其中：
[0362]
x为1到100的整数；
[0363]
每个r9独立地为脂质部分；并且
[0364]
每个r
10
独立地为阳离子或中性间隔子部分；
[0365]
(c)一种或多种式(iii)脂质样化合物：
[0366][0367]
其中：
[0368]
每个r
11
独立地为经取代的或未经取代的烷基；
[0369]
每个r
12
独立地为经取代的或未经取代的烷基；
[0370]
每个r
13
独立地为氢或经取代的或未经取代的烷基；并且
[0371]
每个y独立地为1到8的整数；
[0372]
并且
[0373]
(d)其任何组合；
[0374]
并且其中所述一种或多种阳离子化合物、所述一种或多种peg化合物和所述一种或多种聚阴离子化合物的组合质量百分比为所述复合物的至少90％w/w。
[0375]
2.根据实施例1所述的组合物，其中所述一种或多种阳离子化合物是一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物。
[0376]
3.根据实施例1或实施例2所述的组合物，其中所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包括n-脂化氨基酸残基嵌段，其中n或s为至少2。
[0377]
4.根据实施例1到3中任一项所述的组合物，其中每个r3独立地为c
4-c
22
烷基或c
4-c
22
烯基，并且其中所述c
4-c
22
烯基任选地是单不饱和的或多不饱和的。
[0378]
5.根据实施例1到4中任一项所述的组合物，其中r3独立地为c
8-c
12
烷基。
[0379]
6.根据实施例1到4中任一项所述的组合物，其中每个r3独立地选自由以下组成的组：2-乙基己-1-基、己酰基、油烯基、硬脂酰基、亚油烯基、肉豆蔻基和月桂基。
[0380]
7.根据实施例1到6中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的至少一种包括阳离子结构域，所述阳离子结构域包括具有阳离子部分r5的至少两个阳离子氨基酸残基。
[0381]
8.根据实施例1到7中任一项所述的组合物，其中每个r5独立地为氨基烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基氨基烷基、胍基烷基、n-杂环基烷基或n-杂芳基。
[0382]
9.根据实施例1到8中任一项所述的组合物，其中每个r5独立地选自由以下组成的组：
[0383][0384]
10.根据实施例1到9中任一项所述的组合物，其中每个r5为
[0385]
11.根据实施例1到10中任一项所述的组合物，其中每个中性间隔子部分r4独立地为被环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基取代的c
1-c4烷基，其中每个环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基任选地被一个或多个取代基-oh、卤基或烷氧基取代。
[0386]
12.根据实施例1到11中任一项所述的组合物，其中每个中性间隔子部分r4独立地选自由以下组成的组：选自由以下组成的组：
[0387]
13.根据实施例1到12中任一项所述的组合物，其中每个中性间隔子部分r4为
[0388]
14.根据实施例1到13中任一项所述的组合物，其中种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的至少一种包括阳离子结构域，所述阳离子结构域包括具有r5阳离子部分的至少两个氨基酸残基，并且其中所述阳离子结构域内的所述至少两个阳离子氨基酸残基中的每个阳离子氨基酸残基被至少一个具有中性间隔子或脂质部分r4的氨基酸残基隔开。
[0389]
15.根据实施例1到14中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物中的至少一种包括至少一个三聚体亚基-r
阳离子-r
中性-r
中性
，并且其中r
阳离子
是包括阳离子部分r5的氨基酸残基并且每个r
中性
是包括中性间隔子部分r4的氨基酸残基。
[0390]
16.根据实施例1到15中任一项所述的组合物，其中每个阳离子部分r5为并且每个中性间隔子部分r4为
[0391]
17.根据实施例1到16中任一项所述的组合物，其中ra和rb独立地选自由
–
h和-ch3组成的组。
[0392]
18.根据实施例1到17中任一项所述的组合物，其中ra和rb为
–
h。
[0393]
19.根据实施例1到18中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种阳离子肽化合物和一种或多种peg化合物以介于90:10与99:1之间的肽化合物与peg化合物的质量比存在。
[0394]
20.根据实施例1到19中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种阳离子肽化合
物和所述一种或多种peg化合物以介于95:5与98:2之间的肽化合物与peg化合物的质量比存在。
[0395]
21.根据实施例1到20中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种peg化合物包括dmg-peg2000。
[0396]
22.根据实施例1到21中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种peg化合物包括一种或多种式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物或其盐：
[0397][0398]
其中：
[0399]
m为0到10的整数；
[0400]
n为0到5的整数；
[0401]
s为0到5的整数；
[0402]
t为0到10的整数；
[0403]
其中m和t中的至少一个是非零的；
[0404]
r为1到20的整数；
[0405]
每个o独立地为整数0、1或2；
[0406]
每个q独立地为整数0、1或2；
[0407]
每个p独立地为整数1或2；
[0408]
r1为
–
h、烷基、烷基芳基、-cor
1a
或脂质部分，
[0409]
其中r
1a
为-h、-oh、烷基、芳基、烷基芳基、-o-烷基或-o-烷基芳基；
[0410]
每个r2独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)uch3的乙二醇部分，并且其中每个u独立地为2到200的整数；
[0411]
每个r3独立地为脂质部分；
[0412]
每个r4独立地为中性间隔子部分或脂质部分；
[0413]
每个r5独立地为阳离子部分；
[0414]
每个r6独立地为式
–
ch2ch2o(ch2ch2o)vch3的乙二醇部分，并且其中每个v独立地为2到200的整数；
[0415]
r7为-h、烷基、酰基、-oh、-or
7a
、-nh2、-nhr
7a
或脂质部分，其中r
7a
为烷基、酰基或脂质部分；并且
[0416]
每个ra和rb独立地为
–
h、c
1-c4烷基或在天然或非天然存在的氨基酸上发现的侧链部分。
[0417]
23.根据实施例22所述的组合物，其中
[0418]
当m为0到3的整数时，每个u独立地为20到200，任选地30到50的整数；并且
[0419]
当m为4到10的整数时，每个u独立地为2到10的整数。
[0420]
24.根据实施例22或实施例23所述的组合物，其中
[0421]
当t为0到3的整数时，每个v独立地为30到50的整数；
[0422]
当t为4到10的整数时，每个v独立地为2到10的整数。
[0423]
25.根据实施例22到24中任一项所述的组合物，其中
[0424]
m为1，并且u为40到45的整数；或者
[0425]
t为1，并且v为40到45的整数。
[0426]
26.根据实施例1到25中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸。
[0427]
27.根据实施例1到26中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中所述一种或多种阳离子肽化合物与所述核酸的质量比介于0.5:1与20:1之间。
[0428]
28.根据实施例1到27中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中所述核酸是对多肽进行编码的mrna。
[0429]
29.根据实施例1到28中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中所述核酸是对蛋白质进行编码的mrna。
[0430]
30.根据实施例1到29中任一项所述的方法，其中所述复合物进一步包括一种或多种第二试剂。
[0431]
31.根据实施例1到30中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种第二试剂选自由以下组成的组：聚乙二醇、靶向元件和其组合。
[0432]
32.根据实施例1到31中任一项所述的组合物，其中所述复合物进一步包括一种或多种小分子活性剂或药物物质。
[0433]
33.根据实施例1到31中任一项所述的组合物，其中所述复合物悬浮在水溶液中。
[0434]
34.一种将聚阴离子化合物递送到细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据实施例1到33中任一项所述的组合物接触。
[0435]
35.根据实施例34所述的方法，其中所述接触是通过内吞作用进行的。
[0436]
36.根据实施例34或实施例35所述的方法，其中所述细胞在体内或体外接触。
[0437]
37.根据实施例35到36中任一项所述的方法，其中所述聚阴离子化合物包括所述核酸，所述核酸是对多肽进行编码的mrna，并且所述细胞在与所述组合物接触之后表达所述多肽。
[0438]
38.根据实施例34到37中任一项所述的方法，其中所述聚阴离子化合物包括所述核酸，所述核酸是对蛋白质进行编码的mrna，并且所述细胞在与所述组合物接触之后表达所述蛋白质。
[0439]
39.一种制备根据实施例1到33中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括使所述一种或多种阳离子肽化合物与所述一种或多种peg化合物和所述一种或多种聚阴离子化合物接触。
[0440]
40.根据实施例39所述的方法，其包括使包括所述一种或多种阳离子肽化合物和一种或多种peg化合物的溶液与包括所述一种或多种聚阴离子化合物的溶液接触。
[0441]
实例
[0442]
在以下实例中进一步详细地描述了本公开，所述实例并非旨在以任何方式限制所要求保护的本公开的范围。附图旨在被视为本公开的说明书和描述的组成部分。提供以下实例以说明而非限制所要求保护的本公开。
[0443]
实例1-用于核酸递送的示例性叔氨基脂化阳离子肽的合成
[0444]
以下实例描述了用于合成如本文所描述的式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的通用方案。
[0445][0446]
在下文提供的描述中，所有的ra和rb均为
–
h。所有聚合物均使用溴乙酸和伯胺合成。图2b-2e提供了在r2、r3、r4、r5和r6处的伯胺的一些示例性取代基，以制备本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物。
[0447]
fmoc-rink酰胺树脂用作固体载体。树脂上的fmoc基团用20％(v/v)哌啶-二甲基甲酰胺(dmf)脱保护。然后用溴乙酸酰胺化氨基树脂。随后通过用伯胺亲核置换溴化物使α-碳胺化。连续重复这两个步骤以产生期望的阳离子肽序列。
[0448]
除非另有说明，否则所有反应和洗涤均在室温下进行。树脂的洗涤是指将洗涤溶剂(通常是dmf或二甲亚砜(dmso))添加到树脂中，搅拌树脂，使得获得均匀的浆料，然后将溶剂从树脂中彻底排出。通过反应容器的烧结底部真空过滤除去溶剂，直到树脂看起来干燥。在所有合成中，树脂浆料通过鼓泡氩气向上通过烧结容器底部进行搅拌。
[0449]
初始树脂脱保护。用fmoc-rink酰胺树脂充装烧结反应容器。将dmf添加到树脂中并搅拌此溶液以使树脂溶胀。然后排出dmf。fmoc基团通过将dmf中的20％哌啶添加到树脂中、搅拌树脂并排出树脂来去除。将dmf中的20％哌啶添加到树脂中并搅拌15分钟，并且然后排出。然后用dmf洗涤树脂六次。
[0450]
酰化/酰胺化。然后通过向树脂中添加dmf中的溴乙酸，然后添加dmf中的n，n-二异丙基聚碳二亚胺(dic)来酰化解封端的胺(图3a)。将此溶液在室温下搅拌30分钟，并且然后排出。第二次重复此步骤。然后用dmf洗涤树脂两次并用dmso洗涤一次。这是一个完整的反应循环。
[0451]
亲核置换/胺化。酰化树脂用期望的伯胺或仲胺处理以在α-碳上的溴离去基团处进行亲核置换(图3b)。重复此酰化/置换循环(图3c)直到获得期望的肽序列(图3d)。
[0452]
来自树脂的肽切割。将干燥的树脂放入含有聚四氟乙烯涂层的微型搅拌棒的玻璃闪烁瓶中，并添加95％三氟乙酸(tfa)的水溶液。将溶液搅拌20分钟，并且然后通过装有聚乙烯熔块的固相萃取(spe)柱过滤到聚丙烯锥形离心管中。
[0453]
用1ml 95％tfa洗涤树脂。然后将组合的滤液从1:1乙腈:水冻中干三次。将冻干肽(图3e)以5mg/ml的浓度重新溶解在无水乙醇中或以10mg/ml的浓度重新溶解在dmso中。
[0454]
纯化和表征。通过制备型hplc纯化重新溶解的粗肽。纯化的肽通过lc-ms分析进行表征。
[0455]
实例2-对代表性氨基脂化类肽的合成和表征
[0456]
用溴乙酸和n,n'-二异丙基碳二亚胺(dic)通过上文实例1中所描述的亚单体方法合成氨基脂化类肽。聚苯乙烯支持的mbha fmoc保护的rink酰胺(200mg代表性规模，0.64mmol/g负载，蛋白质技术公司(protein technologies))树脂用作固体载体。对于溴乙酰化，将树脂与2m溴乙酸和2m n,n'-二异丙基碳二亚胺(dic)的1:1混合物混合持续5分钟。使用1m的胺在dmf中的溶液进行胺置换持续1小时。合成后，使用5ml的95:2.5:2.5三氟乙酸
(tfa):水:三异丙基硅烷的混合物在室温下将粗类肽从树脂中切割持续40分钟。通过过滤除去树脂并使用biotage v10蒸发器浓缩滤液。通过从mecn的25％水溶液中冻干进一步浓缩粗类肽。在waters acquity uplc peptide beh c18色谱柱上，使用waters acquity uplc系统和acquity二极管阵列uv检测器和waters sqd2质谱仪以5-95％的梯度测定纯度和同一性。通过在waters xbridge beh300 prep c4柱上使用具有0.1％tfa梯度的5-40％乙腈水溶液的waters 2489uv//可见检测器的制备型waters prep150lc系统在30分钟内纯化选择的粗类肽。
[0457]
表1a示出了通过实例2中描述的方法制备的代表性氨基脂化类肽。表1b提供了表1a中制备的氨基脂化类肽化合物1-72的表征数据，包含预测的分子量、保留时间(以分钟为单位，通过uplc-uv测量在λ＝218nm处确定)和主要观察到的质荷比(m/z，mh
+
，通过电喷雾电离质谱法)。对于氨基脂化和聚乙二醇化类肽化合物48、56、64和72中的每一种，由于连接到类肽的peg部分(平均分子量2000g/mol)的多分散性，质谱含有若干个峰分布。报告的这些氨基脂化和聚乙二醇化类肽化合物的质荷比峰是峰的mh
22+
分布的中心值，具有有效的单体分离δ～22m/z(-och2ch
2-，乙二醇分子量44g/mol)。
[0458]
表1a
[0459]
[0460]
[0461]
[0462]
[0463]
[0464]
[0465]
[0466]
[0467]
[0468]
[0469]
[0470]
[0471]
[0472]
[0473]
[0474]
[0475]
[0476]
[0477]
[0478]
[0479]
[0480]
[0481]
[0482]
[0483]
[0484]
[0485]
[0486]
[0487]
[0488]
[0489]
[0490]
[0491]
[0492]
[0493]
[0494]
[0495]
[0496]
[0497]
[0498]
[0499]
[0500]
[0501]
[0502]
[0503]
[0504][0505][0506]
表1b
[0507]
[0508]
[0509][0510]
实例3-用寡核苷酸调配代表性氨基脂化类肽以形成纳米颗粒组合物
[0511]
以下实例描述了用于用寡核苷酸调配如本文所描述的式(i)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物的通用方案。
[0512]
在标准调配物中，在浓度为0.5mg/ml(用于体外实验)或5mg/ml(用于体内实验)下，氨基脂化类肽溶解在无水乙醇中。所得溶液在室温下稳定，但应储存在-20℃下。核酸货物以0.2mg/ml(用于体外实验)或1mg/ml(用于体内实验)的最终浓度溶解在dnase或无rnase水中。这些溶液应在-20℃或-78℃下储存持续更长的时间。
[0513]
为了制备纳米颗粒调配物，氨基脂化类肽通过移液与核酸以大约1:1(拟肽:货物)与20:1之间的质量比混合。在调配之前，将氨基脂化类肽和核酸货物分别在乙醇和酸性缓冲液(pbs用0.1m hcl调整到ph 5.5)中稀释到1:3的体积比，并靶向大约0.05mg/ml到0.2mg/ml的最终货物浓度。
[0514]
实例4-对代表性mrna/类肽调配物的物理性质的制备和表征
[0515]
将实例2中描述的示例性氨基脂化阳离子类肽与萤火虫萤光素酶(fluc)mrna组合以形成纳米颗粒组合物，以在体外或体内评估治疗和/或预防目的。根据实例3的方案制备调配物并通过简单的移液器混合。
[0516]
通过动态光散射(dls)评估5:1质量比的类肽:货物的mrna/类肽调配物，以确定mrna/类肽复合物的体积平均粒度/直径(nm)和调配物内的大小多分散性指数(pdi)。通过在triton x-100裂解颗粒之前和之后，qubit rna hs(英杰公司(invitrogen))染料的荧光来确定示例性化合物的每种调配物的mrna包封百分比。结果示出于下表2中。
[0517]
表2
[0518][0519]
实例5-peg对调配物稳定性和转染效率的影响
[0520]
为了评估不同量的peg掺入对类肽调配物的调配物稳定性(即粒度)和转染效率的影响，单独使用化合物8或与2％w/w或5％w/w的dmg-peg 2000组合制备三种调配物。使用浓度为0.2μg/μl的5μg mrna调配颗粒。在调配后立即将颗粒添加到pbs(ph 7.4)中。
[0521]
三种调配物的体积平均粒度(nm)通过与上述实例4中相同的方法在调配并添加pbs缓冲液(0.5小时)中之后和调配之后8小时(8小时)立即评估。测得的数均粒度在图4a中
描绘。
[0522]
还评估了具有2％dmg-peg 2000或具有5％dmg-peg 2000的三种单独的化合物8调配物的转染效果。图4b示出了在调配后大约30分钟用100ng mrna/孔处理之后8小时观察到的海拉细胞平均生物发光(rlu)。未经处理的海拉细胞用作生物发光测量的对照。
[0523]
实例6-储存稳定性
[0524]
为了评估含有氨基脂化类肽化合物并掺入2％w/w peg的调配的储存稳定性，在注射前7天、注射前3天或注射前1小时，制备氨基脂化类肽化合物28与fluc mrna和2％w/w dmg-peg2000的调配物。在此期间，调配物储存在4℃下。这三种调配物通过尾静脉注射分别注射到三只小鼠中。
[0525]
通过在注射后8小时记录全身分布发光(或光子通量)来评估调配物的储存稳定性。图5a-5c示出了储存1小时(图5a)、3天(图5b)和7天(图5c)之后的全身发光。图5d示出了对于每个时间点观察到的总光子通量的绘图。
[0526]
实例7-萤火虫萤光素酶(fluc)在用代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物单独(无peg)或含有2％(w/w)dmg-peg2000(2％peg)处理后的体外表达
[0527]
基于其将萤火虫荧光素酶(fluc)报告基因递送到所培养的细胞的能力，在体外评估了mrna/氨基脂化类肽调配物的功效。氨基脂化类肽与fluc mrna以5:1w/w的比例组合，并将所得颗粒以100ng/孔(总体积为100μl)的剂量添加到所培养的海拉细胞中。在处理6小时和24小时之后，通过发光读板仪测量所得荧光素酶表达(rlu)。下表3示出了在两个时间点处观察到的mrna/氨基脂化类肽调配物的荧光素酶表达。
[0528]
表3.用代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物处理后萤火虫荧光素酶(fluc)的体外表达
[0529][0530]
除了评估单独在mrna货物与氨基脂化类肽之间形成的纳米颗粒复合物外，还测试了含有少量peg-脂质dmg-peg2000的多组分调配物的体外fluc mrna递送。在这些调配物中，dmg-peg2000与候选类肽以2％的总掺入量(w/w)预混合，同时保持先前使用的类肽:mrna的相同质量比为5:1。下表4示出了在两个时间点(处理之后6小时和24小时)处观察到的具有2％dmg-peg2000掺入的mrna/氨基脂化类肽调配物的荧光素酶表达。
[0531]
表4.用具有2％dmg-peg2000的代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物处理后萤火虫荧光素酶(fluc)的体外表达
[0532][0533]
实例8-萤火虫萤光素酶(fluc)在用不具有dmg-peg2000或含有2％(w/w)dmg-peg2000的代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物在可变类肽:货物质量比下处理后的体外表达
[0534]
通过在fluc mrna与递送媒剂之间以不同的质量比调配颗粒来评估氨基脂化类肽递送媒剂的电荷比依赖性。调配物在2:1与7.5:1的类肽:mrna(w/w)比率之间(2:1、3.5:1、5:1和7.5:1)变化。另外，还通过质量比探索了dmg-peg2000的作用，通过排除dmg-peg2000或以相对于氨基脂化类肽的2％(w/w)掺入dmg-peg2000。在处理持续24小时后，在海拉细胞中测量来自这些调配物的fluc表达。
[0535]
图6a示出了对来自实例2的没有peg掺入的示例性氨基脂化阳离子类肽化合物1-18进行的体外荧光素酶表达测量的结果。图6b和6c示出了用示例性氨基脂化阳离子类肽化合物1-36的调配物(全部调配为具有2％w/w dmg-peg2000)处理的海拉细胞的平均生物发光(rlu)的绘图。表5示出了用含有2％w/w dmg-peg2000的调配物处理的海拉细胞观察到的fluc表达。
[0536]
表5.萤火虫萤光素酶(fluc)在用含有2％(w/w)dmg-peg2000的代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物在可变类肽:mrna质量比下处理后的体外表达
[0537][0538]
还评估了氨基脂化类肽化合物37-72与2％dmg-peg2000的调配物将fluc mrna递送到海拉细胞中的能力。图6d和6e示出了用氨基脂化类肽化合物1-72的各种调配物与fluc mrna(50ng/孔，类肽:mrna比率为5:1)和2％dmg-peg2000的组合处理的海拉细胞观察到的平均生物发光(rlu)的绘图。
[0539]
实例9-在用代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物单独(无peg)或含有2％(w/w)dmg-peg2000(2％peg)处理后的体外细胞活力
[0540]
在用fluc mrna/氨基脂化类肽调配物处理后，通过传统的mtt活力测定法测量细胞活力。所有类肽/mrna调配物均用2％(w/w)dmg-peg2000以5:1的质量比制备。在此测定中，首先用类肽调配物以100ng/孔的最终mrna浓度处理细胞持续8小时。然后让细胞生长48小时，然后将所述细胞暴露于1.5mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mtt)持续2小时，然后使用10％triton-x 100在酸性异丙醇(0.1n hcl)中的溶解溶液进行裂解。将对应于还原甲臜的信号相对于未经处理的细胞归一化，以提供每种经处理的条件的相对活力。
[0541]
仅观察到用mrna/氨基脂化类肽调配物处理的海拉细胞的活力发生微小变化。通常，几乎所有条件都维持至少80％的活力，其中唯一的例外是化合物5、34和35的调配物。平均而言，含有2％dmg-peg2000的调配物表现出稍高(平均为97％的活力，而不含peg的调配物为89％)。表6示出了用不含peg和2％-peg调配物处理的细胞的相对活力。
[0542]
表6.在用代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物单独(无peg)或含有2％(w/w)dmg-peg2000(2％peg)处理后的体外细胞活力
[0543][0544]
实例10-iv施用代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物后萤火虫荧光素酶(fluc)的体内全身表达。
[0545]
氨基脂化类肽递送媒剂可有效通过多种施用途径将fluc mrna体内施用于balb/c小鼠(n＝3)。简而言之，代表性氨基脂化类肽/fluc调配物(除非另有说明，以5:1的氨基脂化类肽:mrna的质量比制备，含2％w/w dmg-peg2000)以0.5mg/kg的剂量通过尾静脉注射，
并在8小时之后定量所得生物发光。图7a示出了调配物作为靶细胞的在balb/c小鼠中的全身分布。表7示出了在测试小鼠中fluc的体内全身表达，定量为总通量。
[0546]
表7.iv施用代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物后萤火虫荧光素酶(fluc)的体内全身表达(均以5:1的类肽:mrna的质量比制备)
[0547][0548]
通过牺牲经处理的动物、解剖出所关注的器官并分别定量所得生物发光来定量器官特异性生物发光。每个表现最好的氨基脂化类肽的相对表达显著不同。例如，虽然化合物8表现出最高的总体表达，但几乎所有的表达都定位于肺中。然而，其它化合物在其它器官(如在化合物28的情况下的脾，以及化合物24的肝、脾和肺的混合物)中示出了优先定位。
[0549]
图7b示出了调配物的对应器官特异性生物分布(在肺、肾、肝、脾、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结中)。图7c描绘了对调配物的器官特异性生物分布随总光子通量的变化进行定量的条形图。表8示出了针对从经处理的小鼠中获得的肝、肺和脾样品测量的总通量。
[0550]
表8.iv施用代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物后萤火虫荧光素酶(fluc)向内脏器官的体内生物分布
[0551][0552]
除了iv施用外，氨基脂化类肽对于通过皮下(s.c.)或肌内(i.m.)施用途径局部施用mrna也是有效的。表9示出了对经皮下或肌内向balb/c小鼠施用的氨基脂化类肽调配物的选择观察到的总通量。
[0553]
表9.皮下(s.c.)或肌内(i.m.)施用代表性fluc mrna/氨基脂化类肽调配物后萤火虫荧光素酶(fluc)的体内表达
[0554][0555]
对于这些实例，mrna以皮下0.1毫克/千克(mpk)或肌内0.05mpk的剂量施用。在这些情况下，肌内注射后的整体表达更高。虽然对于iv施用观察到使用化合物8的最高表达，但对于im施用，化合物24和28显著优于所述实例，这表明有必要针对不同的施用途径调整这些结构。
[0556]
进行了另外的实验以评估生物分布随氨基脂化类肽与fluc mrna的负载质量比而变化的任何可变性。图8a描绘了氨基脂化类肽化合物28与2％dmg-peg 2000和fluc mrna的调配物在不同类肽:mrna比率(1:1、2:1、5:1、7.5:1和10:1)下的总光子通量绘图。如图8a所示，对于皮下注射，化合物28调配物的最大总光子通量在5:1下观察到，并且对于肌内注射，在7.5:1下观察到。
[0557]
对皮下施用的生物分布曲线的评估是扩展的氨基脂化类肽化合物1-72。向balb/c小鼠皮下施用类肽:mrna比率为5:1的氨基脂化类肽化合物1-72与2％w/w dmg-peg2000和fluc mrna的调配物。每种调配物的总光子通量的观察到的测量结果在图8b和8c中示出。
[0558]
实例11-萤火虫荧光素酶(fluc)在含peg的氨基脂化类肽调配物中的体外细胞类型转染效率
[0559]
细胞培养：在处理之前18小时，将海拉细胞接种在含有10％fbs和1％青霉素/链霉素的100μl dmem中的10,000个孔中，并使其粘附。在即将转染之前用100μl含新鲜血清的dmem替换培养基。hepg2细胞在含有10％fbs和1％青霉素/链霉素的dmem中培养。在处理之前18小时将它们以10,000个细胞/孔接种并使其粘附。jawsii细胞在含有10％fbs、1％青霉素/链霉素、1mm丙酮酸钠和5ng/ml小鼠gm-csf的rpmi培养基中培养。
[0560]
mrna制备：用于转染实验的fluc mrna是使用标准体外转录(ivt)方法在内部制备的。
[0561]
mrna调配：化合物24和79的代表性氨基脂化类肽/fluc调配物(除非另有说明，以5:1的氨基脂化类肽:mrna的质量比制备的)。氨基脂化类肽:mrna混合物与可商购获得的peg脂质(dmg-peg2000；18:0peg1000pe；14:0peg2000 pe；14:0peg5000 pe)、线性氨基聚乙二醇化拟肽(化合物48、56、64和72)或支化氨基聚乙二醇化类肽(化合物106、107、108和109)在聚乙二醇化化合物的重量百分比为0.01％、0.02％、0.05％和0.1％下组合。
[0562]
基于观察到的生物发光(总光子通量)，在处理持续24小时后，在细胞中测量来自这些调配物的fluc表达。为了便于比较，将观察到的总光子通量相对于含有dmg-peg2000作为标准条件的调配物归一化。
[0563]
图9a-9c描绘了对各种细胞类型(图9a中的海拉；图9b中的hepg2；以及图9c中的
jawsii)的fluc mrna的转染效率的体外评估中的归一化总光子通量(cps)。
[0564]
观察到线性聚乙二醇化类肽在较低重量百分比的掺入下示出了高转染效率。当以较高的重量百分比掺入比以较低的重量百分比掺入时，支化聚乙二醇化类肽表现出更好的转染。