技术特征：
1.一种用于诱导干细胞分化的体外方法，其包括：将所述干细胞与至少一种small mothers against decapentaplegic(smad)信号传导的抑制剂、至少一种音猬因子(shh)信号传导的激活剂、和至少一种wingless(wnt)信号传导的激活剂接触；以及将所述细胞与至少一种成纤维细胞生长因子(fgf)信号传导的激活剂接触，以获得表达至少一种指示中脑多巴胺神经元(mda)或其前体的标志物的分化细胞群，其中所述至少一种fgf信号传导的激活剂选自fgf18、fgf17、fgf8a、及其组合。2.一种用于诱导干细胞分化的体外方法，其包括：将所述干细胞与至少一种small mothers against decapentaplegic(smad)信号传导的抑制剂、至少一种音猬因子(shh)信号传导的激活剂、和至少一种wingless(wnt)信号传导的激活剂接触；以及将所述细胞与至少一种成纤维细胞生长因子(fgf)信号传导的激活剂接触，以获得表达至少一种指示中脑多巴胺神经元(mda)或其前体的标志物的分化细胞群，其中，所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂的初始接触是从所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起至少约5天。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂接触至少约1天。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂接触多达约15天。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂接触约5天。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂的初始接触是从所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起至少约5天。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂的初始接触是从所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起约10天。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂的初始接触是从所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起12天。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂接触约5天。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂接触7天。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种shh信号传导的激活剂接触约5天。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种shh信号传导的激活剂接触7天。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种wnt信号传导的激活剂接触约10天。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种wnt信号传
导的激活剂接触12天。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度从其与所述干细胞的初始接触起约4天增加。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度比所述至少一种wnt信号传导的激活剂的初始浓度增加约300％至约1000％。17.根据权利要求15-16中任一项所述的方法，其中所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约3μm至10μm的浓度。18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约3μm的浓度。19.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约7.5μm的浓度。20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述至少一种fgf信号传导的激活剂包括fgf 18。21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述至少一种smad信号传导的抑制剂选自tgfβ/activin-nodal信号传导的抑制剂、骨形态发生蛋白(bmp)信号传导的抑制剂、及其组合。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种tgfβ/activin-nodal信号传导的抑制剂包括alk5的抑制剂。23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述至少一种tgfβ/activin-nodal信号传导的抑制剂包括sb431542、或其衍生物、或其混合物。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述sb431542的衍生物为a83-01。25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述至少一种tgfβ/activin-nodal信号传导的抑制剂包括sb431542。26.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种bmp信号传导的抑制剂包括ldn193189、noggin、多索吗啡、其衍生物、或其混合物。27.根据权利要求21或26所述的方法，其中所述至少一种bmp的抑制剂包括ldn-193189。28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述至少一种wnt信号传导的激活剂包括糖原合成酶激酶3β(gsk3β)信号传导的抑制剂。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述至少一种wnt信号传导的激活剂选自chir99021、wnt3a、wnt1、其衍生物、及其混合物。30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述至少一种shh信号传导的激活剂选自shh蛋白质、平滑激动剂(sag)、其衍生物、及其混合物。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述shh蛋白质包括重组shh、纯化shh、或前述的组合。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述重组shh包括与小鼠音猬因子n端片段具有至少约80％同一性的重组蛋白质。33.根据权利要求31或32所述的方法，其中重组shh包括shh c25ⅱ。34.根据权利要求30所述的方法，其中所述sag包括嘌吗啡胺。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物选自en1、otx2、th、nurr1、foxa2、pitx3、lmx1a、lmo3、snca、adcap1、chrna4、girk2、及其组合。36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中从所述干细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起至少约10天，所述分化细胞具有可检测水平的至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物的表达。37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中从所述干细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起约30天，所述分化细胞具有可检测水平的en1的表达。38.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中从所述干细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起约40天，所述分化细胞具有可检测水平的en1的表达。39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述分化细胞不表达选自以下的至少一种标志物：pax6、emx2、lhx2、sma、six1、pitx2、sim1、pou4f1、phox2a、barhl1、barhl2、gbx2、hoxa2、hoxb2、pou5f1、nanog、及其组合。40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其还包括将所述分化细胞群置于有利于中脑多巴胺神经元前体向中脑多巴胺神经元分化的条件下。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述条件包括将所述细胞暴露于脑源性神经营养因子(bdnf)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、环磷酸腺苷(camp)、转化生长因子β3(tgfβ3)、抗坏血酸(aa)和dapt中的至少一种。42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述干细胞选自人类、非人灵长类或啮齿类非胚胎干细胞；人类、非人灵长类或啮齿类胚胎干细胞；人类、非人灵长类或啮齿类诱导多潜能干细胞；以及人类、非人灵长类或啮齿类重组多潜能细胞。43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述干细胞为人类干细胞。44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述干细胞为多潜能或多能干细胞。45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述干细胞为多潜能干细胞。46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述多潜能干细胞选自胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞、及其组合。47.一种体外分化细胞的细胞群，其中所述体外分化细胞通过权利要求1-46中任一项所述的方法获得。48.一种体外分化细胞的细胞群，其中至少约50％的所述细胞表达至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物，并且少于约50％的所述分化细胞表达至少一种选自以下的标志物：pax6、emx2、lhx2、sma、six1、pitx2、sim1、pou4f1、phox2a、barhl1、barhl2、gbx2、hoxa2、hoxb2、pou5f1、nanog、及其组合。49.根据权利要求48所述的细胞群，其中所述至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物选自en1、otx2、th、nurr1、foxa2、lmx1a、pitx3、lmo3、snca、adcap1、chrna4、girk2、及其组合。50.一种组合物，其包括权利要求48或49所述的细胞群。51.根据权利要求50所述的组合物，其为还包括药学上可接受载体的药物组合物。52.一种从细胞群中分离中脑多巴胺神经元及其前体的方法，其包括分离不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物而表达可检测水平的至少一种阳性表面标志物的细胞。
53.一种从细胞群中分离中脑多巴胺神经元及其前体的方法，其包括分离以下细胞：(a)不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物或表达与所述细胞群中至少一种阴性表面标志物的平均表达水平相比降低水平的至少一种阴性表面标志物；而(b)表达与所述细胞群中至少一个阳性标志物的平均表达水平相比增加水平的至少一种阳性表面标志物。54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述至少一种阴性表面标志物选自cd171、cd184、及其组合。55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述至少一种阴性表面标志物包括cd184。56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述至少一种阴性表面标志物选自cd49e、cd99、cd340、及其组合。57.根据权利要求52-56中任一项所述的方法，其中所述至少一种阴性表面标志物包括cd49e。58.根据权利要求52-57中任一项所述的方法，其中所述方法包括分离不表达可检测水平的cd49e而表达可检测水平的cd184的细胞。59.根据权利要求52-58中任一项所述的方法，其中所述方法包括分离不表达可检测水平的cd49e或表达与所述细胞群中cd49e的平均表达水平相比降低水平的cd49e；而表达与所述细胞群中cd184的平均表达水平相比增加水平的cd184的细胞。60.一种体外分化细胞的细胞群，其中至少约50％的所述细胞表达可检测水平的至少一种阳性表面标志物，而不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物。61.一种体外分化细胞的细胞群，其中至少约50％的细胞表达与细胞群中至少一种阳性标志物的平均表达水平相比增加水平的至少一种阳性表面标志物；而不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物或表达与细胞群中至少一种阴性表面标志物的平均表达水平相比降低水平的至少一种阴性表面标志物。62.根据权利要求60或61所述的细胞群，其中所述至少一种阴性表面标志物选自cd171、cd184及其组合。63.根据权利要求60-62中任一项所述的细胞群，其中所述至少一种阴性表面标志物包括cd184。64.根据权利要求60-63中任一项所述的细胞群，其中所述至少一种阴性表面标志物选自cd49e、cd99、cd340、及其组合。65.根据权利要求60-64中任一项所述的细胞群，其中所述至少一种阴性表面标志物包括cd49e。66.根据权利要求60-65中任一项所述的细胞群，其中所述至少一种阴性表面标志物包括cd184，且所述至少一种阴性表面标志物包括cd49e。67.一种组合物，其包括权利要求60-66中任一项所述的细胞群。68.根据权利要求67所述的组合物，其为还包括药学上可接受载体的药物组合物。69.一种用于诱导干细胞分化为中脑多巴胺神经元或其前体的试剂盒，其包括：(a)至少一种smad信号传导的抑制剂；(b)至少一种shh信号传导的激活剂；(c)至少一种wnt信号传导的激活剂；和
(d)至少一种fgf信号传导的激活剂。70.根据权利要求69所述的试剂盒，其还包括(f)用于将所述干细胞诱导分化为表达至少一种中脑da前体标志物的分化细胞群的说明。71.一种预防和/或治疗受试者中神经退行性疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的以下中的一种：(a)权利要求47-49和60-66中任一项所述的细胞群；或(b)权利要求50、51、67和68中任一项所述的组合物。72.根据权利要求68所述的方法，其中所述神经退行性疾病为帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默症、或多发性硬化症。73.根据权利要求47-49和60-66中任一项所述的细胞群或根据权利要求50、51、67和68中任一项所述的组合物，其应用于预防和/或治疗受试者中的神经退行性疾病。74.根据权利要求73所述的细胞群或组合物的应用，其中所述神经退行性疾病为帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默症、或多发性硬化症。
技术总结
本公开提供产生中脑多巴胺神经元(mDA)及其前体的方法、由此方法产生的mDA及其前体、以及包含这些细胞的组合物、以及其用于预防和/或治疗神经疾病的用途。本公开还提供使用新型表面标志物从细胞群中分离mDA及其前体的方法。法。法。
技术研发人员：L
受保护的技术使用者：纪念斯隆-凯特琳癌症中心
技术研发日：2020.08.31
技术公布日：2022/6/21