用于调节因子VIII功能的组合物和方法与流程

用于调节因子viii功能的组合物和方法
1.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求2019年12月6日提交的美国临时专利申请号62/944,718的优先权。上述申请通过引用并入本文。
2.本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金号为nhlbi k08 hl 146991-01的政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定的权利。
技术领域
3.本发明涉及医学和血液学领域。更具体地，本发明提供了新的因子viii变体和使用其来调节有需要的患者的凝血级联的方法。


背景技术：

4.在整个说明书中引用了若干出版物和专利文献，以描述本发明所属领域的现有技术。这些引用中的每一个都通过引用并入本文，如同完整阐述一样。
5.凝血因子viii(fviii)在血液中循环，与其载体蛋白血管性血友病因子(vwf)紧密结合(eaton,等人(1986)biochemistry 25(2):505-512；vehar,等人(1984)nature 312(5992):337-342；lollar,等人(1988)j.biol.chem.,263(21):10451-10455)。由凝血酶进行的蛋白水解加工从vwf释放fviii并产生活性辅因子种类(fviiia)，它是由与金属离子稳定的a1/a3-c1-c2异二聚体弱结合的a2结构域组成的异源三聚体(vehar,等人(1984)nature(1984)312(5992):337-342；fay,等人(1992)j.biol.chem.,267(19):13246-13250)。因子viiia与阴离子磷脂表面上的激活的fix(fixa)结合，形成内在的xase酶复合物，这是激活fx的两种酶之一(eaton,等人(1986)biochemistry 25(2):505-512；hill-eubanks,等人(1990)j.biol.chem.,265(29):17854-17858；lenting,等人(1994)j.biol.chem.,269(10):7150-7155；venkateswarlu,d.(2014)biochem.biophys.res.comm.,452(3):408-414；kolkman,等人(1999)biochem j.,339(pt2):217-221；fay,等人(1998)j.biol.chem.,273(30):19049-19054；kolkman,等人(1999)274(41):29087-29093；kolkman,等人(2000)biochemistry39(25):7398-7405)。fviii的缺乏或功能障碍导致血友病a(ha)，这突出了fviiia辅因子功能的重要性。内在xase功能的下调是通过抗凝血酶和可能的蛋白s(ps)对fixa的抑制来实现的，以及通过自发的a2结构域解离或通过活化的蛋白c(apc)在arg336和arg562处的蛋白水解切割使fviiia失活来实现的(lollar,等人(1991)j.biol.chem.,266(19):12481-12486；hultin,等人(1981)blood57(3):476-482；lollar,等人(1984)blood 63(6):1303-1308；lollar,等人(1990)j.biol.chem.,265(3):1688-1692；walker,等人(1987)arch.biochem.biophys.,252(1):322-328；plautz,等人(2018)arterioscler.thromb.vasc.biol.,38(4):816-828；fay,等人(1991)j.biol.chem.,266(30):20139-20145)。由于fviiia对增加fixa功能具有如此深远的影响(10
3-106倍)，因此其失活对于调节内在xase功能很重要(van dieijen,等人(1981)j.biol.chem.,256(7):3433-3442；mertens,等人(1984)biochem.j.,223(3):599-605)。
6.在被凝血酶激活后，fviiia由于自发的a2结构域解离而在几分钟内失去活性(lollar,等人(1991)j.biol.chem.,266(19):12481-12486；hultin,等人(1981)blood 57(3):476-482；lollar,等人(1984)blood 63(6):1303-1308；lollar,等人(1990)j.biol.chem.,265(3):1688-1692；lu,等人(1996)blood 87(11):4708-4717；fay,等人(1991)j.biol.chem.,266(14):8957-8962)。这种机制的生理相关性体现在一些轻微的ha突变，这些突变会在fviiia异源三聚体中降低a2亲和力(mcginniss,等人(1993)genomics 15(2):392-398；duncan,等人(1994)br.j.haematol.,87(4):846-848；rudzki,等人(1996)br.j.haematol.,94(2):400-406；hakeos,等人(2002)thromb.haemost.,88(5):781-787；pipe,等人(2001)blood97(3):685-691；pipe,等人(1999)blood 93(1):176-183)。a2结构域解离在调节fviiia功能中的假定重要性已被用于成功地生物工程具有增强的结构域间相互作用的变体，从而改善止血功能(leong,等人(2015)blood 125(2):392-398；wakabayashi,等人(2008)blood 112(7):2761-2769；gale,等人(2003)j.thromb.haemostasis 1(9):1966-1971；gale,等人(2008)j.biol.chem.,283(24):16355-16362)。总之，现有的生化、临床和体内数据支持a2结构域解离是调节fviiia功能的重要机制。相比之下，之前的生化研究表明，apc使fviiia失活会在数小时内发生(fay,等人(1991)j.biol.chem.,266(30):20139-20145；lu,等人(1996)blood 87(11):4708-4717)。与apc切割相比，a2解离的速度更快，这表明前者是fviiia失活的主要机制(lollar,等人(1991)j.biol.chem.,266(19):12481-12486；hultin,等人(1981)blood 57(3):476-482；lollar,等人(1984)blood 63(6):1303-1308；lollar,等人(1990)j.biol.chem.,265(3):1688-1692；lu,等人(1996)blood 87(11):4708-4717；fay,等人(1991)j.biol.chem.,266(14):8957-8962)。与这种理解一致，不存在描述的与改变的fviii/fviiia的apc切割相关的临床表型(bezemer,等人(2008)jama299(11):1306-1314；eahad f8基因变体数据库)。这与fv形成对比，fv类似于fviii，其中apc抗性(fv-leiden，arg506gln)在纯合或杂合状态下分别使静脉血栓形成风险增加50至100倍和5至10倍，并且是最常见的遗传性易栓症(inherited thrombophilia)(bertina,等人(1994)nature 369(6475):64-67；zoller,等人(1994)lancet 343(8912):1536-1538；zoller,等人(1994)j.clin.invest.,94(6):2521-2524；juul,等人(2002)blood 100(1):3-10；suzuki,等人(1983)j.biol.chem.,258:1914-1920)。
7.如上所解释的，因子viii(fviii)中的突变可导致严重的出血性疾病，并与a型血友病有关。fviii缺陷或缺乏fviii活性导致无法有效形成凝块。迄今为止，由于费用高昂，全世界只有20％的血友病a患者接受fviii替代疗法的常规治疗。通常，所述fviii是血浆来源的或重组产生的。基于aav载体的血友病a的基因疗法是有前景的，但由于对所述载体的异常免疫应答而存在安全性限制。因此，生成增强的fviii分子将有利于血友病的治疗。因此，显然需要具有改善的生物学特性的fviii分子。


技术实现要素：

8.根据本发明，提供了用于在有此需要的患者中调节止血的组合物和方法。更具体地，提供了调节(例如，增加)止血的因子viii(fviii)变体。在一个特定的实施方案中，所述因子viii变体在位置336和/或562处包含至少一个突变。在一个特定的实施方案中，位置
336和/或562处的arg被gln取代。还提供了包含至少一种本发明的fviii变体和至少一种药学上可接受的载体的组合物。还公开了编码本发明的fviii变体的核酸分子及其使用方法。本发明的另一方面包括表达本文所述的fviii变体的宿主细胞。还公开了分离和纯化所述fviii变体的方法。
9.还提供了药物组合物，其在载体中包含本发明的fviii变体和/或编码fviii变体的核酸分子。本发明还包括用于在有此需要的患者中治疗止血相关病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述fviii变体或编码所述fviii变体的核酸分子，尤其是在药物组合物中。这些方法在需要促凝血剂的疾病的治疗中具有功效，并且所述疾病包括但不限于血友病，特别是血友病a。
附图说明
10.图1a提供了fviii的氨基酸序列(seq id no:1)。位置336和562处的氨基酸以粗体显示并加下划线。所述b结构域也用斜体和粗体表示。372、740和1689处的凝血酶切割位点精氨酸用斜体和下划线表示。所提供的氨基酸序列在n末端缺少19个氨基酸的信号肽(mqielstcfflcllrfcfs(seq id no:2))。图1b提供了fviii结构域结构的示意图，其中注明了凝血酶和apc切割位点。
11.图2a提供了1.5μmfviii-wt和fviii-qq在与10nm凝血酶温育20分钟之前和之后的sds-page分析。凝胶用考马斯蓝染色。sc，单链；hc，重链；lc，轻链。图2b提供了在4μm pcps和7.5mm cacl2存在下用1pm fxia启动的在用不同浓度的fviii-wt(实线)或fviii-qq(虚线)重构的ha人类血浆中的凝血酶生成的代表性追踪。图2c示出了由内在xase测定确定的a2结构域解离导致的fviiia活性下降。将5nm fviiia-wt(正方形)或fviiia-qq(三角形)与100nm凝血酶温育30秒，并在15分钟的温育过程中评估fviiia的残留活性。所示数据代表三个独立实验。
12.图3a提供了10nm fviiiwt和fviii-qq与6nm apc、20μm pcps和6nm水蛭素温育30分钟后的蛋白质印迹分析。用抗a2抗体(gma-012)使fviii片段可视化。图3b提供了10nm fviii-wt、fviii-qq和fviii-r372q与6nm apc、20μm pcps和6nm水蛭素温育30分钟后的蛋白质印迹分析。将30ng纯化的蛋白上样到凝胶上，并用gma-012使fviii片段可视化。图3c提供了在纯化的内在xase测定中，与在20μm pcps和6nm水蛭素存在下6nm apc和100nm ps对10nm fviii-wt(空心方块)和fviii-qq(空心三角形)的失活相比，在20μmpcps和6nm水蛭素存在下，6nm apc对10nm fviii-wt(实心方块)和fviii-qq(实心三角形)的失活随时间变化的图。将整个温育过程中fxa生成的初始速度与0分钟时间点进行比较以确定残留的fviii活性。绘制了重复实验的代表性图。将数据拟合至指数衰减或线性回归(仅具有apc的fviii-qq)。图3b提供了10nm fviii-wt、fviii-qq和fviii-r372q、20μm pcps和6nm水蛭素与100nm ps或6nm apc或6nm apc和100nm ps温育2分钟和30分钟后的蛋白质印迹分析。将20ng纯化的蛋白上样到凝胶上，并用gma-012使fviii片段可视化。fviii-r372q对在arg
372
处的切割具有抗性。图3e提供了apc对wt fviii和fviii-qq进行切割的时间过程的蛋白质印迹。
13.图4a-4d示出了apc对fviii-wt/fviiia-wt与fviii-qq/fviiia-qq对重构的ha人类和小鼠血浆中凝血酶生成的影响。在用fviii与4μmpcps和7.5mmcacl2重构的ha血浆中，
在apc浓度增加的情况下评估凝血酶的生成。图4a：用1nm fviii-wt(正方形)或fviii-qq(三角形)重构ha人血浆，并用1pm fxia启动凝血酶生成。图4b：用30nm凝血酶激活1.5nm fviii30秒，然后用60nm水蛭素淬灭。用0.2nm fviiia-wt或fviiia-qq重构ha人类血浆。用10pm fxia启动凝血酶生成。图4c：用1nm fviii-wt(正方形)或fviii-qq(三角形)重构ha小鼠血浆，并用30pm fxia启动凝血酶生成。图4d：用30nm凝血酶激活1.5nm fviii30秒，然后用60nm水蛭素淬灭。用0.2nm fviiia-wt或fviiia-qq重构ha小鼠血浆。用400pm fxia启动凝血酶生成。在两个组中，残留峰值凝血酶代表相对于0nm apc条件的峰值凝血酶。绘制了四个独立实验的平均值
±
sem。图4e示出了stm对fviii-wt与fviii-qq对重构的ha人类血浆中凝血酶生成的影响。在4μm pcps、0.1pm fxia和7.5mm cacl2存在的情况下用1nm fviii-wt(正方形)或fviii-qq(三角形)重构的ha人类血浆中，在stm浓度增加的情况下评估凝血酶的生成。残留峰值凝血酶代表相对于0nm stm条件的峰值凝血酶。绘制了四个独立实验的平均值
±
sem。对于0nm stm条件：峰值凝血酶的值(nm)：fviii-wt：533.65
±
4.69，fviii-qq：561.85
±
6.10；延迟时间(分钟)fiii-wt：14.5
±
1.5，fviii-qq：14.0
±
1.0。
14.图5a-5d示出了在ha小鼠中fviii-qq与fviii-wt相比表现出优越的体内止血功能或凝块形成。在经历尾夹损伤(图5a)或7.5％fecl3损伤(图5c)之前，对ha小鼠注入pbs(空心菱形)或浓度增加的fviiiwt(正方形)或fviii-qq(三角形)，其中有或没有所示的10mg/kgmab1609。注入pbs(黑色圆圈)的wt小鼠用作止血正常的对照。每个点代表单一小鼠，并显示了中位数和四分位距。使用kruskal-wallis检验来确定相对于wtpbs对照的显著性，其中p值≤0.1被认为是显著的(p≤0.1＝*,p≤0.05＝**,p≤0.01＝***)。通过将尾夹(图5b)和7.5％fecl3损伤(图5d)数据与逻辑函数(实线)进行经验拟合来确定fviii-wt和fviii-qq的剂量依赖性血管闭塞。点代表中值，误差线是iqr。ec50和ec80值由逻辑拟合确定。虚线表示止血正常对照的中值。n.s.表示不显著。图5e示出了ha小鼠中fviii-wt和fviii-qq的半衰期研究。在ha小鼠注射125iu/kg的fviii-wt或fviii-qq后，在指定的时间点测定fviii活性。每个点代表三只个体小鼠，并绘制了平均值和平均值的标准误差。通过将数据拟合到指数衰减曲线来计算半衰期值。
15.图6a-6b示出了apc对fviii-wt/fviiia-wt与fviii-qq/fviiia-qq对重构的ha/fvl鼠血浆中凝血酶生成的影响。在含有4μm pcps和7.5mm cacl2的fviii重组的ha/fvl鼠血浆中在apc浓度增加的情况下评估凝血酶生成。图6a：用1nm fviii-wt(正方形)或fviii-qq(三角形)重构ha/fvl血浆，并用30nm fxia启动凝血酶生成。图6b：用凝血酶(30nm)激活10nm fviii30秒，并用60nm水蛭素淬灭。用0.2nm fviiia-wt或fviiia-qq重构ha/fvl鼠血浆。用400pm fxia启动凝血酶生成。在两个组中，残留峰值凝血酶代表相对于0nm apc条件的峰值凝血酶。绘制了四个独立实验的平均值
±
sem。
16.图7示出了fviii-qq相对于fviii-wt增强的止血效果是apc依赖性的。将ha/fvl小鼠注入2μg/kg的pbs(空心菱形)、fviii-wt(正方形)或fviii-qq(三角形)，其中有或没有所示的10mg/kg的mapc抗凝抑制抗体(mab1609)，然后使所述小鼠经历尾夹损伤。每个点代表一只鼠标，并显示具有iqr的中位数。使用kruskal-wallis检验来确定相对于fvl pbs对照的显著性，其中p值≤0.1被认为是显著的(p≤0.1＝*,p≤0.05＝**,p≤0.01＝***)。n.s.表示不显著。
17.图8a提供了ha/fvl血浆中凝血酶生成随apc和wt fviii、fviii-qq、fviii-r336q
和fviii-r562q浓度增加的图。图8b提供了在尾夹测定后ha/fvl小鼠的失血图。还示出了fvl小鼠对照。用pbs或wt fviii、fviii-qq、fviii-r336q或fviii-r562q对小鼠进行了处理。
具体实施方式
18.血友病a(ha)和血友病b(hb)分别是由于凝血因子viii(fviii)或凝血因子ix(fix)的遗传性缺陷而造成的x连锁出血性疾病(peyvandi,等人,lancet(2016)388:187-197；konkle,等人,hemophilia a in genereviews,adam,等人.,编,university of washington(1993))。出血表型通常与残留因子活性有关：患有重度疾病(因子活性《正常值的1％)的人经常自发性出血；患有中度疾病(因子活性为正常值的1％-5％)的人很少会自发性出血，但受到轻微的创伤就会出血；以及患有轻度疾病(因子活性为正常值的5％-40％)的人在侵入性手术或创伤期间会出血。鉴于因子活性和出血表型之间这种明确限定的关系，ha和hb是蛋白质输注或基因疗法的有吸引力的靶标，因为因子水平的小幅提高有望产生有意义的临床影响。
19.如上所述，因子viii对于凝血活性至关重要，而且fviii基因的突变会导致血友病a，这是血友病的最常见形式。在本文中，示出了fviii的氨基酸序列的特定改变与增强的蛋白质对蛋白水解失活的抗性有关。因此，本发明提供了合理设计的氨基酸残基修饰，其提供了优越的变体。
20.全长fviii是一种主要在肝窦内皮细胞(lsec)和肝外内皮细胞中表达的280kda大蛋白(fahs,等人,blood(2014)123:3706-3713；everett,等人,blood(2014)123:3697-3705)。fviii主要作为通过非共价金属依赖性相互作用结合的重链和轻链的异二聚体循环(lenting,等人,blood(1998)92:3983-3996)。因子viii包含多个结构域，并且长度为2332个氨基酸(成熟时没有信号肽)。通常，将所述结构域称为a1-a2-b-a3-c1-c2。fviii被翻译为具有a1-α1-a2-α2-b-α3-a3-c1-c2的结构域结构的单肽链(单链)。反式高尔基弗林蛋白酶(protease furin)在r-1313和/或r-1648处将fviii蛋白水解切割导致异二聚体形成。fviii重链(a1-α1-a2-α2-b)和轻链(α3-a3-c1-c2)通过a1和a3结构域之间存在的非共价金属离子依赖性相互作用保持关联。最初，fviii处于与血管性血友病因子(vwf)结合的非活性形式。fviii通过被凝血酶(因子iia)切割而激活并释放b结构域。fviii(fviiia)的活化形式与vwf分离并与凝血因子ixa相互作用-导致通过凝血级联形成血凝块。在凝血过程中，fviii单链或异二聚体通过在r-372、r-740和r-1689处被凝血酶切割而被激活为其异三聚体辅助因子形式。a2通过非共价相互作用与a1-α1保持关联。fviiia的失活是通过自发的a2解离和/或蛋白水解切割而发生的，主要在r-336和r-562处由活化的蛋白c进行。
21.所述b结构域包含蛋白质的40％(908个氨基酸)，并且对于蛋白质促凝活性不是必需的(brinkhous,等人,proc.natl.acad.sci.(1985)82:8752-8756)。最常见的b结构域缺失的(bdd)fviii包含14个原始氨基酸残基(sfsqnppvlkrhqr(seq id no:3))作为接头(lind,等人(1995)eur.j.biochem.,232(1):19-27)。此bdd fviii通常称为bdd-sq或hfviii-sq。取代b结构域的短肽接头(例如，25个或更少的氨基酸、20个或更少的氨基酸、15个或更少的氨基酸、或10个或更少的氨基酸)可被用于fviii变体(lind,等人(1995)eur.j.biochem.,232(1):19-27；pittman,等人,blood(1993)81:2925-2935；toole,等人,
proc.natl.acad.sci.(1986)83:5939-5942)。在一个特定的实施方案中，所述肽接头在glu1649的-1和-4位包含碱性氨基酸(例如，arg、his或lys)。这种bdd fviii形式通常用于生产重组bdd-fviii(约4.4kb)以及用于基因治疗(berntorp,e.,semin.hematol.(2001)38(2suppl 4):1-3；gouw,等人,n.engl.j.med.(2013)368:231-239；xi,等人,j.thromb.haemost.(2013)11:1655-1662；recht,等人,haemophilia(2009)15:869-880；sabatino,等人,mol.ther.(2011)19:442-449；scallan,等人,blood(2003)102:2031-2037)。如上所述，由于aav(4.7kb)和其他载体系统的包装能力有限，使用aav载体的基因疗法只能使用缩短的fviii分子，例如bdd-fviii(lind,等人(1995)eur.j.biochem.,232(1):19-27)。通过引用的方式并入本文的美国专利8,816,054也提供了具有不同长度和序列的接头的bdd fviii分子。
22.fviiia是内在xase复合物中fxia的辅助因子，其功能是产生fxa，从而导致凝血级联的传播。fviiia失活被认为是内在xase下调的主要原因。fviiia失活是由于1)自发的a2解离或2)活化的蛋白c(apc)蛋白水解切割(例如，将a2切割成a2n和a2c)。生化和临床数据支持a2解离的重要性。事实上，在纯化系统中5分钟后90％的fviiia活性丧失(lollar,等人(1991)j.biol.chem.,266:12481-12486)。此外，临床数据显示，1/3的轻度血友病患者具有导致增强的a2解离的突变。关于切割，apc切割导致纯化系统中4小时后fviii活性丧失90％(lu等人(1996)blood 87(11):4708-17)。然而，与a2解离的改变不同，没有已知的临床表型与改变的apc切割相关。
23.虽然现有数据未能确定apc在调节fviiia功能中的重要作用，但缺乏临床表型并不能排除apc介导的切割在fviiia失活中的潜在意义。此外，应谨慎对待仅基于体外失活率而试图将生理学意义归因于fviiia2结构域解离或apc失活。许多实验条件，许多非生理条件，已被用于研究这些机制，使解释和感知的意义复杂化。令人惊讶的是，尽管对fviii进行了数十年的研究，但apc在体内fviiia调节中的作用尚未得到检验。
24.为了研究apc切割在fviiia失活中的作用，在两个已知的fviii apc切割位点arg336和arg562处引入了gln错义突变，产生了对apc切割具有抗性的fviii变体(fviii-r336q/r562q[fviii-qq])。与在fviiia调节中具有显著体内作用的apc一致，fviii-qq以apc依赖的方式表现出相对于野生型fviii优越的止血功效。
[0025]
根据本发明，提供了新的因子viii变体。本发明包括fviii变体，所述fviii变体包括fviiia变体和fviii前肽变体。为了简单，所述变体通常在整个申请中在fviii的背景下进行描述。然而，本发明考虑并涵盖具有与fviii中所述相同的氨基酸取代和/或接头的因子fviiia和fviii前肽分子以及因子viii结构域(例如，a1和/或a2结构域)。在一个特定的实施方案中，本发明的fviii变体表达为单链分子或至少几乎仅表达为单链分子。在一个特定的实施方案中，所述fviii变体是b-结构域缺失(bdd)的fviii(任选地包含代替b-结构域的接头)。在一个特定的实施方案中，所述fviii变体包含a1-α1-a2-α2-b-α3-a3-c1-c2。在一个特定的实施方案中，所述fviii变体包含a1-α1-a2-α2-α3-a3-c1-c2。在一个特定的实施方案中，所述fviii变体包含a1-α1-a2-α2-a3-c1-c2。在一个特定的实施方案中，所述fviii变体包含轻链和重链(例如，作为单链分子)。
[0026]
如本文所证明的，本发明的fviii变体比wt fviii具有更大的apc切割抗性。另外，本文还证明了本发明的fviii变体与wt fviii相比具有出乎意料的优越止血效果。以前，预
计apc抗性fviii具有与wt fviii大致相同的体内功能，因为如上所述，a2解离被认为是fviiia失活的主要机制。如本文所示，本发明的fviii变体具有与wt fviii相同的活性特性，但本发明的fviii变体出人意料地被证明体内止血功能比野生型蛋白质好约5倍。
[0027]
本发明的fviii变体可以来自任意哺乳动物物种。在一个具体实施方案中，所述fviii变体来自人类。基因id：2157和genbank登录号nm_000132.3和np_000123.1提供了野生型人类fviii(特别是包含信号肽的前肽)的氨基酸和核苷酸序列的实例。图1提供了seq id no:1，其是人类因子fviii的氨基酸序列的实例。seq id no:1在其n末端缺少19个氨基酸的信号肽(mqielstcfflcllrfcfs(seq id no:2))。从提供的氨基酸序列以及提供的genbank登录号可以容易地确定编码因子fviii变体的核酸分子。
[0028]
根据本发明的另一方面，所述因子viii变体在位置336和/或562处包含至少一个突变。如本文所示，这些fviii变体与野生型fviii相比对apc切割具有更大的抗性。在某些实施方案中，因子viii变体在位置336处包含突变。在一个特定的实施方案中，位置336处的arg(r)被lys(k)取代。在一个特定的实施方案中，位置336处的arg被asp(d)、glu(e)、asn(n)或gln(q)取代。在一个特定的实施方案中，位置336处的arg被asn(n)或gln(q)取代。在一个特定的实施方案中，位置336处的arg被gln(q)取代。
[0029]
在某些实施方案中，因子viii变体在位置562处包含突变。在一个特定的实施方案中，位置562处的arg(r)被lys(k)取代。在一个特定的实施方案中，位置562处的arg被asp(d)、glu(e)、asn(n)或gln(q)取代。在一个特定的实施方案中，位置562处的arg被asn(n)或gln(q)取代。在一个特定的实施方案中，位置562处的arg被gln(q)取代。
[0030]
如上所述，本发明的fviii变体可以是人类的。在一个具体实施方案中，本发明的fviii变体与seq id no：1(或其片段或结构域或其活化的fviii片段)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性(同一性)，特别是至少90％、95％、97％或99％的同源性(同一性)。在一个具体实施方案中，所述fviii变体包含与seq id no：1的氨基酸1-740(或其片段或结构域或其活化的fviii片段)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性(同一性)，特别是至少90％、95％、97％或99％的同源性(同一性)的氨基酸序列，以及包含与seq id no：1的氨基酸1649-2332或1690-2332(或其片段或结构域或其活化的fviii片段)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性(同一性)，特别是至少90％、95％、97％或99％的同源性(同一性)的氨基酸序列。上述同源性(同一性)百分比不包括在336和/或562处的取代。
[0031]
本发明的fviii变体也可以是翻译后修饰的。可以将所述fviii变体在细胞(特别是人类细胞)中或在体外翻译后修饰。
[0032]
在一个特定的实施方案中，本发明的fviii变体与野生型fviii相比对切割和/或失活(例如，通过apc)具有增加的抗性。
[0033]
编码上述fviii变体(或其片段或结构域或其活化片段)的核酸分子也包括在本发明中。编码所述变体的核酸分子可通过本领域已知的任意方法制备。所述核酸分子可以保持在任意方便的载体，具体地，表达载体中。
[0034]
包含至少一种fviii变体和至少一种载体(例如，药学上可接受的载体)的组合物也包括在本发明中。在一个具体的实施方案中，所述fviii在组合物中是分离的和/或基本上纯的。包含至少一种fviii变体核酸分子和至少一种载体的组合物也包括在本发明中。除
非任何常规载体与待施用的变体均不相容，否则考虑其在药物组合物中的用途。在一个具体实施方案中，所述载体是用于静脉内施用的药学上可接受的载体。
[0035]
定义
[0036]
上文和整个说明书以及权利要求书中使用了与本发明的生物分子有关的多种术语。
[0037]
短语“止血相关病症”是指出血性病症，例如但不限于血友病a、血友病b、血友病a和b患者、具有抑制性抗体的、至少一种凝血因子(例如，因子vii、viii、ix、x、xi、v、xii、ii和/或血管性血友病因子；具体地，因子viii)有缺陷的、联合的fv/fviii缺陷的、维生素k环氧化物还原酶c1缺陷的、γ-羧化酶缺陷的血友病、与创伤或损伤、血栓形成、血小板减少、中风、凝血病(低凝固性)、弥散性血管内凝血(dic)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林(warfarin)或小分子抗血栓药物(例如fxa抑制剂)相关的过度抗凝；以及血小板病症，如bernard soulier综合征、glanzman血栓形成(glanzman thromblastemia)和储存池缺陷(storage pool deficiency)。在一个特定的实施方案中，术语“止血相关病症”是指以过度和/或不受控制的出血为特征的出血性病症(例如可以用促凝剂治疗的病症)。在一个具体实施方案中，所述止血相关病症是血友病。在一个具体实施方案中，所述止血相关病症是血友病a。
[0038]
关于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。该术语，当应用于dna时，是指从与其起源的生物体的天然存在的基因组中紧接连续(在5'和3'方向上)的序列中分离的dna分子。例如，“分离的核酸”可包含插入载体(例如质粒或病毒载体)中的，或整合到原核生物或真核生物的dna中的dna或cdna分子。关于本发明的rna分子，术语“分离的核酸”主要是指由如上定义的分离的dna分子编码的rna分子。或者，该术语可以指从与其天然状态(即，在细胞或组织中)相关联的rna分子中充分分离的rna分子，使得其以“基本上纯的”形式存在。
[0039]
关于蛋白质，本文有时使用术语“分离的蛋白质”。该术语可以指通过表达本发明的分离的核酸分子产生的蛋白质。或者，该术语可以指与其天然相关联的其他蛋白质充分分离的蛋白质(例如，从而以“基本上纯的”形式存在)。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或排除不干扰基本活性的杂质的存在(并且杂质是可能存在的，例如，由于不完全的纯化)，或排除添加稳定剂。
[0040]
术语“载体”是指载体核酸分子(例如rna或dna)，其中可以插入用于导入宿主细胞的核酸序列，所述核酸序列将在所述宿主细胞中被复制。“表达载体”是含有基因或核酸序列的特化载体，所述基因或核酸序列具有在宿主细胞中表达所需的必需调节区(例如启动子)。
[0041]
术语“可操作地连接”是指将编码序列表达所必需的调节序列置于dna分子中相对于编码序列的适当位置，以实现编码序列的表达。有时将该相同定义应用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。该定义有时也适用于第一和第二核酸分子的核酸序列的排列，其中产生杂合核酸分子。
[0042]
术语“基本上纯的”是指制剂包含至少50-60重量％的目标化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白质等)，具体地，至少75重量％，或至少90-99重量％或更多的目标化合物。纯度可以通过适合于目标化合物的方法(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、hplc分析等)测量。
[0043]“药学上可接受的”表示由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物的，并且更具体地，用于人类的。
[0044]“载体”是指，例如，稀释剂、佐剂、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、增溶剂(例如聚山梨醇酯80)、乳化剂、缓冲剂(例如，tris hcl、乙酸盐、磷酸盐)、抗菌剂、填充物质(例如，乳糖、甘露糖醇)、赋形剂、辅助剂或用于施用本发明活性剂的媒介物。药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。优选将水或盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液用作载体，特别是对于可注射溶液。合适的药物载体描述于e.w.martin的“remington's pharmaceutical sciences”(mack publishing co.，easton，pa)；gennaro，a.r.，remington：the science and practice of pharmacy，(lippincott，williams and wilkins)；liberman等人，编辑，pharmaceutical dosage forms，marcel decker，new york，n.y.；和kibbe等人，编辑，handbook of pharmaceutical excipients，american pharmaceutical association，washington。
[0045]
编码变体的核酸分子和多肽的制备
[0046]
编码本发明变体的核酸分子可以通过使用重组dna技术方法制备。核苷酸序列信息的可用性使得能够通过多种手段制备本发明的分离的核酸分子。例如，可以使用本领域熟知的标准方案从合适的生物来源分离编码变体的核酸序列。
[0047]
可以将本发明的核酸在任意方便的克隆载体中保持为rna或dna。在一个具体实施方案中，将克隆保持在质粒克隆/表达载体(例如pbluescript(stratagene，la jolla，ca))中，所述载体在合适的大肠杆菌宿主细胞中繁殖。或者，可以将所述核酸保持在适于在哺乳动物细胞中表达的载体中。在翻译后修饰影响变体功能的情况下，优选在哺乳动物细胞，特别是人类细胞中表达该分子。
[0048]
本发明的编码fviii变体的核酸分子包括cdna、基因组dna、rna及其片段，其可以是单链或双链的。因此，本发明提供了具有能够与本发明的核酸分子的至少一个序列杂交的序列的寡核苷酸(dna或rna的正义链或反义链)。此类寡核苷酸可用作检测变体表达的探针。
[0049]
根据已知方法，可以以多种方式制备本发明的fviii变体。可以从合适的来源(例如，表达fviii变体的转化的细菌或动物(例如哺乳动物或人类)培养的细胞或组织)中纯化蛋白质，例如，通过免疫亲和纯化。编码变体的核酸分子的可用性使得能够使用本领域已知的体外表达方法产生变体。例如，可以将cdna或基因克隆到合适的体外转录载体中，例如用于体外转录的psp64或psp65，然后在合适的无细胞翻译系统(例如小麦胚芽或兔网织红细胞裂解液)中进行无细胞翻译。体外转录和翻译系统是可商购的，例如从promega或life technologies。
[0050]
或者，可以通过在合适的原核或真核表达系统中表达来产生更大量的变体。例如，可以将编码fviii变体的dna分子的部分或全部插入适于在细菌细胞中，例如大肠杆菌，或在哺乳动物细胞(特别是人类细胞)中，例如cho或hela细胞，表达的质粒载体中。或者，可以产生包含变体的带标记的融合蛋白。这种变体标记的融合蛋白由部分或全部dna分子编码，所述dna分子在正确的密码子阅读框中与编码部分或全部所需多肽标签的核苷酸序列连接，所述多肽标签插入适于在细菌细胞中表达的质粒载体中，所述细菌细胞例如大肠杆菌
或真核细胞，例如但不限于酵母和哺乳动物细胞，特别是人类细胞。如上所述的载体包含在宿主细胞中表达dna所必需的调节元件，所述调节元件以允许dna在宿主细胞中表达的方式定位。此类表达所需的调节元件包括但不限于启动子序列、转录起始序列和增强子序列。
[0051]
通过在重组原核或真核系统(特别是人类)中的基因表达产生的fviii变体蛋白可以根据本领域已知的方法纯化。在一个具体实施方案中，可以使用市售的表达/分泌系统，由此表达重组蛋白，然后从宿主细胞分泌，以便从周围培养基中容易地纯化。如果不使用表达/分泌载体，另一种方法包括通过亲和分离纯化重组蛋白，例如通过使用与重组蛋白特异性结合的抗体来进行免疫相互作用，或通过镍柱来分离在它们的n-末端或c-末端带有6-8个组氨酸残基标签的重组蛋白。其他的标签可以包括但不限于flag表位、gst或血凝素表位。这些方法通常由熟练的从业者使用。
[0052]
通过上述方法制备的fviii变体蛋白质可以根据标准程序分析。例如，根据已知方法，可以对这些蛋白质进行氨基酸序列分析。
[0053]
如上所述，产生本发明的多肽的便利方式是通过在表达系统中使用核酸来表达编码它的核酸。用于本发明方法的各种表达系统是本领域技术人员熟知的。
[0054]
因此，本发明还包括制备(如所公开的)多肽的方法，该方法包括从编码多肽的核酸(通常是核酸)表达。这可以在引起或允许产生多肽的适当条件下通过培养含有这种载体的宿主细胞来方便地实现。多肽也可以在体外系统中产生，例如在网织红细胞裂解液中。
[0055]
fviii变体蛋白和编码变体的核酸的用途
[0056]
本发明的fviii变体蛋白和核酸可以例如用作调节凝血级联系统的治疗剂和/或预防剂。本发明的fviii变体蛋白和核酸可以治疗有效量施用以调节(例如，增加)止血和/或形成凝块和/或停止或抑制出血或异常出血。本文证明fviii变体具有优异的性质并且可以提供有效的止血。
[0057]
在本发明的一个具体实施方案中，fviii变体可以通过在生物相容的载体中注入，例如通过静脉内注射，向患者施用。本发明的fviii变体可任选地包封在脂质体中或与其他磷脂或胶束混合以增加分子的稳定性。fviii变体可以单独施用或与已知的调节止血的其他药剂(例如vfw、因子ix、因子ixa等)组合施用。其中递送所述fviii变体的合适组合物可以由医师在考虑各种生理变量时确定，包括但不限于患者的情况和血液动力学状态。适合于不同应用和施用途径的各种组合物是本领域熟知的并在下文中描述。
[0058]
含有fviii变体的制剂可以含有生理学上可接受的基质，并且被配制成药物制剂。可以使用基本上已知方法来配制所述制剂，它可以与含有盐(例如nacl、cacl2)和氨基酸(例如甘氨酸和/或赖氨酸)以及ph范围为6至8的缓冲液混合。在需要之前，含有fviii变体的纯化制剂可以以成品溶液的形式或以冻干或深度冷冻的形式储存。在一个具体实施方案中，所述制剂以冻干形式储存，并使用适当的重构溶液溶解在视觉上澄清的溶液中。或者，本发明的制剂也可以作为液体制剂或作为深度冷冻的液体获得。根据本发明的制剂可以是特别稳定的，即，可以在应用前使其以溶解形式静置很长的时间。
[0059]
本发明的制剂可以作为具有fviii变体的药物制剂以单组分制剂的形式或与其它因子组合以多组分制剂的形式获得。
[0060]
在将纯化的蛋白质加工成药物制剂之前，可以将纯化的蛋白质进行常规质量控制并制成治疗形式。具体地，在重组制备期间，可以测试纯化过的制剂中是否存在细胞核酸以
及衍生自表达载体的核酸。
[0061]
本发明的另一个特征涉及制备一种制剂，所述制剂含有高稳定性和结构完整性的fviii变体，并且，具体地，不含无活性的fviii中间体和/或蛋白水解降解产物，并且通过将其配制成合适的制剂。
[0062]
作为实例，所述药物制剂可含有约1-1000μg/kg、约10-500μg/kg、约10-250μg/kg或约10-100μg/kg的剂量。在一个具体的实施方案中，所述药物蛋白制剂可以包含30-100iu/kg的剂量(例如，每日一次注射或每日最多3次或更多次)。患者可以在因出血在诊所就诊时立即接受治疗或在切割/伤口造成出血之前接受治疗。或者，患者可以每隔一至三、八或十二小时接受推注注入，或者如果观察到足够的改善，则每天一次注入本文所述的fviii变体。
[0063]
根据本发明，编码fviii变体的核酸可用于多种目的。在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于调节凝血的核酸递送媒介物(例如表达载体，如病毒载体)，其中所述表达载体包含编码如本文所述的fviii变体的核酸序列。向患者施用编码fviii变体的表达载体导致用于改变凝血级联的fviii变体的表达。根据本发明，编码fviii变体的核酸序列可以编码如本文所述的变体多肽，所述变体多肽的表达增加止血作用。在一个具体实施方案中，所述核酸序列编码人类fviii变体。
[0064]
包含fviii变体核酸序列的表达载体可以单独施用，或与用于调节止血的其他分子组合施用。根据本发明，表达载体或治疗剂组合可以单独或在药学上可接受的或生物学相容的组合物中施用于患者。
[0065]
在本发明的一个具体实施方案中，包含编码fviii变体的核酸序列的表达载体是病毒载体。可用于本发明的病毒载体包括但不限于：腺病毒载体(有或没有组织特异性启动子/增强子)、任何血清型的腺相关病毒(aav)载体(例如，aav-1至aav-12，特别是aav-2、aav-5、aav-7和aav-8)和杂交aav载体、慢病毒载体和假型慢病毒载体(例如埃博拉病毒、水泡性口炎病毒(vsv)和猫科免疫缺陷病毒(fiv))、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体以及逆转录病毒载体。在一个特定的实施方案中，所述载体是腺相关病毒(aav)载体。在一个特定的实施方案中，所述载体是慢病毒载体。
[0066]
在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于施用病毒载体的方法，所述病毒载体包含编码fviii变体的核酸序列。在本发明的方法中可用的腺病毒载体优选包括至少腺病毒载体dna的必需部分。如本文所述，施用这种腺病毒载体后fviii变体的表达用于调节止血，特别是增强蛋白酶的促凝活性。
[0067]
已发现重组腺病毒载体可广泛用于多种基因疗法应用。它们在此类应用中的用途很大程度上是由于在各种器官环境中实现的体内基因转移的高效性。
[0068]
腺病毒颗粒可有利地用作适当基因递送的媒介物。此类病毒体具有用于此类应用的许多期望特征，包括：与作为双链dna非包膜病毒有关的结构特征以及生物学特征，例如对人呼吸系统和胃肠道的向性。此外，已知腺病毒通过受体介导的内吞作用在体内和体外感染多种细胞类型。证明了腺病毒载体的整体安全性，腺病毒感染导致人类出现轻微的疾病状态，包括轻度流感样症状。
[0069]
由于腺病毒基因组尺寸很大(约36千碱基)，因此非常适合用作基因疗法媒介物，因为它们可以在去除复制所必需的腺病毒基因和非必需区域后容纳外源dna的插入。这样
的取代使得病毒载体在复制功能和感染性方面受损。值得注意的是，腺病毒已被用作用于基因疗法和表达异源基因的载体。
[0070]
期望引入一种载体，其可以提供例如所需基因的多个拷贝，并因此提供更大量的该基因的产物。改进的腺病毒载体和生产这些载体的方法已详细描述于许多参考文献、专利和专利申请中，包括：wright(hum gen ther.(2009)20:698-706)；mitani和kubo(curr gene ther.(2002)2(2):135-44)；olmsted-davis等人(hum gene ther.(2002)13(11):1337-47)；reynolds等人(nat biotechnol.(2001)19(9):838-42)；美国专利申请号5,998,205、6,228,646、6,093,699和6,100,242；wo 94/17810；和wo 94/23744。
[0071]
对于某些应用，表达构建体可进一步包含调节元件，其用于驱动特定细胞或组织类型中的表达。这样的调节元件是本领域技术人员已知的。在本发明的表达构建体中掺入组织特异性调节元件提供了至少部分的组织向性以用于所述变体或其功能片段的表达。例如，在巨细胞病毒(cmv)启动子控制下的包含编码变体的核酸序列的e1缺失的5型腺病毒载体可用于本发明的方法中。也可以使用造血或肝脏特异性启动子。
[0072]
在人类胚胎肾细胞系293中已经产生了用于重组基因表达的aav(wright,hum gene ther(2009)20:698-706；graham等人(1977)j.gen.virol.36:59-72)。简而言之，aav载体通常是从野生型aav(一种非致病性的单链dna病毒)改造而成的。所述亲本病毒是非致病性的，所述载体具有广泛的宿主范围，并且可以感染分裂细胞和非分裂细胞两者。通常通过缺失rep和cap基因并在特定启动子的控制下用目的转基因替换它们来从病毒改造载体。对于重组aav制剂，可以在两个itr之间插入的序列的大小上限约为4.7kb。在cmv启动子/增强子的控制下表达fviii变体的质粒和提供腺病毒辅助功能的第二质粒以及含有aav-2rep和cap基因的第三质粒可用于制备aav-2载体，而含有aav-1、aav-6或aav-8cap基因、aav-2rep基因和itr的质粒可用于制备各自的替代血清型载体(例如gao等人(2002)proc.natl.acad.sci.usa 99:11854-11859；xiao等人,(1999)j.virol.73:3994-4003；arruda等人,(2004)blood 103:85-92)。可以通过重复的cscl密度梯度离心来纯化aav载体，并且通过定量的斑点杂交来确定纯化的载体的滴度。在一个特定的实施方案中，载体可以由费城儿童医院的vector core制备。
[0073]
本发明还包括调节止血的方法，所述方法包括向个体的细胞提供编码fviii变体的核酸递送媒介物并允许细胞在表达fviii变体的条件下生长。
[0074]
从前面的讨论可以看出fviii变体和表达fviii变体的核酸载体可用于与异常凝血相关的病症的治疗。
[0075]
可将本发明的表达载体掺入可递送至受试者的药物组合物中，从而允许产生生物活性蛋白(例如fviii变体)或通过基于基因和/或细胞的疗法在体内诱导fviii变体的表达或通过对患者或供体细胞的离体修饰/转导来进行表达。在本发明的一个具体实施方案中，包含足够的遗传物质以使受体产生治疗有效量的fviii变体的药物组合物可以影响受试者的止血。或者，如上所述，可以将有效量的fviii变体直接注入到有需要的患者体内。所述组合物可以单独施用或与至少一种其他剂(如稳定化合物)联合施用，所述其他剂可以在任意无菌的、生物相容的药物载体中施用，包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。所述组合物可以单独对患者施用，或与影响止血的其他剂(例如辅因子)联合施用。
[0076]
在特定的实施方案中，本发明的组合物(例如药物组合物)还含有药学上可接受的
载体。这些载体包括任意药剂，所述药剂本身不诱导对接受所述组合物的个体有害的免疫应答，并且可以被施用而无不适当的毒性。药学上可接受的载体包括但不限于液体，例如水、盐水、甘油、糖和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，在这种载体中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。remington'spharmaceutical sciences(mack pub.co.,第18版,easton,pa.[1990])中提供了对药学上可接受的赋形剂的详尽讨论
[0077]
适用于肠胃外施用的药物制剂可以在水溶液中配制，优选地，在生理上相容的缓冲液中，例如hank溶液、ringer溶液或生理缓冲盐水。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)、或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)、或脂质体。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以制备高浓度溶液。
[0078]
所述药物组合物可以盐的形式提供，并且所述盐可以是与许多酸形成的，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。与相应的游离碱形式相比，盐倾向于更易溶于水或其他质子溶剂中。在其他情况下，所述制剂可以是冻干粉末，其可以含有以下任意或所有：1-50mm组氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，ph范围为4.5-5.5，在使用前与缓冲液结合使用。
[0079]
药物组合物制备后，可将它们置于合适的容器中并标记用于治疗。对于fviii变体或编码fviii变体的载体的施用，这种标记可以包括施用量、施用频率和施用方法。
[0080]
适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以达到预期治疗目的的组合物。使用本发明提供的技术和指导，确定治疗有效剂量完全在熟练医师的能力范围内。治疗剂量将取决于受试者的年龄和总体状况、异常凝血表型的严重程度、以及调节变体多肽表达水平的控制序列的强度，等等。因此，人类中的治疗有效量将落入相对宽的范围，该范围可由医师基于个体患者对基于载体的变体治疗的响应来确定。
[0081]
单独或与其他药剂组合的fviii变体可以如上所述在合适的生物/药物载体中直接注入到患者体内。包含编码变体或其功能片段的核酸序列的本发明的表达载体可以通过多种方式(见下文)施用于患者，以实现和维持变体多肽的预防和/或治疗上的有效水平。本领域技术人员可以容易地确定使用本发明的编码变体的表达载体用于特定患者的治疗性处理的特定方案。用于产生腺病毒载体以及向患者施用的方案描述于：美国专利号5,998,205；6,228,646；6,093,699；和6,100,242；wo 94/17810和wo 94/23744，以上文献通过引用的方式整体并入本文。
[0082]
本发明的fviii变体和/或fviii变体编码核酸(例如，腺病毒载体)可以通过任何已知方式施用于患者。所述药物组合物在体内的直接递送通常可以通过使用常规注射器注射来完成，但是可以设想其他递送方法，例如对流增强递送(参见，例如，美国专利号5,720,720)。在这方面，所述组合物可经皮下、表皮、皮内、鞘内、眶内、粘膜内、腹腔内、静脉内、动脉内、口腔内、肝内或肌肉内递送。其他施用方式包括口服和肺部施用、栓剂和经皮应用。专门治疗凝血障碍患者的临床医生可以基于许多标准确定包含变体核酸序列的腺病毒载体的施用的最佳途径，所述标准包括但不限于：患者的状况和治疗的目的(例如，增强或减少
血液凝固)。
[0083]
本发明还包括包含编码fviii变体的核酸序列的aav载体。还提供了包含编码fviii变体的核酸序列的慢病毒或假型慢病毒载体。还包括包含编码fviii变体的核酸序列的裸质粒或表达载体。
[0084]
提供以下实施例以说明本发明的各种实施方案。该实施例是说明性的，而不意图以任何方式限制本发明。
[0085]
实施例
[0086]
材料和方法
[0087]
试剂
[0088]
抑制剂苯甲脒和4-脒基苯基甲磺酰氟盐酸盐(apmsf)购自sigma aldrich(st.louis,mo)。细胞培养试剂购自invitrogen(waltham,ma)，但胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠购自roche(basel,瑞士)。如所述的(pittman,等人(1993)blood81(11):2925-2935)，合成磷脂囊泡(pcps)由75％鸡蛋l-α-磷脂酰胆碱(pc)和25％猪脑l-α-磷脂酰丝氨酸(ps)(avanti polar lipids；alabaster,al)制备并量化。triniclot试剂(tcoag)用于测量自动活化部分促凝血酶原激酶时间(aptt)。在水中制备肽基底物xa(sekisui diagnostics；burlington,ma)，并使用e
342
＝8279m-1
cm-1
验证浓度(lottenberg,等人(1983)biochim.biophys.acta.,742(3):558-564)。荧光底物0.5mm z-gly-gly-arg-amc购自bachem bioscience inc.(bubendorf,瑞士)，用15mm cacl2制备，使用e
326
＝17,200m-1
cm-1
测定浓度(bunce,等人(2011)blood 117(1):290-298)。混合的贫血小板的正常人类血浆和缺乏fviii的血浆购自george king biomedical(overland park,ks)。除非另有说明，所有测定均在25℃在测定缓冲液(20mm hepes[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸]，150mm nacl，5mm cacl2，0.1％聚乙二醇-8000，ph7.4)中进行，并且所有列出的试剂或蛋白质浓度均为实验条件下的最终浓度。
[0089]
蛋白质
[0090]
如所述(baugh,等人(1996)j.biol.chem.,271:16126-16134；buddai,等人(2002)j.biol.chem.,277(29):26689-26698)，纯化和制备血浆衍生的fx、fxa和凝血酶。因子ixa和apc购自haemtech(essexjunction，vt)。水蛭素购自calbiochem(sandiego，ca)。在每次实验前立即分别使用以下分子量(mr)和消光系数(e)
0.1％
测定蛋白质浓度：凝血酶(37,500和1.94)、fixa(45,000和1.40)、fx(59,000和1.16)、fxa(46,000和1.16)、apc(45,000和1.45)和ps(69,000和0.95)(lundblad,等人(1976)thrombin 1976:156-176；di scipio,等人(1977)biochemistry 16(4):698-706；fujikawa,等人(1974)biochemistry13(22):4508-4516)。
[0091]
重组fviii蛋白的产生
[0092]
开发和纯化了稳定表达野生型b结构域缺失的fviii(fviii-wt)的婴儿仓鼠肾(bhk)细胞系(pittman,等人(1993)blood 81(11):2925-2935；sabatino,等人(2009)blood 114(20):4562-4565)。采用fviii-wt cdna(genescript；piscataway,nj)的定点诱变在fviii apc切割位点arg336和arg562处引入arg-gln突变(图1b)。使用离子交换色谱法从24升条件培养基中纯化因子viii蛋白(每种约3mg)(sabatino,等人(2009)blood 114(20):4562-4565)。基于1.60的e
0.1％
和分子量(mr)＝165,000，通过280nm处的吸光度确定重组
fviii浓度(curtis, 等人 (1994)j.bio.chem.,269(8):6246-6251)。作为对照，以类似的方式生成了重组fviii-r372q。
[0093]
血浆测定
[0094]
fviii比活性通过基于aptt的1步凝血测定法(aptt-based-1-stage clotting assay)确定(siner,等人(2016)jci insight.,1(16):e89371)。如(bunce,等人(2011)blood 117(1):290-298)所述并进行了修改，测定贫血小板血浆中的凝血酶生成。用1nm fviii或0.2nm fviiia和4μm pcps重构因子viii缺乏的血浆。为了生成fviiia，将fviii(1.5nm)与凝血酶(30nm)一起温育30秒并用水蛭素(60nm)淬灭。在fviii重构血浆中，分别在人类和鼠血浆中使用1pm或30pm fxia启动凝血酶生成。在fviiia重构血浆中，分别在人类和小鼠血浆中使用10pm或400pm fxia启动凝血酶生成。选择这些测定中的fviiia和fxia浓度以生成相对于在类似ha血浆中使用fviii的实验相似的峰值凝血酶和延迟时间(表1)。用0.5mm cacl2中的0.5mm z-gly-gly-arg-amc(bachem bioscience inc.)引发反应。在37℃或33℃下，用m2(molecular devices；sanjose,ca)在360nm激发和460nm发射波长下分别在90分钟内测量人类和小鼠血浆的荧光。使用凝血酶校准器(凝血酶生成测定校准器套件)将原始荧光值与凝血酶校准曲线进行比较，以将数据转换为nm凝血酶和凝血酶生成曲线(nm/时间)并进行分析以确定峰值凝血酶生成和延迟时间。使用apc是因为人类可溶性凝血酶调节蛋白(stm)不与小鼠apc发生交叉反应。
[0095][0096]
表1：用fviii和fviiia重构的血浆中的峰值凝血酶和延迟时间值。显示了平均值
和平均值的标准误差。峰值凝血酶，生成的凝血酶的最大浓度；延迟时间，至峰值凝血酶生成的时间；ha，血友病a；ha/fvl，纯合血友病a，因子v leiden。
[0097]
通过蛋白质印迹分析对fviii进行蛋白水解切割
[0098]
因子viii(1.5μm)与凝血酶(10nm)一起温育20分钟以产生fviiia，然后用水蛭素(20nm)淬灭。为了评估apc切割，将fviii(10nm)与apc(6nm)、水蛭素(6nm)和pcps(20μm)一起温育30分钟。将水蛭素添加到纯化的系统分析中以消除来自市售apc中的可能的痕量凝血酶污染。通过蛋白质印迹分析分析样品。通过识别fviiia2结构域的一抗(fay,等人(1991)j.biol.chem.,266(14):8957-8962)(gma-012,green mountain antibodies；burlington,vt)和dylight
tm 800第二检测抗体(rockland；pottstown,pa)来检测fviii和fviii切割产物。
[0099]
因子viii酶动力学研究和a2稳定性的测量
[0100]
fxa生成的动力学分析通过内在xase测定进行，如(lollar,等人(1989)biochemistry 28(2):666-674)所述并进行了修改。通过将25nm fviii与100nm凝血酶温育30秒产生活化的fviii(fviiia)，然后用水蛭素(150nm)淬灭。在20μmpcps存在下，因子viiia(0.25nm)立即与fixa(20nm)和可变fx浓度(0-500nm)结合。在不同的时间间隔(0.25-2分钟)，反应混合物的等分试样在20mm hepes、150mm nacl、25mm edta、0.1％聚乙二醇-8000、ph7.4中淬灭。使用xa通过在190酶标仪(molecular devices)中测量405nm处的吸光度并将结果与制备的fxa标准曲线进行比较来评估每个淬火样品中的fxa量。残留的fviii活性在apc或apc和ps存在的情况下如所述进行温育，但是将fviii蛋白在凝血酶活化之前，在20μm pcps和6nm水蛭素存在下，与6nm apc(haemtech)或6nm apc和100nm ps一起温育0-60分钟。如所述进行fviiia-a2解离的评估，但是不同浓度的fviii(5-100nm)用100nm凝血酶激活并在指定时间取出等分试样并立即在内在xase测定中测定残留的fviiia功能(lollar,等人(1989)biochemistry 28(2):666-674)。
[0101]
动物
[0102]
将ha-c57bl/6小鼠用于体内研究(bi,等人(1995)nat.genet.,10(1):119-121)。将纯合ha-c57bl/6小鼠与纯合fv leiden(fvl)-c57bl/6小鼠培育产生纯合ha/fvl-c57bl/6小鼠(schlachterman,等人(2005)j.thromb.haemost.,3(12):2730-2737；cui,等人(2000)blood 96(13):4222-4226)。因子vleiden(fv
r506q
)(fvl)被切割的速度比fv慢约10倍，因此具有apc抗性。野生型c57bl/6小鼠购自jackson labs。8-12周的雄性和雌性被用于实验。动物研究得到费城儿童医院动物护理和使用委员会的批准。
[0103]
尾夹测定
[0104]
用异氟醚麻醉小鼠，将尾巴预热至37℃。在以3mm直径横断尾部前3分钟将因子viii蛋白和/或mab1609(200μl，剂量为10μg/ml)通过眶后注射进行注射(xu,等人(2009)j.thromb.haemost.,7(5):851-856)。将尾巴放入锥形管中，收集血液2分钟，然后再放入生理盐水中10分钟。将10分钟的样品溶血并在575nm处测量吸光度以确定存在的总血红蛋白(sambrano,等人(2001)nature413(6851):74-78)。通过使用已知量的溶血的鼠全血的已建立的标准曲线转换样品血红蛋白含量来确定总失血量(μl)(ivanciu,等人(2011)nat.biotechnol.,29(11):1028-1033)。
[0105]
fecl3损伤模型
[0106]
如(schlachterman,等人(2005)j.thromb.haemost.,3(12):2730-2737)所述，在ha-c57bl/6小鼠中进行氯化铁(fecl3)损伤。简而言之，暴露颈动脉并通过放置在动脉下方的多普勒探头(型号0.5vb；transonic systems；ithaca，ny)测量流量。颈静脉fviii蛋白输注后约3分钟，通过将浸泡在7.5％fecl3中的2mm2滤纸放在动脉外膜表面2分钟来进行颈动脉血管损伤。之后除去滤纸，用生理盐水清洗该区域，并通过多普勒流连续监测血流长达30分钟。至颈动脉血管闭塞的时间被定义为没有可测量的血流，并在实验结果中报告。
[0107]
使用可溶性凝血酶调节蛋白滴定法进行凝血酶生成测定
[0108]
用1nm fviii-wt或fviii-qq、4μm pcps和增加量的可溶性凝血酶调节蛋白(stm)重构缺乏fviii的人血浆。如(bradford,等人(2012)j.biol.chem.,287(36):30414-30425；parkinson,等人(1990)j.biol.chem.,265(21):12602-12610)所述，重组生产和纯化人类stm。用0.1pm fxia触发凝血酶生成。用0.5mm z-gly-gly-arg-amc(bachem bioscience inc.)和7.5mm cacl2(最终浓度)引发反应。在37℃下，使用m2(moleculardevices)以360nm激发和460nm发射波长测量b荧光超过90分钟。使用凝血酶校准器(凝血酶生成测定校准套件)将原始荧光值与凝血酶校准曲线进行比较，以将数据转换为nm凝血酶和凝血酶生成曲线(nm/时间)并进行分析以确定峰值凝血酶生成和延迟时间。
[0109]
fviii半衰期研究
[0110]
通过尾静脉注射向ha-c57bl/6小鼠注射125iu/kg的fviii-wt或fviii-qq以确定fviii半衰期。在将蛋白质注射到3.8％柠檬酸钠中后5分钟、1小时、4小时、8小时、24小时、48小时收集血浆样品并快速冷冻以供以后分析。使用将温育时间缩短至4分钟的改进方案(rosen,等人(1985)thromb.haemost.,54(4):818-823)，使用fviii试剂盒(diapharma，louisville，ky)测定因子viii残留活性。通过使用prism软件将残留fviii活性拟合到指数衰减曲线来确定半衰期(dumont,等人(2012)blood 119(13):3024-3030)(图5e)。
[0111]
数据分析
[0112]
在graphpad prism 8软件中进行分析。具体的统计分析方法在图例中进行了概述。通过对michaelis-menten方程的非加权非线性最小二乘拟合计算内在fxase激活fx的稳态动力学参数km和v
max
。结果表示为平均值
±
标准误差。使用dunn的多重比较检验，通过秩上单向anova(kruskal-wallis，非参数拟合)分析小鼠损伤研究。
[0113]
结果
[0114]
fviii-wt和fviii-qq促凝血活性的表征
[0115]
为确保引入2个突变不会改变fviii促凝血功能，在不同的测定系统中将fviii-qq与fviii-wt进行了比较。fviii-wt和fviii-qq以其单链(mr＝165,000)和异二聚体形式(重链，mr＝90,000和轻链，mr＝80,000)从条件培养基中纯化。凝血酶切割两种蛋白质以产生代表在r1689(a3-c1-c2；mr＝70,000)和r740/r372(a1，mr＝50,000和a2，mr＝43,000)处切割的片段，对应于fviiia(图2a)。
[0116]
fviii-wt(9000
±
700iu/mg)和fviii-qq(11000
±
900iu/mg)的比活性与市售的无b结构域的fviii产品相似且一致(表2)(www.fda.gov/media/70399/download2014)。此外，
apc的情况下，因子viii-qq重构的ha血浆失去了大约30％的活性，而fviii-wt重构的ha血浆失去了80％的活性(图4a)。用增加的stm浓度代替apc观察到可比较的结果(图4e)。在该测定系统中，fviiia和fv/fva被apc失活，这可能解释了为什么使用fviii-qq会减少凝血酶的生成。尽管如此，与fviii-wt相比，用fviii-qq重构的血浆对apc具有抗性。使用fviiia进行了类似的凝血酶生成研究。在这里，fviii-qq和fviii-wt被凝血酶迅速激活，然后添加到人ha血浆中。正如使用前辅因子所观察到的，fviiia-qq在测试的apc浓度范围内显示出比fviiia-wt更大的凝血酶生成(图4b)。由于在启动凝血酶生成之前将fviiia添加到系统中，因此a2解离可能在该实验系统中的fviiia调节中起主要作用。然而，即使在a2解离条件增强的情况下，仍观察到fviiia-wt和fviiia-qq之间的apc敏感性差异。使用用fviii(图4c)或fviiia(图4d)重构的ha鼠血浆观察到类似的结果。在存在apc的情况下，fviii/fviiia-wt的凝血酶生成相对于fviii/fviiia-qq更显著减少，这支持了apc在这种基于ha血浆的系统中在fviiia失活中的作用。
[0124]
抗apc的fviii改善ha小鼠损伤模型的止血效果
[0125]
对ha小鼠进行尾夹和fecl3测定，以评估fviii-wt与fviii-qq在体内的相对作用。尾夹测定显示fviii-qq和fviii-wt的失血量呈剂量依赖性减少(图5a)。使失血量正常化的fviii-qq剂量(2.5μg/kg)低于使失血量正常化的fviii-wt剂量(10μg/kg)，这与apc在fviiia调节中的体内贡献一致。为了确保观察结果是apc特异性的，在存在抑制小鼠apc抗凝功能的抗体mab1609的情况下重复尾夹测定(图5a)(xu,等人(2009)j.thromb.haemostasis7(5):851-856)。在ha小鼠中输注mab1609本身并没有赋予止血效果，并且失血量与pbs对照相似。然而，在ha小鼠中施用mab1609和2.5μg/kg的fviii-wt(使失血正常化的fviii-qq剂量)可减少失血，这与止血正常对照一致。与fviii-wt不同，无论有无mab1609，fviii-qq失血量相同。这些结果表明，fviii-qq在体内的卓越止血效率其对apc切割的抗性是特异性的。
[0126]
根据恢复研究(图5e)，使失血正常化所需的fviii-wt剂量接近正常的67％的血浆fviii活性，并且与出版物(nguyen,等人(2017)j.thromb.haemost.,15(1):110-121；siner,等人(2013)blood 121(21):4396-4403)一致。定量地，fviii-qq的ec
50
比fviii-wt低6-7倍(分别为1.1μg/kg和7.4μg/kg)，而ec
80
比fviii-wt低8-9倍(分别为2.2μg/kg和18.6μg/kg)(图5b，表3)。与尾夹测定类似，在fecl3测定中使形成血管闭塞的时间正常化的fviii-qq的剂量(2μg/kg)低于fviii-wt的剂量(10μg/kg)。在fecl3测定中，fviii-qq的ec
50
比fviii-wt低3倍(分别为1.2μg/kg和3.4μg/kg)，而fviii-qq的ec
80
比fviii-wt低8倍(分别为1.5μg/kg和12.1μg/kg)(图5d，表3)。fviii-wt和fviii-qq的半衰期和恢复在ha小鼠中相似(图5e)。这些数据表明，在大血管损伤模型中，apc在fviiia的体内调节中具有关键作用，因此对apc切割的抗性赋予止血益处。
[0127][0128][0129]
表3：fviii-qq相对于fviii-wt的体内止血功能。ec
50/80
，用于50％或80％的正常失血或正常血管闭塞时间所需的fviii剂量；fecl3，7.5％三氯化铁损伤模型。
[0130]
在ha/fvl小鼠血浆和损伤模型中apc对fviii/fviiia功能的影响
[0131]
为了进一步分离apc切割对fviiia失活的贡献，生成了纯合ha/fvl小鼠。对ha/fvl小鼠的研究发现，fvl可以适度改善微血管出血，但在大血管损伤模型中没有明显的效果(schlachterman,等人(2005)j.thromb.haemost.,3(12):2730-2737)。首先，在不同浓度的apc存在下，在用fviii-wt或fviii-qq重构的小鼠ha/fvl血浆中重复凝血酶生成测定。正如预期的那样，与ha/fvl血浆相比，ha血浆中fviii-wt和fviii-qq的失活明显不同(比较图4c与图6a)。然而，在ha/fvl血浆中，对于所有apc浓度，fviii-qq的残留峰值凝血酶值仍然高于fviii-wt(图6a)。当用fviiia-wt与fviiia-qq重构血浆时，获得了类似的结果(图6b)。接下来，在ha/fvl小鼠中重复尾夹测定，比较fviii-qq相对于fviii-wt的止血效果。虽然在ha/fvl小鼠中施用fviii-wt(2μg/kg)对失血有适度影响，但fviii-qq(2μg/kg)使失血正常化至止血正常对照(图7)。使用fv失活严重减弱的系统，这些数据表明apc对fviiia的失活肯定在调节体内凝块形成中起重要作用。
[0132]
为了进一步证明这一点，在存在抑制小鼠apc抗凝功能的抗体mab1609的情况下，重复使用ha/fvl小鼠的尾夹测定(xu,等人(2009)j.thromb.haemost.,7(5):851-856)。正如预期的那样，在ha/fvl小鼠中输注mab1609本身并没有产生止血作用，并且失血量与pbs对照相似(图7)。使用fv对apc失活具有抗性的系统，这些数据表明apc对fviiia的失活肯定在调节体内凝块形成中起重要作用。与在ha小鼠中观察到的一样，将pbs和mab1609输注到ha/fvl小鼠中导致与ha/fvlpbs对照相似的失血(图6)。与在ha小鼠中的观察结果类似，在ha/fvl小鼠中施用mab1609和fviii-qq(2.5μg/kg)并没有明显改变失血量，而施用fviii-wt(2.5μg/kg)可将失血量减少至止血正常对照中的水平。因此，消除apc抗凝功能(mab1609)或去除apc促凝底物(fv-leiden和fviii-qq)有效地产生了类似的促止血作用。这些结果表明，fviii-qq在体内的卓越止血效率其对apc切割的抗性是特异性的。
[0133]
最后，在apc浓度增加的ha/fvl血浆凝血酶生成试验中评估了fviii的单个突变体。如图8a所示，与wt相比，fviii-r336q和fviii-r562q保留了优越的活性。还在ha/fvl小鼠的止血损伤模型中测试了单个突变体。如图8b所示，fviii-r336q和fviii-r562q优于wtfviii。
[0134]
本文呈现的fviii-qq研究表明apc在体内fviiia调节中具有意想不到的重要作用。相对于fviii-wt，fviii-qq在不改变促凝功能或a2结构域稳定性的情况下证明了apc抗性。同时，在大血管损伤模型中，fviii-qq相对于fviii-wt对apc切割的抗性赋予ha小鼠的止血功能改善。fviii-qq优于fviii-wt的优势被apc抑制性抗体消除，这证实了fviii-qq增强的止血功效是apc特异性的。这些数据证明了apc切割在fviiia失活中的体内意义。
[0135]
有两种已知的fviiia失活机制。生化研究表明，自发的a2结构域解离是fviiia失活的主要原因，并且根据失活率，apc的贡献相对并不显著(lollar,等人(1991)j.biol.chem.,266(19):12481-12486；fay,等人(1991)j.biol.chem.,266(14):8957-8962；lollar,等人(1992)j.biol.chem.,267(33):23652-23657)。事实上，数据显示了快速、自发的a2结构域解离和相对缓慢的apc介导的切割，由此产生的fviiia失活分别在数分钟和数小时内发生(lollar,等人(1991)j.biol.chem.,266(19):12481-12486；lollar,等人(1992)j.biol.chem.,267(33):23652-23657；fay,等人(1991)j.biol.chem.,266(30):20139-20145)。因此，在fviiia调节的生化数据背景下，fviii/fviiia-wt对血浆中apc浓度增加的敏感性和fviii-qq在小鼠损伤模型中增强的止血作用是令人惊讶的。虽然数据不排除a2结构域解离作为fviiia调节的重要机制，但它们表明-与体外速率常数预测完全相反-a2解离不是体内fviiia调节的唯一相关机制。
[0136]
值得注意的是，改变a2结构域解离动力学的内在xase复合物中的相互作用难以同时建模，并且可能导致确定的体外fviiia失活率与观察到的体内止血效果之间的不一致。这强调了将体外分析与体内研究相结合以确定特定调节机制的影响的重要性。例如，fviiia异源三聚体中a2结构域的结合亲和力比血浆fviii浓度高近300倍，这表明当fviiia游离时，体内会发生快速a2结构域解离(lollar,等人(1992)j.biol.chem.,267(33):23652-23657；parker,等人(2006)j.biol.chem.,281(20):13922-13930)。然而，损伤部位的fviiia浓度是未知的，也不清楚它有多少与多种配体结合而不是实际游离。重要的是，众所周知，fixa可以稳定内在xase复合物中fviiia异源三聚体中的a2结构域(fay,等人(1996)j.biol.chem.,271(11):6027-6032；lollar,等人(1984)blood 63(6):1303-1308)。此外，apc切割改变了a2结构域的方向，从而降低了fviiia对fixa和fx两者的亲和力(regan,等人(1996)j.biol.chem.,271(8):3982-3987；rosenblum,等人(2002)j.biol.chem.,277(14):11664-11669)。因此，尚不清楚是否a2结构域在损伤部位的内在xase酶复合物中组装时在fviiia异源三聚体内达到平衡。此外，据报道，蛋白质s(ps)和fv两者(在fxa生成的直接测量中均不存在)是apc介导的fviiia切割的协同辅助因子(dahlback,等人(1994)proc.natl.acad.sci.,91:1396-1400；shen,等人(1994)j.biol.chem.,269:18735-18738；fay,等人(1991)j.biol.chem.,266(30):20139-20145；lu,等人(1996)blood87(11):4708-4717)。目前在用fviiia重构的ha或ha/fvl血浆中和体内损伤模型中的研究允许在ps和fv存在下分析fviiia功能以及fviiia调节的并发机制(apc介导的蛋白水解和a2结构域解离)。通过这种综合评估，显示了体内apc调节fviiia的重要性。
[0137]
除apc外，fixa和fxa已证明能够分别切割fviiia残基336和562(eaton,等人(1986)biochemistry 25(2):505-512；lamphear,等人(1992)blood80(12):3120-3126；nogami,等人(2003)j.biol.chem.,278(3):1634-1641)。通过破坏fviii-qq突变体中的这
些切割位点，fixa和fxa介导的fviiia切割在调节内在xase复合物中的潜在作用也被消除(nogami,等人(2003)j.biol.chem.,278(3):1634-1641；regan,等人(1996)j.biol.chem.,271(8):3982-3987)。
[0138]
使用功能获得性fviii转基因进行ha基因转移可以克服载体剂量依赖性安全性和有效性限制，降低载体制造需求并提高功效(george,l.a.(2017)hematology 2017(1):587-594)。这种方法已成功应用于血友病b基因治疗工作，因此所有目前正在招募的临床试验现在都使用高特异性fix变体fix-padua(george,等人(2017)new eng.j.med.,377(23):2215-2227；chowdary,等人(2020)res.pract.thromb.haemost.,4(suppl 1)；majowicz,等人(2020)haemophilia 26(s4):20；simioni,等人(2009)new eng.j.med.,361(17):1671-1675)。此外，第一个成功的ha基因治疗试验观察到fviii表达意外下降(rangarajan,等人(2017)new eng.j.med.,377(26):2519-2530；pasi,等人(2020)new eng.j.med.,382(1):29-40)。一种提出的病因是fviii表达诱导未折叠蛋白反应和内质网应激，这已在哺乳动物细胞培养和小鼠肝脏定向基因转移中得到证实，这导致表达丧失(malhotra,等人(2008)proc.natl.acad.sci.,105(47):18525-18530；lange,等人(2016)mol.ther.meth.clin.dev.,3:16064；poothong,等人(2020)blood 135(21):1899-1911；becker,等人(2004)thromb.haemost.,92(1):23-35；brown,等人(2011)j.biol.chem.,286(27):24451-24457)。这支持使用功能获得的fviii变体以在较低水平的转基因表达下赋予相似但持久的功效。在损伤模型中使失血和凝块形成正常化所需的fviii-qq剂量始终比fviii-wt低约5倍。fviii-qq相对于fviii-wt的止血功能增强高于先前描述的功能获得性fviii变体(pipe,等人(1997)proc.natl.acad.sci.,94:11851-11856；zakas,等人(2017)nat.biotech.,35(1):35-37；leong,等人(2015)blood 125(2):392-398；wakabayashi,等人(2008)blood 112(7):2761-2769)。总之，数据表明apc在fviiia的体内调节中具有关键作用，这被用于开发新型血友病疗法。
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虽然上面已经描述并具体例示了本发明的某些优选实施例，但是并不意味着本发明限于这些实施例。如所附权利要求书所述，在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以对其进行多种修改。