包含纺锤链杆菌属细菌菌株的组合物的制作方法

1.本发明属于包含细菌菌株的组合物以及这类组合物在疗法中的用途的领域。
2.发明背景
3.虽然认为人的肠道在子宫内是无菌的，但在出生后它立刻暴露于大量的母体和环境微生物。此后，出现微生物定殖和演替的动态时期，该时期受例如分娩方式、环境、饮食和宿主基因型等因素的影响，所有这些都会影响肠道微生物群的组成，尤其是在生命早期。随后，微生物群稳定并变成成人样[1]。人的肠道微生物群含有超过1,500个不同的种系型，这些种系型在丰度水平上主要是两大细菌分类(门)，拟杆菌门(bacteroidete)和厚壁门菌(firmicute)[2-3]。由人的肠道的细菌定殖产生的成功共生关系产生了多种代谢、结构、保护和其它有益功能。定殖肠道增强的代谢活性确保了原本难以消化的饮食组分得到降解，同时释放副产物，为宿主提供了重要的营养来源和额外的健康益处。同样，已经充分认识到肠道微生物群的免疫学重要性，并以无菌动物为例，这些动物的免疫系统受损，在引入共生细菌后功能重建[4-6]。
[0004]
在例如炎性肠病(ibd)等胃肠道病症中，微生物群组成发生了巨大的变化。举例来说，在ibd患者中，梭菌属(clostridium)xiva簇和梭菌属xi簇(普氏栖粪杆菌(f.prausnitzii))细菌的水平降低，而大肠杆菌的数量增加，这表明肠道内共生菌与致病共生菌的平衡发生了变化[7-11]。
[0005]
认识到某些细菌菌株可能对动物肠道产生的潜在积极影响，已经提出各种菌株用于治疗各种疾病(参见例如[12-15])。许多菌株，主要包括乳酸杆菌(lactobacillus)和双歧杆菌(bifidobacterium)菌株，已被提议用于治疗各种肠道病症(参见[16]的综述)。已建议使用热灭活的食糖纺锤链杆菌(fusicatenibacter saccharivorans)来减少溃疡性结肠炎[17]。wo2017/182796教导了从肠道中分离各种细菌物种，并推测使用这些细菌来治疗病原体感染，例如艰难梭菌(c.difficile)。us2019/0030098讨论了包含两种或更多种纯化细菌菌株的组合物在治疗例如艰难梭菌等病原体感染中的用途。wo2018/067887涉及诊断患有肝硬化的受试者肠道中的真菌菌群失调的方法，所述方法包括测定来自受试者的样品中的细菌分类群。它还推测可以用益生菌治疗菌群失调，但没有指示这种益生菌的组成。
[0006]
细菌在治疗多种疾病方面显示出巨大的前景，因此需要开发使用细菌的新疗法。


技术实现要素：

[0007]
本发明人开发了用于治疗和预防中枢神经系统疾病或病症、与肠道通透性增加有关的疾病、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病的新疗法。本发明人已经证明，包含来自纺锤链杆菌属(genus fusicatenibacter)的细菌菌株的组合物在治疗鼠自闭症模型中的刻板、社交行为和抑郁样行为方面特别有效。
[0008]
本发明提供了包含来自纺锤链杆菌属的细菌的组合物，其用于治疗或预防中枢神经系统疾病或病症、与肠道通透性增加有关的疾病、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病。本发明还提供了包含具有与seq id no:1、2、3或4具有至少98.65％序列相似性的16s rrna序
列的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防中枢神经系统疾病或病症、与肠道通透性增加有关的疾病、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病的方法中。中枢神经系统疾病或病症可以是神经退行性疾病、神经发育障碍或神经精神疾患。
[0009]
此外，本发明提供了治疗或预防中枢神经系统疾病或病症、与肠道通透性增加有关的疾病、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病的方法，所述方法包括施用包含纺锤链杆菌属细菌菌株的组合物。
[0010]
此外，本发明提供了包含纺锤链杆菌属细菌菌株的组合物用于制造供治疗或预防中枢神经系统疾病或病症、与肠道通透性增加有关的疾病、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病用的药物的用途。
[0011]
中枢神经系统疾病或病症可能由微生物群-肠-脑轴介导。在某些实施方案中，组合物用于调节微生物群-肠-脑轴的方法中。
[0012]
本发明还提供了包含纺锤链杆菌属细菌菌株的组合物、用途和方法，用于治疗或预防神经发育障碍或神经精神疾患的方法中。神经发育障碍或神经精神疾患可以选自由以下组成的组：自闭症谱系障碍(asd)；儿童发育障碍；强迫症(ocd)；重性抑郁障碍；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；精神分裂症谱系障碍；精神分裂症；双相障碍；精神病；心境障碍；慢性疼痛；格林-巴利综合征(guillain-barr
é
syndrome)和脑膜炎、包括路易体、血管性和额颞叶痴呆在内的痴呆；原发性进行性失语；轻度认知障碍；hiv相关的认知障碍和皮质基底节变性。
[0013]
在优选的实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防自闭症的组合物。
[0014]
本发明的组合物优选是经口组合物。本发明人已经表明，经口施用本发明的组合物可以有效治疗本文公开的疾患，特别是炎性中枢神经系统疾病和病症，特别是由微生物群-肠-脑轴介导的那些。此外，经口施用对患者和从业者来说是方便的，并且允许递送到肠道和/或部分或全部定殖于肠道。
[0015]
本发明的组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。在某些实施方案中，本发明的组合物已被冻干。本发明的组合物还可以包含冻干的纺锤链杆菌属细菌菌株。该细菌菌株可能已被冻干。冻干是一项制备允许递送细菌的稳定组合物的有效且方便的技术。在特别优选的实施方案中，细菌菌株是有活力的并且能够部分或全部定殖于肠道。
[0016]
本发明还提供了一种食品，其包括包含如上所述的纺锤链杆菌属细菌菌株的组合物。本发明还提供了一种疫苗组合物，其包含如上所述的纺锤链杆菌属细菌菌株。
[0017]
本发明人已经鉴定并表征了对疗法特别有用的食糖纺锤链杆菌细菌菌株。本发明的食糖纺锤链杆菌物种显示出可有效治疗本文所述的疾病，例如中枢神经系统疾病或病症。因此，在另一方面，本发明提供了以登记号ncimb 43527保藏的食糖纺锤链杆菌菌株或其衍生物的细胞。本发明还提供了包含这类细胞的组合物或这类细胞的生物学纯培养物。本发明还提供了以登记号ncimb 43527保藏的食糖纺锤链杆菌或其衍生物的细胞，用于疗法，特别是本文所述的疾病的疗法中。
附图说明
[0018]
图1显示了使用荧光测量的回肠(a)和结肠(b)的通透性。
11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株的相应序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。在一些实施方案中，生物型菌株具有与seq id no:1、2、3或4的16s rrna序列具有至少97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
[0040]
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有在食糖纺锤链杆菌的基因组的至少60％(例如至少65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)上与该基因组具有至少90％序列同一性(例如至少92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的基因组。
[0041]
或者，可以通过使用限制性片段分析和/或pcr分析，例如通过使用荧光扩增片段长度多态性(faflp)和重复dna元件(rep)-pcr指纹识别，或蛋白质谱分析，或部分16s或23s rdna测序来鉴定作为ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株的生物型且适用于本发明中的菌株。在优选的实施方案中，这类技术可用于鉴定其它食糖纺锤链杆菌菌株。
[0042]
在某些实施方案中，作为ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株的生物型并且适用于本发明中的菌株是在通过扩增核糖体dna限制性分析(ardra)分析时，例如在使用sau3ai限制性酶时，分别提供与ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株相同模式的菌株(示例性方法和指导参见例如[21])。或者，生物型菌株被鉴定为具有与ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株相同的碳水化合物发酵模式的菌株。
[0043]
可以使用任何适当的方法或策略，包括实施例中描述的测定法来鉴定可用于本发明的其它纺锤链杆菌属菌株或特别是食糖纺锤链杆菌菌株，例如ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株的生物型。例如，用于本发明的菌株可以通过培养细菌并在完成埋珠、社交行为和/或强迫游泳测试之前将它们施用于mia或btbr小鼠来鉴定。在另一个实例中，用于本发明的菌株可以通过培养细菌并评估它们的短链脂肪酸(scfa)产生概况来鉴定；可用于本发明的生物型可产生丁酸盐、戊酸盐和/或异戊酸盐。此外，可通过将它们施用于鼠模型并观察它们对肠道通透性的影响来鉴定用于本发明的菌株。具体地说，具有与ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株相似的生长模式、代谢类型和/或表面抗原的细菌菌株可用于本发明。如例如通过小鼠模型中的埋珠、社交行为和强迫游泳测试所评估，有用的菌株将具有与ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株相当的活性。具体地说，生物型菌株对肠道通透性和/或对scfa产生的影响与实施例中所示的影响相当，这可以通过使用实施例中描述的培养和施用方案来鉴定。例如，当使用具有充氧(95％o2、5％co2)的krebs缓冲液的维持在37℃下的尤斯室(ussing chamber)测量时，与对照相比，生物型菌株将能够将btbr或mia小鼠的肠道通透性降低至少约10％、至少约20％或至少约50％
±
10％。此外，或可替代地，当使用配备zb-ffap柱的varian 3500gc火焰离子化系统测量时，与对照相比，当施用于balb小鼠时，它可以使scfa产生增加至少约10％、至少约20％或至少约50％。
[0044]
使用16s同源性和maldi-tof分析鉴定为属于食糖纺锤链杆菌物种的菌株已在实施例中进行了测试，并显示出有效治疗疾病。该菌株是特别优选的并且已以登记号ncimb 43527保藏。因此，本发明提供了用于疗法中，特别是治疗本文所述的疾病的食糖纺锤链杆菌物种的细胞，例如分离的细胞。本发明还提供了用于疗法中，特别是治疗本文所述的疾病的食糖纺锤链杆菌物种，最优选以登记号ncimb 43527保藏的食糖纺锤链杆菌物种的细胞，例如分离的细胞。
[0045]
ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株的衍生物可以是子代菌株(后代)或从原始菌株培养(亚克隆)的菌株。本发明菌株的衍生物可以例如在基因水平上被修饰，而不消除生物活性。具体地说，本发明的衍生菌株具有治疗活性。衍生菌株将具有与ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株相当的微生物群调节活性。具体地说，衍生菌株对自闭症模型产生的影响与实施例中所示的影响相当，这可以通过使用实施例中描述的培养和施用方案来鉴定。
[0046]
细菌菌株也可以是具有与ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb 43527菌株相同的安全性和治疗功效特征的菌株。
[0047]
本发明还提供了用于疗法中，特别是治疗本文所述的疾病的以登记号ncimb 43527保藏的食糖纺锤链杆菌菌株的细胞。
[0048]
治疗用途
[0049]
本发明提供了用于治疗或预防中枢神经系统疾病或病症、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病的方法中的组合物。中枢神经系统疾病或病症可包括神经发育障碍、神经退行性疾病或神经精神疾患。在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防自闭症谱系障碍的方法中。
[0050]
优选地，本发明的组合物不用于治疗或预防传染病，例如微生物感染，如艰难梭菌(clostridium difficile)感染。优选地，待治疗的受试者不患有艰难梭菌感染或处于艰难梭菌感染的风险中。
[0051]
神经发育障碍或神经精神疾患可选自由以下组成的组：自闭症谱系障碍(asd)；儿童发育障碍；强迫症(ocd)；重性抑郁障碍；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；精神分裂症谱系障碍；精神分裂症；双相障碍；精神病；心境障碍；慢性疼痛；格林-巴利综合征和脑膜炎，包括路易体、血管性和额颞叶痴呆在内的痴呆；原发性进行性失语；轻度认知障碍；hiv相关的认知障碍；以及皮质基底节变性。
[0052]
神经退行性疾病可选自由以下组成的组：帕金森病(parkinson’s disease)，包括进行性核上性麻痹、进行性核上性麻痹、斯-里-奥三氏综合征(steele-richardson-olszewski syndrome)、正常压力脑积水、血管性或动脉硬化性帕金森综合征和药源性帕金森综合征；阿尔茨海默病(alzheimer’s disease)，包括本森综合征(benson's syndrome)；多发性硬化；亨廷顿病(huntington’s disease)；肌萎缩侧索硬化；卢伽雷病(lou gehrig's disease)；运动炎症性神经元疾病；朊病毒病；脊髓小脑性共济失调和脊髓性肌萎缩。
[0053]
本发明的组合物用于治疗或预防与肠道通透性相关的疾病的方法中，所述与肠道通透性相关的疾病例如胃溃疡、感染性腹泻、肠易激综合征、功能性胃肠道疾病、炎性肠病、乳糜泻和癌症(食道、结肠直肠)、食物过敏、急性炎症(败血症、全身炎症反应综合征(sirs)、多器官衰竭)、肥胖、代谢疾病(例如nafld和nash)。
[0054]
本发明的组合物用于治疗或预防代谢疾病，例如肥胖和糖尿病的方法中。本发明的组合物用于治疗或心血管疾病的方法中，所述心血管疾病例如动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉疾病、心绞痛和心肌梗塞、心律失常、心力衰竭、瓣膜性心脏病、心包疾病、中风、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、先天性心脏病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、血栓栓塞性疾病和静脉血栓形成。
[0055]
本发明的组合物可用于治疗或预防成年患者中的中枢神经系统疾病或病症、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病。在优选的实施方案中，患者可以是年龄在18至65岁之间，例如在40至65岁之间或超过40岁的成年人。成年患者可以是18岁、20岁、30岁、40岁、50岁、60岁、70岁或以上。成年患者的年龄可能在18至70岁、18至50岁或18至30岁之间。本发明的组合物可用于治疗与老年相关的疾病，例如在超过50岁的患者中诊断出的疾病。本发明的组合物可有效治疗中枢神经系统疾病或病症，例如发生在老年患者中的神经退行性疾病，例如，患者为65岁以上。
[0056]
本发明的组合物可用于治疗或预防儿童，例如青少年和婴儿中的中枢神经系统疾病或病症、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病。患者可以是1至17岁，例如1至2岁、2至5岁、5至7岁、5至9岁、7至11岁、超过5岁、超过7岁、超过10岁、超过15岁的儿童。建议对自闭症谱系障碍进行早期诊断和干预[22]，因此患者可能为9至24个月龄或18至24个月龄。
[0057]
调节微生物群-肠-脑轴
[0058]
肠道和大脑之间的交流(微生物群-肠-脑轴)通过双向神经体液交流系统发生。最近的证据表明，肠道中的微生物群可以通过微生物群-肠-脑轴调节大脑发育并产生行为表型。事实上，许多的评论表明微生物群-肠-脑轴在维持中枢神经系统功能中的作用，并暗示在中枢神经系统病症和疾患的发展中微生物群-肠-脑轴的功能障碍[10]、[13]、[14]、[23]。
[0059]
大脑和肠道之间的双向交流(即，-肠道-脑轴)包括中枢神经系统、神经内分泌和神经免疫系统(包括下丘脑-垂体-肾上腺(hpa)轴)、自主神经系统的交感和副交感臂(ans)(包括肠神经系统(ens)和迷走神经)以及肠道微生物群。
[0060]
如实施例中所证明，本发明的组合物可以调节微生物群-肠-脑轴并减少与cns疾病相关的行为症状。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防中枢神经系统(cns)病症，特别是与微生物-肠-脑轴功能障碍相关的那些病症和疾患。
[0061]
本发明的组合物还可用于治疗或预防神经发育障碍和/或神经精神疾患。神经发育疾病和神经精神疾患通常与微生物群-肠-脑轴有关。本发明的组合物可用于治疗或预防由微生物群-肠-脑轴功能障碍介导的神经发育疾病和/或神经精神疾患。在进一步优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防神经发育障碍或神经精神疾患。
[0062]
在特定实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或疾患：自闭症谱系障碍(asd)；儿童发育障碍；强迫症(ocd)；重性抑郁障碍；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；精神分裂症谱系障碍；精神分裂症；双相障碍；精神病；心境障碍；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；痴呆；阿尔茨海默病；帕金森病；和/或慢性疼痛。在进一步的实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或预防运动神经元疾病；亨廷顿病；格林-巴利综合征和/或脑膜炎。
[0063]
本发明的组合物可特别用于治疗或预防慢性疾病，治疗或预防对其它疗法(例如用抗精神病药和/或抗抑郁药治疗)没有反应的患者的疾病，和/或治疗或预防与微生物群-肠-脑轴功能障碍相关的组织损伤和症状。
[0064]
在某些实施方案中，本发明的组合物调节cns。在一些实施方案中，本发明的组合物调节自主神经系统(ans)。在一些实施方案中，本发明的组合物调节肠神经系统(ens)。在一些实施方案中，本发明的组合物调节下丘脑、垂体、肾上腺(hpa)轴。在一些实施方案中，
本发明的组合物调节神经内分泌通路。在一些实施方案中，本发明的组合物调节神经免疫通路。在一些实施方案中，本发明的组合物调节cns、ans、ens、hpa轴和/或神经内分泌和神经免疫通路。
[0065]
微生物群-肠-脑轴的信号传导由神经系统调节。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物调节神经系统中的信号传导。在某些实施方案中，本发明的组合物调节中枢神经系统的信号传导。在一些实施方案中，本发明的组合物调节感觉神经元中的信号传导。在其它实施方案中，本发明的组合物调节运动神经元中的信号传导。在一些实施方案中，本发明的组合物调节ans中的信号传导。在一些实施方案中，ans是副交感神经系统。在优选的实施方案中，本发明的组合物调节迷走神经的信号传导。在其它实施例中，ans是交感神经系统。在其它实施方案中，本发明的组合物调节肠神经系统中的信号传导。在某些实施方案中，ans和ens神经元的信号传导直接响应胃肠道的腔内容物。在其它实施方案中，ans和ens神经元的信号传导间接响应由腔细菌产生的神经化学物质。在其它实施方案中，ans和ens神经元的信号传导响应由腔细菌或肠内分泌细胞产生的神经化学物质。在某些优选的实施方案中，ens的神经元激活影响cns功能的迷走传入神经。在一些实施方案中，本发明的组合物调节肠嗜铬细胞的活性。
[0066]
在某些实施方案中，本发明的组合物调节动物模型中的恐惧条件反射。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于调节恐惧和/或焦虑的发展，和/或调节恐惧和/或焦虑在受试者中消失的程度。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于调节动物模型中应激诱导的体温过高的程度。在某些实施方案中，本发明的组合物调节受试者的应激和/或焦虑水平。
[0067]
实施例证明本发明的组合物可以增加bdnf的活化。bdnf作用于中枢神经系统的某些神经元，以支持现有神经元的存活，并帮助新神经元和突触的生长和发育。bdnf活跃于海马、皮层和基底前脑，它对长期记忆很重要。因此，本发明的组合物可用于增加bdnf的分泌。因此，组合物可用于治疗与长期记忆障碍相关的神经退行性疾病和/或神经精神疾患。本发明的组合物可用于改善长期记忆，特别是用于改善因神经退行性疾病和/或神经精神疾患而受损的长期记忆。
[0068]
已显示犬尿氨酸水平升高可在体外人多巴胺能神经母细胞瘤细胞系中减弱mpp+诱发的神经元细胞死亡[24]。在某些实施方案中，犬尿氨酸和犬尿酸可以激活gi芳烃受体(ahr)和gpr35受体。ahr受体的激活可诱导il-22的产生，从而抑制局部炎症。gpr35的激活诱导三磷酸肌醇的产生和ca2+动员。
[0069]
ido缺陷小鼠和用ido抑制剂治疗的小鼠在同种异体妊娠期间无法耐受胎儿，由于肠道微生物群无法耐受粘膜而发生结肠炎，并失去清除凋亡细胞的能力。此外，阻断或消除ido表达会加重移植物抗宿主病、自身免疫性和慢性疾患(如慢性肉芽肿病和糖尿病)模型中的炎症，这说明ido在控制炎症中发挥关键作用[25]。实施例证明本发明的组合物可以增加ido表达。本发明的组合物可用于治疗疾病或病症，例如中枢神经系统疾病或病症或疾患、肠道屏障功能受损、与肠道通透性增加相关的疾病、炎性疾病、代谢疾病和心血管疾病。
[0070]
神经发育障碍或神经精神疾患
[0071]
本发明还提供了包含纺锤链杆菌属细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防神经发育障碍或神经精神疾患的方法中。
[0072]
神经发育障碍或神经精神疾患可选自自闭症谱系障碍、强迫症、重性抑郁障碍、焦虑症或炎性神经认知障碍。
[0073]
自闭症谱系障碍(asd)
[0074]
自闭症谱系障碍是一组异质性神经发育疾患，其特征是早期发作的社交互动、交流方面的困难以及异常受限的重复行为和兴趣。症状可以从很小年龄时就被识别出来，但asd通常在开始接受主流教育的更有能力的儿童中被诊断出来。自闭症是asd的主要类型。
[0075]
历史上，自闭症的诊断基于三个核心领域：社交互动障碍、交流异常以及行为和兴趣受限和重复。在国际疾病分类(icd-10r，who 1993)和诊断和统计手册(dsm-iv，american psychiatric association，2000)中，自闭症列在广泛性发育障碍(pdd)的涵盖性术语下，有四种可能的诊断亚型：阿斯伯格综合征(asperger syndrome)、儿童自闭症/孤独症、非典型自闭症和pdd-未另行指定。在dms-5中，这些诊断亚型被合并为一个单一的自闭症谱系障碍(asd)类别，之前使用的有关障碍的三个核心领域已减少到两个主要领域，即社会交流和社交互动，以及重复行为，这包括感觉统合失调。
[0076]
asd是一种
‘
谱系障碍’，因为它以各种不同的方式影响每个人，范围从非常轻微到严重。受影响个体的功能因语言能力、智力水平、共病、症状的组成和获得服务的机会而有很大差异。认知功能、学习、注意力和感觉处理通常受损。
[0077]
dsm-iv指出，自闭症的诊断需要至少存在六种症状，包括最少两种定性社交互动障碍的测量、一种定性交流障碍的症状以及一种受限和重复行为的症状。dms-5将asd的诊断重新定义为两个症状领域：(i)社交互动和社会交流缺陷；以及(ii)受限的重复行为、兴趣或活动模式。
[0078]
共病在asd中非常普遍。共病包括焦虑和抑郁、癫痫发作、注意力缺陷、攻击性行为、睡眠问题、胃肠道病症、癫痫、智力低下、智力障碍和喂养困难。
[0079]
实施例证明本发明的组合物在自闭症谱系障碍的动物模型中实现了疾病发病率和疾病严重性的降低，因此它们可用于治疗或预防自闭症谱系障碍。
[0080]
已知丁酸钠可以减轻自闭症小鼠模型中的社交行为缺陷[26]。实施例首次证明纺锤链杆菌属细菌菌株可以产生丁酸盐。因此，不希望受任何特定理论的束缚，实施例中测试的细菌菌株可以通过产生丁酸盐来降低自闭症谱系障碍动物模型中的疾病发病率和疾病严重性。
[0081]
asd是一种中枢神经系统病症，它部分由环境因素引发。因此，微生物群-肠-脑轴的功能障碍可能是导致asd发展和持续的原因。因此，在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防自闭症谱系障碍。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防自闭症。在一些实施方案中，自闭症是广泛性发育障碍(pdd)。在另一个实施方案中，pdd是阿斯伯格综合征、儿童自闭症/孤独症、非典型自闭症和/或pdd-未另外指定。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防自闭症谱系障碍、孤独症、广泛性发育障碍；阿斯伯格综合征；儿童自闭症/孤独症、非典型自闭症和/或pdd-未另行指定。
[0082]
本发明的组合物可用于调节受试者的微生物群-肠-脑轴。因此，在优选的实施方案中，本发明的组合物用于预防已被鉴定为具有asd风险的患者或已在产前或早期发育阶段、在童年和/或成年期被诊断患有asd的患者的asd。本发明的组合物可用于预防asd的发展。
[0083]
本发明的组合物可用于管理或减轻asd。asd的治疗或预防可以指例如减轻症状的严重性，或降低恶化的频率，或减小对患者来说是个问题的触发因素的范围。
[0084]
在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻asd的至少一种核心症状。
[0085]
在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻在dms-5中分类的asd的两个症状领域中的至少一个。在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻社交互动和/或社会交流缺陷。在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻行为、兴趣或活动的限制性重复模式。在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻社交互动、社会交流缺陷和/或行为、兴趣或活动的限制性重复模式。
[0086]
在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻重复行为、刻板行为、强迫行为、惯例行为、相同行为和受限行为。在一些实施方案中，本发明的组合物改善患有asd的受试者的社交意识、社交信息处理、社会交流能力、社交焦虑/回避以及自闭症的先入为主和特性。
[0087]
在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻与asd的核心症状相关的额外症状。在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻患有asd的受试者的易怒(包括攻击性、故意自残和发脾气)、激动、叫喊、嗜睡、社会退缩、刻板行为、多动、不服从、不恰当的言语、焦虑、抑郁和/或过度控制或控制不足的行为。在一些实施方案中，本发明的组合物改善患有asd的受试者的认知功能、学习、注意力和/或感觉处理。
[0088]
在其它实施方案中，本发明的组合物改善患有asd的受试者的次要结果测量。在一些实施方案中，次要结果测量包括额外的症状和/或功能评定量表、行为量表和其它感兴趣的测量。
[0089]
在一些实施方案中，本发明的组合物引起用于评估患有asd的受试者的核心症状的诊断和/或症状量表的积极变化。在一些实施方案中，诊断和/或症状量表是自闭症诊断访谈-修订版(asi-r)。在一些实施方案中，诊断或症状量表是自闭症诊断观察日程表-通用(ados-g)，现在是ados-2。在其它实施方案中，诊断或症状量表是自闭症诊断访谈修订版(adi-r)。在其它实施方案中，诊断或症状量表是社交和沟通障碍诊断访谈(disco)。在其它实施方案中，诊断或症状量表是儿童自闭症评定量表(cars和cars2)。
[0090]
在一些实施方案中，本发明的组合物引起asd功效终点的通用测量的积极变化。在某些实施方案中，通用测量包括但不限于异常行为检查表(abc)、儿童行为检查表(cbcl)、文兰-ii适应性行为量表(vineland-ii adaptive behaviour scales，vabs)、社交反应量表(srs)和/或重复行为量表-修订版(rbs-r)。
[0091]
在一些实施方案中，本发明的组合物改善用于评估精神和神经病症的临床总体印象-总体改善(cgi-i)量表。在一些实施方案中，本发明的组合物对患有asd的受试者的总体功能表现出积极的影响。
[0092]
本领域技术人员已知额外的量表。在一些实施方案中，本发明的组合物将改善本领域技术人员已知的诊断和/或症状量表的结果。
[0093]
在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻asd共病的发生率。在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻焦虑和抑郁、癫痫发作、注意力缺陷、攻击性行为、睡眠问题、胃肠道病症(包括肠易激综合征(ibs))、癫痫、智力低下、智力障碍和/或喂
养困难的发生率。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻胃肠道共病，例如腹痛、腹泻和肠胃胀气。
[0094]
在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻临床上可能与自闭症相似的某些精神和行为障碍的症状。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻注意力缺陷障碍(adhd)；情感障碍/焦虑症；依恋障碍；对立违抗性障碍(odd)；强迫症(ocd)和/或精神病，包括精神分裂症(认知障碍)。
[0095]
在一些实施方案中，当与用于治疗asd的另一种疗法组合使用时，本发明的组合物特别有效地预防、减少或减轻asd。这类疗法包括抗精神病药、抗焦虑药和抗抑郁药。这类药物包括利培酮(risperidone，risperdal
tm
)；奥氮平(olanzapine，zyprexa
tm
)；氟西汀(fluoxetine，prozac
tm
)；舍曲林(sertraline，zoloft
tm
)；氟伏沙明(fluvoxamine，luvox
tm
)；氯米帕明(clomipramine，anafranil
tm
)；氟哌啶醇(haloperidol，haldol
tm
)；硫利达嗪(thioridazine)；氟奋乃静(fluphenazine)；氯丙嗪(chlorpromazine)；齐拉西酮(ziprasidone，geogon
tm
)；卡马西平(carbamazepine，tegretol
tm
)；拉莫三嗪(lamotrigine，lamictal
tm
)；托吡酯(topiramate，topomax
tm
)；丙戊酸(valproic acid，depakote
tm
)；哌醋甲酯(methylphenidate，ritalin
tm
)；地西泮(diazepam，valium
tm
)和劳拉西泮(lorazepam，ativan
tm
)。
[0096]
ema关于治疗自闭症谱系障碍药品临床开发的指南指出，由于疾病的异质性，单一化合物可能无法对所有核心症状产生显著效果，因此必须在至少一种核心症状上显示出短期疗效。实施例中使用的活生物治疗菌株已显示出对自闭症谱系障碍的至少一种核心症状的有效治疗，因此这些菌株和相关的布劳特氏菌属(blautia)菌株有望对人的疾病有效。
[0097]
强迫症(ocd)
[0098]
ocd是一种异质性的慢性致残性疾病，属于焦虑症。根据dsm-iv的定义，ocd的基本特征是反复出现的强迫观念和/或强迫行为(标准a)，这些强迫观念和/或强迫行为严重而且耗时(每天超过一小时)或引起明显痛苦或显著干扰受试者的日常惯例、职业功能、日常社交活动或关系(标准c)。在疾病过程中的某个时刻，患者已经认识到强迫观念或强迫行为是过度的或不合理的(标准b)。
[0099]
强迫观念被定义为反复出现和持续的想法、冲动或图像，这些想法、冲动或图像让人感觉是侵入性的和不恰当的，并导致明显的焦虑或痛苦。这些想法、冲动或图像不仅仅是对现实生活问题的过度担忧，患者认识到它们是自己思想的产物(例如对污染的恐惧、对对称性的痴迷)。这个人试图用其它一些想法或行为来忽略、抑制或中和这些强迫观念。
[0100]
强迫行为被定义为人们为了响应强迫观念或根据必须严格执行的规则而感到被驱使着执行的重复行为(例如洗手、订购、囤积、检查)或精神行为(例如祈祷、数数、默默地重复单词)。
[0101]
ocd通常与其它精神疾病的共病率有关，这些精神疾病包括重性抑郁障碍、其它焦虑症(广泛性焦虑症、社交焦虑症、恐慌症)、物质滥用和饮食障碍(厌食症和贪食症)。
[0102]
ocd是一种可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在的精神病症。因此，在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防受试者的ocd。
[0103]
在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻ocd的基本症状特征。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻受试者反复出现的强迫观念和/或强迫行
为。在某些实施方案中，强迫观念是反复出现或持续的想法、冲动或图像，这些想法、冲动或图像让人感觉是侵入性的和不恰当的，并导致明显的焦虑或痛苦。在某些实施方案中，强迫行为是受试者为了响应强迫观念或根据必须严格执行的规则而感到被驱使着执行的重复行为。
[0104]
在某些实施方案中，本发明的组合物根据y-bocs和/或nimh-oc诊断和/或症状量表改善受试者的ocd症状。在一些实施方案中，y-bocs量表用于监测主要终点的改善。在一些实施方案中，nimh-oc量表用于监测次要参数的改善。
[0105]
在一些实施方案中，本发明的组合物改善用于评估精神和神经病症的临床总体印象-总体改善(cgi-i)量表。在一些实施方案中，本发明的组合物对患有asd的受试者的总体社交功能(例如关系、工作等)表现出积极的影响。在一些实施方案中，总体量表是希恩残疾量表(sheehan disability scale)。
[0106]
在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻ocd的至少一种共病。ocd的共病包括重性抑郁障碍、其它焦虑症(广泛性焦虑症、社交焦虑症、恐慌症)、物质滥用和饮食障碍(厌食症和贪食症)、图雷特综合征(gilles de la tourette syndrome)、adhd(注意力缺陷/多动性障碍)和发育障碍。
[0107]
在一些实施方案中，当与用于治疗ocd的另一种疗法组合使用时，本发明的组合物特别有效地预防、减少或减轻ocd。这类疗法包括血清素和多巴胺再摄取抑制剂；氯米帕明和抗精神病药。
[0108]
重性抑郁障碍(mdd)
[0109]
mdd引起严重的社会心理功能障碍和高度的个体精神压力以及过高的发病率和死亡率(自杀风险相当大)。术语重性抑郁障碍涵盖临床抑郁症、重度抑郁症、单相抑郁症、单相障碍、复发性抑郁症和单纯性抑郁症。术语重性抑郁障碍覆盖心境障碍；心境恶劣；慢性抑郁症；季节性情感障碍和边缘型人格障碍。
[0110]
根据dms-5标准，mdd症状包括情绪低落，或对日常活动失去兴趣或乐趣超过两周；以及社交、职业和教育功能受损。几乎每天都会出现以下九种症状中的至少五种特定症状：一天中大部分时间情绪低落或易怒；每天大部分时间对大多数活动的兴趣或乐趣降低；体重显著改变或食欲改变；睡眠改变(失眠或嗜睡)；活动改变(精神运动性激越或迟缓)；疲劳或能量损失；内疚或无价值感(感到无价值或过度或不适当的内疚)；注意力下降(思考或集中注意力的能力下降，或更加优柔寡断；和自杀(有死亡或自杀的想法，或受试者有自杀计划)。此外，mdd与焦虑症状有关，包括不合理的担忧；专注于不愉快的担忧；难以放松和/或感到紧张。mdd发作可以是轻度、中度或重度的。
[0111]
mdd发作通常与其它精神病症或躯体病症(如帕金森病、阿尔茨海默病、脑血管疾病、癌症和慢性疼痛综合征)的共病有关。mdd经常与作为共病的广泛的其它精神障碍相关，包括广泛性焦虑症；焦虑症；物质使用障碍；创伤后应激障碍(ptsd)；人格障碍；疼痛；应激；肠易激综合征；失眠；头痛和人际问题。
[0112]
重性抑郁障碍是一种可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在的精神病症。因此，在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防受试者的mdd。
[0113]
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防急性重度抑郁发作和/或预防新发作(预防复发)。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻轻度、中度或
重度mdd发作的发生。
[0114]
在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻如按本文所列的dms-5标准分类的一种或多种mdd症状。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻受试者的情绪低落。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻受试者对大多数活动的兴趣或乐趣的降低。在一些实施方案中，本发明的组合物在2周时期内减少mdd症状的发生。
[0115]
在一些实施方案中，本发明的组合物根据症状或诊断量表改善mdd的症状。这种评估症状改善的量表包括汉密尔顿抑郁评定量表(hamilton rating scale of depression，hamd)和蒙哥马利阿斯伯格抑郁评定量表(montgomery asberg depression rating scale)。此外，曾氏自评抑郁量表(zung self-rating depression scale，sds)和曾氏自评焦虑量表(zung self-rating anxiety scale，sas)也是合适的症状改善量表。
[0116]
在一些实施方案中，本发明的组合物改善用于评估精神和神经病症的临床总体印象-总体改善(cgi-i)量表。在一些实施方案中，本发明的组合物对患有mdd的受试者的总体社交和职业功能表现出积极的影响。
[0117]
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防治疗抵抗性mdd。
[0118]
在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻mdd的至少一种共病。mdd的共病包括广泛性焦虑症；焦虑症；物质使用障碍；创伤后应激障碍(ptsd)；人格障碍；疼痛；应激；ibs；失眠；头痛和人际问题。
[0119]
在一些实施方案中，当与用于治疗mdd的另一种疗法组合使用时，本发明的组合物特别有效地预防、减少或减轻mdd。这类疗法包括抗抑郁药、加强策略(例如联合疗法、锂和其它情绪稳定剂、甲状腺激素和非典型抗精神病药)或甚至第二代抗精神病药。
[0120]
焦虑症
[0121]
焦虑症是一组以焦虑和恐惧感为特征的精神障碍。有许多焦虑症，包括广泛性焦虑症(gad)；特定恐惧症；社交焦虑症；分离焦虑症；广场恐惧症；恐慌症和选择性缄默症。
[0122]
gad的诊断依据dms-5中的六项标准。第一个标准是超过六个月的过度焦虑或担忧，其中许多活动中大部分时间都存在焦虑或担忧。第二个标准是受试者不能处理第一个标准的症状。第三个标准是至少出现以下三种(儿童中一种)：躁动；容易疲倦；难以集中注意力；易怒；肌肉紧张和睡眠问题。最后三个标准是症状导致严重的社交、职业和功能障碍；症状不是由药剂、药物或其它身体健康问题引起的；并且症状与另一种精神问题(例如恐慌症)不相符。所有其它焦虑症均可被视为gad的鉴别诊断。
[0123]
gad经常与作为共病的多种其它精神障碍相关联，包括抑郁症；物质使用障碍；应激；ibs；失眠；头痛；疼痛；心脏事件；人际问题和adhd。
[0124]
焦虑症是可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在的精神病症。因此，在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防受试者的焦虑症。在某些实施方案中，焦虑症是广泛性焦虑症(gad)；特定恐惧症；社交焦虑症；分离焦虑症；广场恐惧症；恐慌症和选择性缄默症。
[0125]
在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻如按本文所列的dms-5标准分类的受试者中的一种或多种gad症状。根据dms-5，相同的症状与其它焦虑症有关。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻受试者的焦虑症的一种或多种症状。
在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻受试者的焦虑或担忧。在某些实施方案中，本发明的组合物在六个月内减少症状的发生。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻躁动；疲劳；注意力不集中；易怒；肌肉紧张；和/或睡眠问题。在一些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻与焦虑症相关的社交、职业和功能障碍。
[0126]
在一些实施方案中，本发明的组合物根据症状或诊断量表改善焦虑症的症状。在某些实施方案中，用于评估症状改善的量表包括汉密尔顿焦虑评定量表(ham-a)。在一些实施方案中，ham-a总量表用于评估主要终点。在其它实施方案中，ham-a精神性焦虑因素可用作次要终点。
[0127]
在一些实施方案中，本发明的组合物改善用于评估精神和神经病症的临床总体印象-总体改善(cgi-i)量表。在一些实施方案中，本发明的组合物对患有焦虑症的受试者的总体社交、职业和功能障碍表现出积极的影响。在一些实施方案中，总体量表是希恩残疾量表。
[0128]
在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻gad和焦虑症的至少一种共病。gad的共病包括抑郁症；物质使用障碍；应激；ibs；失眠；头痛；疼痛；心脏事件；人际问题和adhd。
[0129]
在一些实施方案中，当与用于治疗焦虑症的另一种疗法组合使用时，本发明的组合物特别有效地预防、减少或减轻焦虑症。这类疗法包括选择性血清素再摄取抑制剂(文拉法辛(venlafaxine)、度洛西汀(duloxetine)、依他普仑(escitalopram)和帕罗西汀(paroxetine))；苯二氮卓类药物(阿普唑仑(alprazolam)、劳拉西泮和氯硝西泮(clonazepam))；普瑞巴林(pregabalin，)和加巴喷丁(gabapentin，)；血清素受体部分激动剂(丁螺环酮(buspirone)和坦多螺酮(tandospirone))；非典型血清素能抗抑郁药(如丙咪嗪(imipramine)和氯米帕明)；单胺氧化酶抑制剂(maoi)(如吗氯贝胺(moclobemide)和苯乙肼(phenelzine))；羟嗪；普萘洛尔(propranolol)；可乐定(clonidine)；胍法辛(guanfacine)和哌唑嗪(prazosin)。
[0130]
创伤后应激障碍(ptsd)
[0131]
创伤后应激障碍是一种严重且致残的病症，它的基本特征是包括创伤性事件作为该病症的诱发因素。
[0132]
根据dms-v标准，ptsd的症状分为四个主要类别：(i)侵扰：实例包括噩梦、对创伤性事件的不想要的想法、闪回以及对创伤性提示的反应，伴有情绪困扰或生理反应；(ii)回避：实例包括避免触发创伤性记忆，包括地点、对话或其它提示；(iii)认知和情绪的负面改变：实例包括自我或他人对创伤性事件的扭曲责备、对自己或世界的负面信念、持续的负面情绪(例如，恐惧、内疚、羞耻)、疏离感和情感受限(例如，无法体验积极情绪)；(iv)觉醒和反应性的改变：实例包括愤怒、鲁莽或自毁行为、睡眠问题、注意力问题、惊吓反应增加和过度警觉。
[0133]
在创伤性事件发生后4周内消退的症状符合急性应激障碍的标准。dsm区分急性(症状持续时间少于3个月)和慢性ptsd(症状持续时间超过3个月)。如果症状在应激物后6个月以上开始出现，则该疾病被定义为延迟发作ptsd。
[0134]
ptsd带有与重性抑郁障碍和物质使用障碍的高度共病。
[0135]
ptsd是一种可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在的精神病症。
因此，在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防受试者的ptsd。根据类似的发病机制，在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防应激障碍。在某些实施方案中，本发明的组合物治疗急性应激障碍。在一些实施方案中，本发明的组合物治疗急性和/或慢性ptsd。在一些实施方案中，本发明的组合物治疗延迟发作ptsd。
[0136]
在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻如按本文所列的dms-5标准分类的受试者中的一种或多种ptsd(或应激障碍)症状。在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻患有ptsd的受试者的侵入性思维。在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻患有ptsd的受试者的回避行为。在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻患有ptsd的受试者的认知和情绪的负面改变。在优选的实施方案中，本发明的组合物预防患有ptsd的受试者的觉醒和反应性的改变。
[0137]
在一些实施方案中，本发明的组合物根据症状或诊断量表改善ptsd和应激障碍的症状。在某些实施方案中，用于评估症状改善的量表是临床施用的ptsd(caps)量表。
[0138]
在一些实施方案中，本发明的组合物改善用于评估精神和神经病症的临床总体印象-总体改善(cgi-i)量表。在一些实施方案中，本发明的组合物对患有ptsd和应激障碍的受试者的总体社交、职业和功能障碍表现出积极的影响。在一些实施方案中，总体量表是希恩残疾量表。
[0139]
在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻ptsd和应激障碍的至少一种共病。ptsd和应激障碍的共病包括mdd、物质使用障碍；应激和焦虑。
[0140]
在一些实施方案中，当与用于治疗ptsd和应激障碍的另一种疗法组合使用时，本发明的组合物特别有效地预防、减少或减轻ptsd和应激障碍。这类疗法包括血清素能剂、三环类抗抑郁药、情绪稳定剂、肾上腺素能抑制剂、抗精神病药、苯二氮卓类药物、舍曲林(zoloft
tm
)、氟西汀(prozac
tm
)和/或帕罗西汀(paxil
tm
)。
[0141]
精神分裂症谱系和精神病性障碍
[0142]
这些疾病会影响受试者清晰思考、做出良好判断、情绪反应、有效沟通、理解现实和行为得体的能力。精神病包括精神分裂症(下面列出的症状)；分裂情感障碍(受试者有精神分裂症和心境障碍的症状，如抑郁症或双相障碍)；精神分裂症样精神障碍(表现出精神分裂症的症状，但症状持续时间较短：1至6个月之间)；短期精神病性障碍(受试者表现出突然的短期的精神病行为，通常是对极其应激事件，例如家庭中的死亡的反应-恢复通常不到一个月)；妄想症(妄想持续至少1个月)；共有型精神病性障碍；物质诱发的精神病性障碍；由另一种疾病引起的精神病性障碍；妄想痴呆(表现出与精神分裂症相似的症状，并且在人们上了年纪时开始出现在晚年)。最著名的精神病性障碍是精神分裂症，大多数精神病性障碍表现出与精神分裂症相似的症状。
[0143]
精神分裂症是一种具有异质病程和症状特征的严重精神疾病。精神分裂症在临床上表现为所谓的阳性和阴性症状。阳性症状包括妄想、幻觉、言语混乱以及混乱或紧张的行为。阴性症状包括情感平淡、思维和言语的流畅性和生产力受限以及目标导向行为的开始。阳性症状似乎反映了正常功能的过度或扭曲，而阴性症状似乎反映了正常功能的减少或丧失。此外，认知缺陷(工作记忆、信息处理、注意力/警觉、学习、推理和社会认知的缺陷)很常见。目前的抗精神病治疗通常显示认知缺陷改善不佳。精神分裂症患者也会出现情绪症状。除了这些主要症状外，精神分裂症还伴有与其它精神症状的共病，如躁狂和抑郁症状、焦虑
或强迫症状、物质滥用和依赖以及人格障碍。
[0144]
根据dms-5，对于精神分裂症的诊断，受试者必须具有以下症状中的至少两种：妄想；幻觉；言语混乱；混乱或紧张的行为和阴性症状。至少一种症状必须是存在妄想、幻觉或言语混乱。持续的干扰迹象必须持续至少6个月，在此期间受试者必须经历至少1个月的活动症状，并在相当长的时间内出现社交或职业恶化问题。
[0145]
精神分裂症谱系和精神病性障碍是可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在的精神病症。因此，在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防受试者的精神分裂症谱系和/或精神病性障碍。在某些实施方案中，精神分裂症谱系和精神病性障碍选自精神分裂症；分裂情感障碍；精神分裂症样精神障碍；短期精神病性障碍；妄想症；共有型精神病性障碍；物质诱发的精神病性障碍；由另一种疾病引起的精神病性障碍和妄想痴呆。在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防精神分裂症。在某些实施方案中，精神分裂症选自偏执型、错乱型、紧张型、未分化型和残留型精神分裂症。
[0146]
在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻如按本文所列的dms-5标准分类的受试者中的一种或多种精神分裂症症状。这些实施方案适用于预防、减少或减轻其它精神分裂症谱系和精神病性障碍的症状。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻精神分裂症的阴性症状。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻精神分裂症的阳性症状。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻精神分裂症的阴性和阳性症状。在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻患有精神分裂症的受试者的妄想、幻觉、言语混乱以及混乱或紧张的行为。在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻患有精神分裂症的受试者的情感平淡、思维和言语的流畅性和生产力受限以及目标导向行为的开始。在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻患有精神分裂症的受试者的认知缺陷和/或心境障碍。
[0147]
在某些实施方案中，本发明的组合物在6个月内减少受试者中精神分裂症的阳性和/或阴性症状的发生。在某些实施方案中，本发明的组合物改善患有精神分裂症谱系或精神病性障碍的受试者的社交和/或职业功能。
[0148]
在一些实施方案中，本发明的组合物根据症状或诊断量表改善精神分裂症谱系或精神病性障碍的症状。在某些实施方案中，用于评估症状改善的量表是阳性和阴性症状量表(panss)和简明精神病评定量表(bprs)。在某些实施方案中，使用阴性症状评定量表(sans)。
[0149]
在一些实施方案中，本发明的组合物改善用于评估精神和神经病症的临床总体印象-总体改善(cgi-i)量表。在一些实施方案中，本发明的组合物对患有精神分裂症谱系或精神病性障碍的受试者的总体社交和职业障碍表现出积极的影响。
[0150]
在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻精神分裂症谱系或精神病性障碍的至少一种共病。在某些实施方案中，共病是躁狂和抑郁症状、焦虑或强迫症状、物质滥用和依赖以及人格障碍。
[0151]
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防治疗抵抗性难治性精神分裂症。
[0152]
在一些实施方案中，当与用于治疗ptsd和应激障碍的另一种疗法组合使用时，本发明的组合物特别有效地预防、减少或减轻精神分裂症谱系或精神病性障碍。在某些实施
方案中，这类疗法包括第一代抗精神病药，包括氯丙嗪、氟奋乃静、氟哌啶醇和/或奋乃静(perphenazine)。在某些实施方案中，这类疗法包括第二代疗法，包括阿立哌唑(aripiprazole，abilify
tm
)；阿塞那平(asenapine，saphris
tm
)；依匹哌唑(brexpiprazole，rexulti
tm
)；卡利拉嗪(cariprazine，vraylar
tm
)；氯氮平(clozapine，clozaril
tm
)；伊潘立酮(iloperidone，fanapt
tm
)；鲁拉西酮(lurasidone，latuda
tm
)；奥氮平(olanzapine，zyprexa
tm
)；帕利哌酮(paliperidone，invega)；喹硫平(quetiapine，seroquel
tm
)；利培酮(risperdal
tm
)；齐拉西酮(geodon
tm
)。
[0153]
双相障碍
[0154]
双相障碍通常是一种慢性疾病。躁狂是双相障碍的主要症状。根据躁狂和抑郁发作的特定持续时间和模式，有几种类型的双相障碍。在dms-5中，区分了双相i型障碍、双相ii型障碍、循环性障碍、快速循环型双相障碍和nos型双相障碍。
[0155]
根据dsm，躁狂是一个明显的情绪异常和持续升高、膨胀或易怒的时期。发作必须持续一周，并且情绪必须至少具有以下三个症状：高自尊；睡眠需求减少；语速提高；想法快速跳跃；容易分心；对目标或活动的兴趣增加；精神运动性激越；对高危险性活动的追求增加。
[0156]
双相i型障碍包括一次或多次躁狂或混合(躁狂和抑郁)发作和至少一次重度抑郁发作(有关mdd发作的症状见上文)。双相ii型障碍有一次或多次重度抑郁发作并伴有至少一次轻躁狂发作。没有躁狂或混合发作。轻躁狂是一种较轻的躁狂形式。这些症状是造成重大社交、职业和功能障碍的原因。循环性精神病的特征是低水平的抑郁症随着轻度躁狂期一起改变。在做出诊断之前，成人的症状必须至少存在两年或儿童的症状必须存在一年。成人和儿童的无症状期分别持续不超过两个月或一个月。快速循环型双相障碍是一种严重的双相障碍形式。当一个人在一年内至少有四次重度抑郁症、躁狂症、轻躁狂症或混合状态发作时，就会发生这种情况。未另行指定(nos)型双相障碍将明显不适合其它类型的双相症状分类。当存在多种双相症状但不足以满足任何其它亚型的标签时，即可诊断为nos。
[0157]
双相障碍与以下共病有关：adhd；焦虑症；物质障碍；肥胖和代谢综合征。
[0158]
双相障碍是可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在的精神病症。因此，在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防受试者的双相障碍。在某些实施方案中，双相障碍是双相i型障碍。在某些实施方案中，双相障碍是双相ii型障碍。在某些实施方案中，双相障碍是循环性障碍。在某些实施方案中，双相障碍是快速循环型双相障碍。在某些实施方案中，双相障碍是nos型双相障碍。
[0159]
在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻受试者中双相障碍的一种或多种症状。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻受试者中躁狂发作的发生。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻情绪异常和持续升高、膨胀或易怒的发生。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻以下一种或多种症状：高自尊；睡眠需求减少；语速提高；想法快速跳跃；容易分心；对目标或活动的兴趣增加；精神运动性激越；对高危险性活动的追求增加。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻受试者中躁狂或混合发作的发生。在某些实施方案中，本发明的组合物减少受试者中至少一次重度抑郁发作的发生。在某些实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻伴有至少一次轻躁狂发作的至少一次重度抑郁发作的发生。
[0160]
在优选的实施方案中，本发明的组合物治疗双相障碍的急性期和/或预防进一步发作的发生。在某些实施方案中，本发明的组合物治疗患有双相障碍的受试者的躁狂/抑郁发作的急性期并预防进一步的躁狂/抑郁发作的发生。
[0161]
在一些实施方案中，本发明的组合物根据症状或诊断量表改善双相障碍的症状。在某些实施方案中，用于评估躁狂发作的症状改善的量表是躁狂状态评定量表和杨氏躁狂评定量表(young mania rating scale)。在某些实施方案中，量表是贝克-拉范森躁狂量表(bech-rafaelsen mania scale，brmas)。在某些实施方案中，用于评估从躁狂发作转变为抑郁发作的症状改善的量表包括汉密尔顿抑郁评定量表、蒙哥马利-阿斯伯格评定量表和贝克-拉范森抑郁量表。
[0162]
在一些实施方案中，本发明的组合物改善用于评估精神和神经病症的临床总体印象-总体改善(cgi-i)量表。在一些实施方案中，本发明的组合物对患有双相障碍的受试者的总体社交、职业和功能障碍表现出积极的影响。
[0163]
在优选的实施方案中，本发明的组合物预防、减少或减轻双相障碍的至少一种共病。在某些实施方案中，共病选自adhd、焦虑症、物质障碍、肥胖症和代谢综合征。
[0164]
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防对锂和双丙戊酸钠(divalproex)无反应的躁狂抑郁症和双相障碍。
[0165]
在一些实施方案中，当与用于治疗双相障碍的另一种疗法组合使用时，本发明的组合物特别有效地预防、减少或减轻双相障碍。在某些实施方案中，这类疗法包括碳酸锂、抗惊厥药(包括丙戊酸盐、双丙戊酸钠、卡马西平和拉莫三嗪)和抗精神病药(包括阿立哌唑、奥氮平、喹硫平和利培酮)。
[0166]
肠道通透性
[0167]
细菌可以通过调节肠道通透性水平来调节微生物群-肠-脑轴的信号传导。肠道屏障是一个复杂的多层系统，它将内部环境与管腔环境分开，由外部“物理”屏障和内部“功能性”免疫屏障组成。肠道屏障阻止抗原和微生物进入体内，同时允许宿主与环境之间的分子交换和营养物质的吸收。肠道通透性被定义为给定部位肠道屏障的功能特征，可通过分析惰性分子穿过肠壁时的通量率来测量[27]。
[0168]
除了本文讨论的几种cns病症外，与肠道通透性相关的疾病还包括肠道疾病；如胃溃疡、感染性腹泻、肠易激综合征；功能性胃肠道疾病、炎性肠病、乳糜泻和癌症(食道、结肠直肠)和肠外疾病；例如食物过敏、感染(例如呼吸道)、急性炎症(败血症、全身炎症反应综合征(sirs)、多器官衰竭)、肥胖、代谢疾病(例如nafld和nash、2型糖尿病或心血管疾病)和慢性炎症(例如关节炎)。这些疾病的特征是炎症，炎症可能是由组分从管腔转移到体内引发的[27]。
[0169]
本发明人已经证明，纺锤链杆菌属细菌菌株可以降低肠道中的肠道通透性。已知丁酸盐在维持肠道屏障方面发挥作用。丁酸盐的减少会导致紧密连接损伤和肠道通透性受损[27]。实施例证明本发明的细菌菌株可以增加丁酸盐的产生。因此，本发明的组合物可用于降低肠道通透性。
[0170]
因此，本发明的细菌菌株特别用于改善肠道屏障功能，从而治疗或预防与肠道通透性增加有关的疾病。本发明的细菌菌株还可用于治疗或预防以肠道通透性改变为特征的疾病。本发明的组合物可用于降低受试者的肠道通透性，特别是通过诱导丁酸盐产生和/或
通过增加胃肠道中的丁酸盐水平。实施例首次证明纺锤链杆菌属细菌菌株可以产生丁酸盐。
[0171]
在本发明的实施方案中，本发明的组合物用于改善例如被鉴定为肠道屏障功能受损的受试者中的肠道屏障功能。本发明的组合物的这种作用提供了一种新的临床情况，因为被鉴定为肠道屏障功能受损并伴有其它疾患，特别是与肠道通透性增加相关的那些疾患的受试者更有可能对使用本发明的组合物的治疗作出反应。
[0172]
因此，本发明的组合物可用于治疗或预防胃溃疡、感染性腹泻、肠易激综合征、功能性胃肠道疾病、炎性肠病、乳糜泻和癌症(食道、结肠直肠)、食物过敏、感染(例如呼吸道)、急性炎症(败血症、全身炎症反应综合征(sirs)、多器官衰竭)、肥胖、代谢疾病(例如nafld和nash、2型糖尿病或心血管疾病)和慢性炎症(例如关节炎)。
[0173]
因此，本发明的组合物可以特别有效地预防或延缓与肠道通透性增加或改变有关的疾病的发作或进展。在某些实施方案中，本发明的组合物用于延迟与肠道通透性增加或改变相关的疾病的发作或进展。在施用本发明的组合物之后对与肠道通透性增加或改变相关的疾病的预防可以相对于在治疗前的患者、健康个体或患有更严重形式的与肠道通透性增加或改变相关的疾病的个体中观察到的疾病状态来测量。
[0174]
短链脂肪酸(scfa)产生
[0175]
短链脂肪酸(scfa)，如乙酸盐(c2)、丙酸盐(c3)和丁酸盐(c4)，是肠道内厌氧菌发酵的代谢产物。这些scfa是肠道微生物组引发的有益作用的关键介体，并被认为是微生物群和宿主组织之间的联系。scfa，主要是丁酸盐，可以调节巨噬细胞的炎症介体(包括tnf-α、il-6和il-10)产生。由于其能够调节炎症反应，所以已提出scfa在炎性疾患，如炎性肠病、败血症和急性肺损伤(ali)中的治疗应用[28]。本发明人新确定，来自纺锤链杆菌属的细菌菌株可以产生丁酸盐。不希望受任何特定理论的束缚，本发明的组合物可以通过调节炎症介体，如tnf-α、il-6和il-10的产生而特别有效地治疗或预防炎性疾患，例如炎性肠病、败血症和急性肺损伤(ali)。
[0176]
scfa还参与调节代谢和心血管健康。已证明scfa可以调节收缩压和舒张压，例如研究表明丁酸盐可以通过减少炎症来降低舒张压。此外，已提出scfa通过减少食欲和能量摄入以及调节葡萄糖稳态来预防饮食引起的肥胖[29]。已发现三甲胺-n-氧化物(tmao)通路将肠道微生物群与心血管疾病，例如动脉粥样硬化联系起来[30]。
[0177]
实施例表明，纺锤链杆菌属细菌可以增加包括丁酸盐在内的scfa产生。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防炎性疾病，例如炎性肠病、败血症和急性肺损伤(ali)。
[0178]
此外，本发明的组合物可用于治疗或预防代谢疾病，例如肥胖和糖尿病和心血管疾病，例如动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉疾病、心绞痛和心肌梗塞、心律失常、心力衰竭、瓣膜性心脏病、心包疾病、中风、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、先天性心脏病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、血栓栓塞性疾病和静脉血栓形成。
[0179]
施用模式
[0180]
优选地，本文公开的组合物将施用至胃肠道，以使得能够将本发明的细菌菌株递送到肠道和/或部分或全部定殖于肠道。换句话说，细菌可能已经定殖于一部分或全部胃肠道和/或这种定殖可能是短暂的或永久的。
[0181]
更具体地说，在一些实施方案中，“全部定殖于肠道”是指细菌已定殖于肠道的所
有部分(即小肠、大肠和直肠)。另外或替代地，术语“全部定殖”意指细菌永久地移入肠道的一些或所有部分。
[0182]
在一些实施方案中，“部分定殖于肠道”意指细菌已定殖于肠道的一些但不是所有部分。另外或替代地，术语“部分定殖”意指细菌短暂地移入肠道的一些或所有部分。
[0183]
可以通过在给药间隔结束后定期(例如每天)评估(例如粪便样品中)本发明的细菌菌株的丰度来确定移入的短暂性，以确定洗脱期，即在给药间隔结束与不存在可检测水平的本发明的细菌菌株之间的时期。在本发明的实施方案中，洗脱期为14天或更少、12天或更少、10天或更少、7天或更少、4天或更少、3天或更少、2天或更少或1天或更少。
[0184]
在本发明的实施方案中，本发明的细菌短暂地移入大肠中。
[0185]
一般地，虽然本发明的组合物经口施用，但它们可以经直肠、鼻内或通过颊或舌下途径施用。
[0186]
在某些实施方案中，本发明的组合物可以呈片剂、泡沫、喷雾或凝胶形式施用。
[0187]
在某些实施方案中，本发明的组合物可以呈栓剂，例如直肠栓剂，例如呈可可豆油(可可脂)、合成硬脂(例如suppocire、witepsol)、甘油基-明胶、聚乙二醇或肥皂甘油组合物的形式施用。
[0188]
在某些实施方案中，本发明的组合物通过管，例如鼻饲管、口胃管、胃管、空肠造口管(j型管)、经皮内窥镜胃造口术(percutaneous endoscopic gastrostomy，peg)或端口，例如通向胃、空肠或其它适合进入端口的胸壁端口施用于胃肠道。
[0189]
本发明的组合物可以施用一次，或者它们可以作为治疗方案的一部分连续施用。在某些实施方案中，本发明的组合物将每日施用(一次或几次)。
[0190]
在某些实施方案中，本发明的组合物定期施用，例如每天、每两天或每周施用，持续较长时间，例如至少一周、两周、一个月、两个月、六个月或一年。
[0191]
在一些实施方案中，本发明的组合物施用7天、14天、16天、21天或28天或不超过7天、14天、16天、21天或28天。例如，在一些实施方案中，本发明的组合物施用16天。
[0192]
在本发明的某些实施方案中，根据本发明的治疗伴随有对患者肠道微生物群的评估。如果未实现本发明菌株的递送和/或部分或全部定殖以致未观察到功效，则可以重复治疗，如果递送和/或部分或全部定殖成功且观察到功效，则可以停止治疗。
[0193]
在某些实施方案中，本发明的组合物可以施用于怀孕的动物，例如哺乳动物，例如人，以预防疾病、病症或疾患在其子女中在子宫内和/或出生后出现。例如，可以将本发明的组合物施用于怀孕的动物以预防中枢神经系统疾病或病症的发展。
[0194]
本发明的组合物可以施用于已被诊断患有疾病、病症或疾患，例如中枢神经系统疾病或病症或者已被鉴定为处于疾病、病症或疾患风险中的患者。组合物也可以作为预防措施施用以预防健康患者中疾病、病症或疾患的发展。
[0195]
本发明的组合物可以施用于已被诊断患有自闭症的患者。它们也可以施用于已被鉴定为处于自闭症风险中的患者。组合物也可以作为预防措施施用以防止健康患者中自闭症的发展。
[0196]
本发明的组合物可以施用于已被鉴定为具有异常肠道微生物群的患者。举例来说，患者可以具有减少或缺乏的纺锤链杆菌属和尤其食糖纺锤链杆菌的定殖。
[0197]
本发明的组合物可以作为食品，例如营养补充剂施用。
[0198]
一般地，本发明的组合物用于预防或治疗人，不过其可以用于治疗动物，包括单胃哺乳动物，例如家禽、猪、猫、犬、马或兔。本发明的组合物可用于增强动物的生长和性能。如果施用于动物，则可以使用口服管饲法。
[0199]
在一些实施方案中，要施用组合物的受试者是成年人。在一些实施方案中，要施用组合物的受试者是儿童。在一些实施方案中，要施用组合物的受试者是婴儿。
[0200]
组合物
[0201]
本发明的组合物包含细菌。本发明人已经鉴定了来自纺锤链杆菌属的细菌治疗炎性中枢神经系统疾病或病症的惊人能力。然而，为了使来自纺锤链杆菌属的细菌发挥其有益作用，它们需要有效地活着和/或有活力地递送到小肠。一般来说，本发明的组合物因此不包含纺锤链杆菌属物种的灭活细菌，特别是纺锤链杆菌属物种的热灭活细菌。
[0202]
本发明提供了组合物，其被配制成防止细菌在上消化道中被降解或吸收并且不能发挥它们的作用。例如，组合物可以包含除氧剂和/或益生元基质，例如维生素c和不易消化的碳水化合物。
[0203]
此外，组合物可以进行肠溶配制，以确保细菌在到达小肠的途中不会被降解。
[0204]
因此，在优选的实施方案中，本发明的组合物被封装以使得细菌菌株能够被递送到肠道。封装保护组合物免于降解，直到通过例如用化学或物理刺激，例如压力、酶活性或物理性崩解(其可以通过ph值改变而触发)进行破裂而递送到目标位置。可以使用任何适当的封装方法。示例性封装技术包括截留在多孔基质内、附着或吸附在固体载体表面上、通过絮凝或利用交联剂而自聚集以及机械容纳在微孔膜或微胶囊后。可用于制备本发明组合物的封装指南可以在例如参考文献[31]和[32]中获得。
[0205]
在本发明的优选的实施方案中，组合物被配制成冻干形式。举例来说，本发明的组合物可以包括包含本发明的细菌菌株的颗粒或明胶胶囊，例如硬明胶胶囊。优选地，本发明的组合物包含冻干细菌。细菌的冻干是一个成熟的程序，相关指南可在例如参考文献[33-35]中获得。实施例证明冻干组合物特别有效。
[0206]
或者，本发明的组合物可包含活的有活性的细菌培养物。实施例证明本发明的细菌培养物是治疗有效的。
[0207]
本发明组合物中的细菌菌株可能未被灭活，例如，可能未被热灭活。本发明组合物中的细菌菌株可能未被杀死，例如未被热杀死。本发明组合物中的细菌菌株可能未被减毒，例如未被热减毒。例如，本发明组合物中的细菌菌株可能尚未被杀死、灭活和/或减毒。例如，本发明组合物中的细菌菌株是活的。例如，本发明组合物中的细菌菌株是有活力的。例如，本发明组合物中的细菌菌株能够部分或全部定殖于肠道。
[0208]
本发明组合物中的细菌菌株优选是有活力的。优选地，它能够部分或全部定殖于肠道。本发明组合物中的细菌菌株可以是活的并且有活力的。本发明组合物中的细菌菌株可以是活的，有活力的，并且能够部分或全部定殖于肠道。
[0209]
组合物可以包含活细菌菌株和已被杀死的细菌菌株的混合物。
[0210]
组合物可以经口施用并且可以呈片剂、胶囊或粉剂的形式。封装产品是优选的，因为纺锤链杆菌属是专性厌氧的。
[0211]
本发明的组合物包括治疗有效量的本发明细菌菌株。治疗有效量的细菌菌株足以对患者发挥有益作用。治疗有效量的细菌菌株可足以递送到患者肠道和/或部分或全部定
殖于患者的肠道。
[0212]
例如对于成年人来说，合适的细菌日剂量可以是约1x103至约1x10
11
菌落形成单位(colony forming unit，cfu)；例如，约1x107至约1x10
10
cfu；在另一个实例中，约1x106至约1x10
10
cfu；在另一个实例中，约1x107至约1x10
11
cfu；在另一个实例中，约1x108至约1x10
10
cfu；在另一个实例中，约1x108至约1x10
11
cfu。
[0213]
在某些实施方案中，细菌的剂量是每天至少109个细胞，例如每天至少10
10
、至少10
11
或至少10
12
个细胞。
[0214]
相对于组合物的重量，一剂组合物可包含约1x106至约1x10
11
菌落形成单位(cfu)/g的细菌菌株。该剂量可能适合成年人。例如，组合物可包含约1x103至约1x10
11
cfu/g的细菌菌株；例如，约1x107至约1x10
10
cfu/g；在另一个实例中，约1x106至约1x10
10
cfu/g；在另一个实例中，约1x107至约1x10
11
cfu/g；在另一个实例中，约1x108至约1x10
10
cfu/g；在另一个实例中，约1x108至约1x10
11
cfu/g、约1x108至约1x10
10
cfu/g。剂量可以是例如1g、3g、5g和10g。
[0215]
组合物可以被配制成益生菌。益生菌被fao/who定义为一种活的微生物，当它以足够的量施用时，它会给宿主带来健康益处。
[0216]
通常，益生菌任选地与至少一种合适的益生元化合物组合。在某些实施方案中，本发明的益生菌组合物可包括量为相对于组合物总重量，约1至约30重量％(例如5至20重量％)的益生元化合物。已知的益生元包括商业产品，例如菊糖和反式半乳寡糖。
[0217]
益生元化合物通常是一种不易消化的碳水化合物，例如寡糖或多糖，或糖醇，它们不会在上消化道中降解或吸收。
[0218]
潜在的益生元可以具有许多有益的生理特性，包括：消化道上部的抗消化能力，可以被肠道微生物群发酵，对宿主的健康有益，可以选择性地刺激益生菌的生长，以及在各种食物或饲料加工条件下稳定。
[0219]
碳水化合物可以选自由以下组成的群：果寡糖(或fos)、短链果寡糖、菊糖、异麦芽寡糖、果胶、木寡糖(或xos)、几丁寡糖(或cos)、β-葡聚糖、阿拉伯胶改性和抗性淀粉、聚葡萄糖、d-塔格糖、阿拉伯胶纤维、角豆树、燕麦和柑桔纤维。在一个方面中，益生元是短链果糖-寡糖(下文中简单起见展示为foss-c.c)；所述foss-c.c是不可消化的碳水化合物，一般由甜菜糖的转变而获得，并且包括与三个葡萄糖分子键结的蔗糖分子。益生元可以刺激胃肠道中来自纺锤链杆菌属的细菌的生长和活性。这允许细菌对宿主发挥治疗炎性中枢神经系统疾病或病症的有益作用。
[0220]
可以包括其它益生元化合物(例如维生素c)作为除氧剂并改善递送和/或部分或全部定殖和体内存活。或者，本发明的益生菌组合物可以作为食品或营养产品，例如基于牛奶或乳清的发酵乳制品，或作为药品经口施用。
[0221]
本发明的组合物可以与用于治疗或预防中枢神经系统疾病或病症的另一种治疗化合物组合使用。本发明的组合物可以与调节神经保护或神经增殖的营养补充剂一起施用。营养补充剂包含营养维生素或由营养维生素组成。例如，维生素可以是维生素b6、镁、二甲基甘氨酸(维生素b16)和维生素c。本发明的组合物可以与另一种益生菌组合施用。
[0222]
在某些实施方案中，本发明的组合物用于增强第二剂对中枢神经系统疾病或病症的作用。本发明组合物的免疫调节作用可以使大脑更容易受到常规疗法的影响，这些常规疗法例如左旋多巴(levodopa)、多巴胺激动剂、mao-b抑制剂、comt抑制剂、谷氨酸拮抗剂或
抗胆碱能药，它们是与本发明的组合物组合施用的示例性辅助剂(依次或同时)。
[0223]
本发明的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂或载体。这类合适赋形剂的实例可以见于参考文献[36]中。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是制药领域中众所周知的并且描述于例如参考文献[37]中。合适载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药学实践来选择。药物组合物可以包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂作为载体、赋形剂或稀释剂，或除载体、赋形剂或稀释剂之外可以包含所述物质。合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂)、天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶)或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
[0224]
本发明的组合物可以配制为食品。举例来说，除本发明的治疗作用之外，食品还可以提供营养益处，例如营养补充剂中。类似地，食品可以被配制成增强本发明组合物的口味，或通过使其更类似于普通食品而非药物组合物，使得组合物食用起来更具吸引力。在某些实施方案中，本发明的组合物被配制为基于牛奶的产品。术语“基于牛奶的产品”意指具有变化脂肪含量的任何基于牛奶或乳清的液体或半固体产品。基于牛奶的产品可以是例如奶牛奶、山羊奶、绵羊奶、脱脂乳、全脂奶、未经任何加工从奶粉和乳清重组的奶或加工产品，例如酸奶酪、凝乳、凝块、酸牛奶、酸全脂奶、酪乳和其它酸奶产品。另一重要组包括乳饮料，例如乳清饮料、发酵乳、炼乳、婴儿或婴孩乳；调味奶、冰淇淋；含牛奶的食物，例如甜食。
[0225]
本发明的组合物可以包含纺锤链杆菌属的一种或多种细菌菌株并且不含来自任何其它属的细菌，或者可仅包含最低限度量或生物学上不相干量的来自另一属的细菌。因此，本发明提供了一种用于疗法中的组合物，其包含纺锤链杆菌属的一种或多种细菌菌株，不含来自任何其它属的细菌或仅包含最低限度量或生物学上不相干量的来自另一属的细菌。
[0226]
本发明的组合物可以包含食糖纺锤链杆菌物种的一种或多种细菌菌株并且不含来自任何其它物种的细菌，或者可仅包含最低限度量或生物学上不相干量的来自另一物种的细菌。因此，本发明的组合物可以包含食糖纺锤链杆菌物种的一种或多种细菌菌株并且不含来自任何其它物种的细菌，或者可仅包含最低限度量或生物学上不相干量的来自另一物种的细菌，所述组合物用于疗法中。
[0227]
在一些实施方案中，组合物不包含梭菌属(clostridium)(例如艰难梭菌)的细菌和/或不包含脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)物种的细菌。在一些实施方案中，组合物不包含多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)。
[0228]
本发明的组合物可含有单一细菌物种并且可不含任何其它细菌物种。在某些实施方案中，本发明的组合物含有单一细菌菌株且不含有任何其它细菌菌株。举例来说，本发明的组合物可以仅包含食糖纺锤链杆菌物种的细菌菌株。这类组合物可仅包含最低限度量或生物学上不相干量的其它细菌菌株或物种。这类组合物可以是基本上不含其它生物体物种的培养物。在一些实施方案中，这类组合物可以是基本上不含其它生物体物种的冻干物。
[0229]
本发明还提供了一种用于疗法中的组合物，其包含纺锤链杆菌属的单一细菌菌株，不含来自任何其它菌株的细胞或仅包含最低限度量或生物学上不相干量的来自另一菌株的细菌。
[0230]
本发明还提供了一种用于疗法中的组合物，其包含食糖纺锤链杆菌物种的单一细菌菌株，不含来自任何其它菌株的细胞或仅包含最低限度量或生物学上不相干量的来自另一菌株的细菌。
[0231]
本发明的组合物可以包含多于一种的细菌菌株。例如，在一些实施方案中，本发明的组合物包含多于一种来自同一物种的菌株(例如多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或45种菌株)，并且，任选地，不含来自任何其它物种的细菌。在一些实施方案中，本发明的组合物包含少于50种来自同一物种的菌株(例如少于45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3种菌株)，并且，任选地，不含来自任何其它物种的细菌。在一些实施方案中，本发明的组合物包含1-40、1-30、1-20、1-19、1-18、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-50、2-40、2-30、2-20、2-15、2-10、2-5、6-30、6-15、16-25或31-50种来自同一物种的菌株，并且，任选地，不含来自任何其它物种的细菌。本发明包含前述的任何组合。
[0232]
组合物可以包含微生物菌群。例如，组合物可包含纺锤链杆菌属菌株作为微生物菌群的一部分。例如，纺锤链杆菌属菌株可以与一种或多种(例如至少2、3、4、5、10、15或20种)其它细菌菌株组合存在，所述其它细菌菌株来自纺锤链杆菌属和/或可以在体内在肠道内一起共生的其它属。例如，组合物包含与来自不同属的细菌菌株组合的纺锤链杆菌属细菌菌株。在一些实施方案中，微生物菌群包含从单一生物体如人的粪便样品中获得的两种或更多种细菌菌株。微生物菌群可能在自然界中无法一起发现。举例来说，微生物菌群包含从至少两种不同生物体的粪便样品中获得的细菌菌株。微生物菌群可以包含来自相同物种的两个不同生物体，例如两个不同的人的细菌。例如，两个不同生物体是婴儿和成人。微生物菌群可以包含来自两种不同生物体的细菌，它们不是来自同一物种，例如人类和非人类哺乳动物。
[0233]
本发明的组合物还可包含与ht03-11t、ko-38、tt-111或ncimb43527食糖纺锤链杆菌菌株具有相同安全性和治疗功效特征的细菌菌株。
[0234]
在本发明的组合物包含多于一种细菌菌株、物种或属的一些实施方案中，各个细菌菌株、物种或属可分开、同时或依次施用。例如，组合物可以包含多于一种细菌菌株、物种或属中的全部，或者细菌菌株、物种或属可以分开存储并且分开、同时或依次施用。在一些实施方案中，多于一种细菌菌株、物种或属分开存储，但在使用前混合在一起。
[0235]
在一些实施方案中，用于本发明的细菌菌株从成人粪便中获得。在本发明的组合物包含多于一种细菌菌株的一些实施方案中，所有细菌菌株均从成人粪便中获得，或者如果存在其它细菌菌株，则它们仅以最低限度量存在。细菌可以在从成人粪便中获得并用于本发明的组合物之后进行培养。
[0236]
在一些实施方案中，用于本发明的细菌菌株从婴儿粪便中获得。在本发明的组合物包含多于一种细菌菌株的一些实施方案中，所有细菌菌株均从婴儿粪便中获得，或者如果存在其它细菌菌株，则它们仅以最低限度量存在。细菌可以在从婴儿粪便中获得并用于本发明的组合物之后进行培养。
[0237]
如上所述，在一些实施方案中，一种或多种纺锤链杆菌属菌株是本发明组合物中唯一的治疗活性剂。在一些实施方案中，组合物中的细菌菌株是本发明组合物中唯一的治疗活性剂。
[0238]
根据本发明使用的组合物可能需要或可能不需要市场批准。
[0239]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中所述细菌菌株被冻干。在某些实施方案中，本发明提供了一种包含如前所论述的细菌菌株的冻干药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中所述细菌菌株被喷雾干燥。在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中细菌菌株被冻干或喷雾干燥并且其中它是活的。在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中细菌菌株被冻干或喷雾干燥并且其中它是有活力的。在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中细菌菌株被冻干或喷雾干燥，并且其中它能够部分或全部定殖于肠道。在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中细菌菌株被冻干或喷雾干燥并且其中它是有活力的并且能够部分或全部定殖于肠道。
[0240]
在一些情况下，冻干细菌菌株在施用之前复原。在一些情况下，复原是通过使用本文中描述的稀释剂进行的。
[0241]
本发明的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
[0242]
在某些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中，当施用于有需要的受试者时，细菌菌株的量足以治疗炎性神经退行性病症。
[0243]
在某些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释体；其中细菌菌株的量足以治疗炎性神经退行性病症。
[0244]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中细菌菌株的量相对于组合物的重量是每克约1
×
103至约1
×
10
11
菌落形成单位。
[0245]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中组合物以1g、3g、5g或10g的剂量施用。
[0246]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中组合物通过选自由口腔、直肠、皮下、鼻、颊和舌下组成的组的方法施用。
[0247]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其包含选自由乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇和山梨糖醇组成的组的载体。
[0248]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其包含选自由乙醇、甘油和水组成的组的稀释剂。
[0249]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其包含选自由以下组成的组的赋形剂：淀粉、明胶、葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。
[0250]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其还包含防腐剂、抗氧化剂和稳定剂中的至少一种。
[0251]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其包含选自由苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯组成的组的防腐剂。
[0252]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中所述细菌菌株被冻干。
[0253]
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中当组合物存储在密封容器中约4℃或约25℃下并且容器放置在具有50％相对湿度的气氛中时，在至少约1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年时期后，如以菌落形成单位测量，至少80％细菌菌株残留。
[0254]
在一些实施方案中，本发明的组合物提供在包含如本文所述的组合物的密封容器中。在一些实施方案中，密封容器是小袋或瓶子。在一些实施方案中，本发明的组合物提供在包含如本文所述的组合物的注射器中。
[0255]
在一些实施方案中，本发明的组合物可以呈药物制剂提供。举例来说，组合物可以呈片剂或胶囊提供。在一些实施方案中，胶囊是明胶胶囊(“明胶-胶囊”)。胶囊可以是硬胶囊或软胶囊。在一些实施方案中，制剂是软胶囊。软胶囊是由于添加软化剂，例如存在于胶囊壳中的甘油、山梨糖醇、麦芽糖醇和聚乙二醇而可以具有一定弹性和柔软性的胶囊。例如，可以基于明胶或淀粉生产软胶囊。基于明胶的软胶囊可从各种供应商处购得。根据施用方法，例如经口或直肠施用，软胶囊可以具有各种形状，例如，它们可以是圆形、卵形、椭圆形或鱼雷形。软胶囊可以通过常规方法，例如通过谢勒法(scherer process)、阿可吉尔法(accogel process)或液滴法或吹制法生产。
[0256]
在一些实施方案中，本发明的组合物经口施用。经口施用可涉及吞咽，以使化合物进入胃肠道。
[0257]
适合经口施用的药物制剂包括固体塞、固体微粒、半固体和液体(包括多相或分散系统)，如片剂；含有多颗粒或纳米颗粒、液体(例如水溶液)、乳液或粉末的软或硬胶囊；锭剂(包括填充液体)；咀嚼片；凝胶；快速分散剂型；膜剂；胚珠制剂(ovule)；喷雾剂；和颊/粘膜粘附贴片。
[0258]
在一些实施方案中，药物制剂是肠溶制剂，即适于通过经口施用将本发明的组合物递送到肠道的耐胃制剂(例如，耐胃ph)。当组合物中的细菌或其它组分是酸敏感的，例如在胃条件下易于降解时，肠溶制剂可能特别有用。
[0259]
在一些实施方案中，肠溶制剂包含肠溶衣。在一些实施方案中，制剂是肠溶包衣剂型。例如，该制剂可以是肠溶片剂或肠溶胶囊等。肠溶衣可以是常规的肠溶衣，例如用于经口递送的片剂、胶囊等的常规包衣。制剂可包含膜衣，例如肠溶聚合物，例如酸不溶性聚合物的薄膜层。
[0260]
在一些实施方案中，肠溶制剂本质上是肠溶的，例如，耐胃的，不需要肠溶包衣。因此，在一些实施方案中，制剂是不包含肠溶衣的肠溶制剂。在一些实施方案中，制剂是由热凝胶材料制成的胶囊。在一些实施方案中，热凝胶材料是纤维素材料，例如甲基纤维素、羟甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素(hpmc)。在一些实施方案中，胶囊包含不含任何成膜聚合物的壳。在一些实施方案中，胶囊包含壳并且该壳包含羟丙基甲基纤维素并且不包含任何成膜聚合物(例如参见[38])。在一些实施方案中，制剂是固有肠溶胶囊(例如，来自capsugel的vcaps
tm
)。
[0261]
培养方法
[0262]
可以使用如例如参考文献[39-41]中详述的标准微生物学技术培养用于本发明的细菌菌株。
[0263]
用于培养的固体或液体培养基可以是例如ycfa琼脂或ycfa培养基。ycfa培养基可包括(每100ml，近似值)：酪胨(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、nahco3(0.4g)、半胱氨酸(0.1g)、k2hpo4(0.045g)、kh2po4(0.045g)、nacl(0.09g)、(nh4)2so4(0.09g)、mgso4·
7h2o(0.009g)、cacl2(0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯化血红素(1mg)、生物素(1μg)、钴胺素(1μg)、对氨基苯甲酸(3μg)、叶酸(5μg)和吡哆胺(15μg)。
[0264]
通则
[0265]
除非另外指示，否则将采用本领域技术人员水平内的常规化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学方法来实施本发明。文献中充分说明了这类技术。参见例如参考文献[42-49]等。
[0266]
术语“包含”涵盖“包括”以及“由
……
组成”，例如“包含”x的组合物可以仅仅由x组成，或可以包括其它某物，例如x+y。
[0267]
关于数值x的术语“约”是任选的并且意指例如x
±
10％。
[0268]
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”y的组合物可完全不含y。必要时，本发明的定义中可以省略“基本上”一词。
[0269]“疾病”由对外部或内部因素的病理生理反应引起。“病症”是疾病对身体或身体一部分的正常或常规功能的破坏。“疾患”是一种不正常的健康状态，会干扰日常活动或幸福感。
[0270]
提及两种核苷酸序列之间的序列同一性百分比意指在比对时，比较两种序列中相同的核苷酸百分比。提及两个核苷酸序列之间的序列相似性(也称为序列同源性)百分比测量了两个序列之间的相似程度并证明了不同核苷酸碱基的比对程度。这种比对和同源性或序列同一性百分比可以使用本领域中已知的软件程序，例如参考文献[50]的章节7.7.18中描述的软件程序确定。优选的比对通过smith-waterman同源性搜索算法使用仿射空位搜索(其中开放空位罚分是5或12，最优选是5，且空位延伸罚分是2，blosum 62矩阵)来确定。smith-waterman同源性搜索算法在参考文献[51]中公开。
[0271]
除非特别陈述，否则包括多个步骤的工艺或方法可以在方法开始或结束包括其它步骤，或可以包括其它插入步骤。此外，适当时步骤可以组合，省去或以替代次序进行。
[0272]
本文描述了本发明的多个实施方案。应当理解，每个实施方案中说明的特征都可以与其它所说明的特征组合以提供其它实施方案。具体来说，本文中强调为适合、典型或优选的实施方案可以彼此组合(除非它们相互排斥)。
[0273]
本说明书中引用的所有专利和文献参考资料均通过引用的方式整体并入本文中。
[0274]
对包括向患者施用剂的治疗方法的任何提及，也涵盖用于所述治疗方法中的所述剂，以及所述剂在所述治疗方法中的用途，以及所述剂在制造药剂中的用途。
[0275]
下列实施例仅仅出于说明性目的提供，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
[0276]
本发明的实施方式
[0277]
实施例1-食糖纺锤链杆菌对肠道通透性的影响
[0278]
概述
[0279]
本研究通过16s同源性和maldi-tof分析调查了被鉴定为属于食糖纺锤链杆菌物种的菌株对小鼠回肠和结肠样品的肠道通透性的影响。肠道的过度通透性或
‘
渗漏’与许多
肠道炎性病症有关。
[0280]
材料和方法
[0281]
雄性balb/c小鼠连续6天接受1x 109cfu食糖纺锤链杆菌的口服管饲(200μl体积)。第7天，通过颈脱位法对动物实施安乐死，取出回肠和结肠末端，放入冷冻克氏溶液(chilled krebs solution)中，沿肠系膜线打开并仔细冲洗。然后如前所述(hyland和cox,2005)将制备物放入尤斯室(harvard apparatus,kent,uk；暴露面积为0.12cm2)中，该尤斯室具有充氧(95％o2、5％co2)的克氏缓冲液，维持在37℃下。将4kda fitc-葡聚糖以2.5mg/ml的最终浓度添加到黏膜腔中；在接下来的3小时内，每30分钟从浆膜室收集200μl样品，并测量那些样品中的荧光。
[0282]
结果
[0283]
图1显示了用食糖纺锤链杆菌处理降低结肠的通透性(图1b)。因此，本发明的细菌菌株特别用于改善肠道屏障功能，从而治疗或预防与肠道通透性相关的疾病。
[0284]
实施例2-食糖纺锤链杆菌对犬尿氨酸通路的影响
[0285]
概述
[0286]
本研究调查了食糖纺锤链杆菌对犬尿氨酸通路中的酶和色氨酸分解代谢的影响。吲哚胺2,3双加氧酶-1(ido1)是一种酶，它沿着产生几种生物活性的基于犬尿氨酸的代谢物的通路启动色氨酸分解代谢。色氨酸羟化酶-1(tph-1)催化从l-色氨酸形成5-羟基-l-色氨酸(5-htp)，这是生物合成5-ht的第一步和限速步骤，5-ht是血清素通路中的中间体。
[0287]
材料和方法
[0288]
方法
[0289]
雄性balb/c小鼠连续6天接受1x 109cfu的相关细菌菌株的口服管饲(200μl体积)。第7天，对动物实施安乐死。切除肠组织(1cm的回肠和结肠段)。根据制造商的建议，使用mirvana
tm
mirna分离试剂盒(ambion/llife technologies,paisley,uk)提取总rna并进行dna酶处理(turbo dna-free,ambion/life technologies)。根据制造商的说明，使用nanodrop
tm
分光光度计(thermo fisher scientific inc.,wilmington,delaware,usa)对rna进行定量。根据制造商的程序，使用agilent生物分析仪(agilent,stockport,uk)评估rna质量，并计算rna完整性数(rin)。rin值》7的rna用于后续实验。根据制造商的说明，使用applied biosystems高容量cdna试剂盒(applied biosystems,warrington,uk)将rna逆转录为cdna。简单地说，将multiscribe逆转录酶(50u/μl)作为rt预混液的一部分添加，25℃孵育10分钟，37℃孵育2小时，85℃孵育5分钟并存储在4℃下。使用applied biosystems设计的针对小鼠特异性靶向基因的探针(6羧基荧光素-fam)，同时使用β-肌动蛋白作为内源对照，进行定量pcr。扩增反应含有1μl cdna、5μl 2x pcr预混液(roche)、900nm的每种引物，并通过添加无rna酶的水使总体积达到10μl。所有反应均使用96孔板在480系统上一式三份进行。热循环条件按照制造商(roche)的建议进行55个循环。为了检查扩增子污染，对于每个使用的探针，每次运行均含有无模板对照，一式三份。记录循环阈值(ct)。使用β-肌动蛋白对数据进行归一化，并使用2-δδct方法进行转换，并呈现为与对照组相比的倍数变化。
[0290]
结果
[0291]
与未处理的对照相比，接受食糖纺锤链杆菌的小鼠的结肠中的ido1表达显著更高
free,ambion/life technologies)。根据制造商的说明，使用nanodrop
tm
分光光度计(thermo fisher scientific inc.,wilmington,delaware,usa)对rna进行定量。根据制造商的程序，使用agilent生物分析仪(agilent,stockport,uk)评估rna质量，并计算rna完整性数(rin)。rin值》7的rna用于后续实验。根据制造商的说明，使用applied biosystems高容量cdna试剂盒(applied biosystems,warrington,uk)将rna逆转录为cdna。简单地说，将multiscribe逆转录酶(50u/μl)作为rt预混液的一部分添加，25℃孵育10分钟，37℃孵育2小时，85℃孵育5分钟并存储在4℃下。使用applied biosystems设计的针对小鼠特异性靶向基因的探针(6羧基荧光素-fam)，同时使用β-肌动蛋白作为内源对照，进行定量pcr。扩增反应含有1μl cdna、5μl 2x pcr预混液(roche)、900nm的每种引物，并通过添加无rna酶的水使总体积达到10μl。所有反应均使用96孔板在480系统上一式三份进行。热循环条件按照制造商(roche)的建议进行55个循环。为了检查扩增子污染，对于每个使用的探针，每次运行均含有无模板对照，一式三份。记录循环阈值(ct)。使用β-肌动蛋白对数据进行归一化，并使用2-δδct方法进行转换，并呈现为与对照组相比的倍数变化。
[0306]
结果
[0307]
如图4所示，从测试的基因来看，相对于用媒介物对照处理，在已经用食糖纺锤链杆菌处理的小鼠中观察到杏仁核中bdnf(a)、grin2a(b)和糖皮质激素受体(c)的表达显著增加，以及crfr2(d)和il-6(e)的表达增加的趋势，以及pfc中tlr-4(f)的表达显著增加和bdnf(g)的表达增加的趋势。这表明了来自纺锤链杆菌属的细菌能够调节大脑中蛋白质的表达水平，因此它们可用于治疗或预防cns疾病、病症或疾患，例如自闭症。
[0308]
bdnf是一种神经营养生长因子，已显示可增强神经元分化和存活。因此，来自纺锤链杆菌属的细菌在治疗或预防cns疾病、病症或疾患中增强神经细胞存活的方法中可能特别有用。
[0309]
糖皮质激素具有抗炎、抗增殖、促凋亡和抗血管生成作用。因此，来自纺锤链杆菌属的细菌增加脑中糖皮质激素受体表达的能力表明来自纺锤链杆菌属的细菌可用于治疗，并且特别用于治疗或预防cns疾病、病症或疾患。
[0310]
实施例5-食糖纺锤链杆菌对自闭症谱系障碍模型中行为的影响
[0311]
概述
[0312]
本研究在自闭症谱系障碍的环境动物模型(母体免疫激活模型)和遗传动物模型(btbr小鼠品系)中调查了食糖纺锤链杆菌对许多行为读数(behavioural readout)的影响，包括刻板行为(埋珠)、社交行为(食物偏好的社交转移、雌鼠尿液嗅探测试、3室社交互动测试)和抑郁/急性应激(强迫游泳测试)。
[0313]
选择btbr小鼠是因为它代表了具有潜在遗传成分的自闭症的特发性模型。这些小鼠表现出严重的自闭症样行为，社交能力和社会认知存在缺陷，焦虑和刻板行为加剧，如增加梳理毛发。除了行为特征外，btbr小鼠还表现出大肠和小肠的通透性增加、肠动力延长和肠道血清素产生减少，这共同表明了胃肠系统功能障碍[52]。btbr小鼠模型使用近亲繁殖的转基因小鼠，这些小鼠表现出强大的自闭症样表型。已经报告了该菌株中存在社交行为缺陷、重复行为增加和焦虑相关行为增加[53]。由于这种强大的行为表型，btbr小鼠是评估新型治疗剂治疗自闭症相关行为的功效的理想动物模型。活细菌菌株对这类症状的缓解也可以指示该细菌菌株在治疗其它精神或神经疾病中的功效。
[0314]
mia小鼠模型在妊娠小鼠中使用环境免疫挑战来触发后代自闭症谱系障碍的核心症状。mia小鼠通常表现出刻板行为(如梳理毛发和埋珠测试所示)和社会交流缺陷(如社交游戏、3室社交互动和食物偏好的社交转移测试所示)。后代表现出自闭症的三个核心症状(交流减少；社交能力降低；以及重复或刻板行为增加)，因此提供了一个合适的模型来确定施用治疗剂是否可以减轻与自闭症谱系障碍相关并且实际上许多其它神经病症中的行为表型。众所周知，动物模型中行为表型的改变表明潜在的临床相关干预，无论对潜在生物学或生理机制的理解如何[54]。
[0315]
总的来说，btbr和mia代表了可能引起它们的自闭症表型的微生物群-肠-脑轴失调的适当模型。
[0316]
材料和方法
[0317]
btbr小鼠模型
[0318]
btbr动物在室内饲养，兄弟姐妹交配。来自这些动物的雄性后代在3周龄时与它们的母亲分开，并且在8周龄时开始每天施用食糖纺锤链杆菌或对照。行为开始于11周龄。包括一个年龄匹配的对照c57/bl6组作为参考对照组。
[0319]
mia小鼠模型
[0320]
雌性c57/bl6小鼠(8周龄)和年龄匹配的雄性小鼠购自harlan uk。适应1周后，这些动物进行交配。在胚胎第12.5天，雌性接受病毒模拟物聚肌胞(poly-ic)的注射以激活母体免疫系统，或接受盐水媒介物的注射。来自这些动物的雄性后代在3周龄时与它们的母亲分开，并且在8周龄时开始每天施用活的生物治疗剂或对照。行为开始于11周龄。
[0321]
埋珠
[0322]
将小鼠单独放置在一个新颖的宝克力(plexiglas)笼子(35
×
28
×
18.5cm，l
×w×
h)中，里面装满锯末(5-10cm)，上面是20个弹珠(五排，或弹珠规则间隔，离墙壁2cm，相距2cm)。三十分钟后，统计表面埋藏超过2/3的弹珠数量。埋藏的弹珠数量越多，代表刻板行为的状态加剧或焦虑水平越高(新事物恐惧症)。
[0323]
社交行为
[0324]
社交测试设备是一个长方形的三室盒子。每个室长20cm l
×
40cm w
×
22cm h。隔离墙由小的圆孔(直径5cm)制成，允许进入每个室。将两个相同的杯状铁丝笼以双边对称的位置放置在每个侧室内，所述笼的底部直径为10cm，高度为13cm，条间距为1.2cm，允许在条之间进行鼻子接触，但防止打架。该测试分为三个阶段，每个阶段10分钟：1)适应；2)小鼠与物体；3)新的小鼠与熟悉的小鼠。使用天花板摄像机对实验进行录像，以使用ethovision软件(3.1版，noldus；tracksys,nottingham,uk)进行进一步的参数分析。在第一阶段，将测试小鼠放入中间室中，并允许探索整个盒子，里面有空的小铁丝笼，进行10分钟的适应期。适应期后，将测试小鼠从测试箱中取出一小段时间，同时将一个物体放置在一个侧室中，并将不熟悉的同种雄性小鼠(未与测试对象事先接触过)放在另一侧室中，两者都封闭在杯状铁丝笼里。在第二阶段，将测试小鼠放入中间室中，并允许探索整个盒子10分钟。评估每个室中探索物体或小鼠所花费的时间以及进入每个室的次数。左侧室和右侧室中不熟悉的小鼠的位置在试验之间系统地交替。一次进入被定义为所有四个爪子均在一个室中。在第三阶段，一个物体替换为一只不熟悉的小鼠，作为新的小鼠，而在另一室里，第二阶段使用的小鼠保持不变，现在用作熟悉的小鼠。每次试验后，用10％乙醇清洁所有腔室和杯状铁丝笼，
干燥并通风几分钟，以防止嗅觉暗示偏差并确保适当消毒。在适应整个活动场所的最初10分钟内，证实了缺乏先天的侧面偏好。对照动物自然对同种小鼠比对无生命物体更感兴趣(社交性)。同样，对照动物与一只新的不熟悉的小鼠互动的时间比它们已经与之互动过的小鼠要多。此处使用的一些动物模型在这种社交范式中存在缺陷。
[0325]
强迫游泳
[0326]
将小鼠单独放置在一个透明的玻璃圆筒(直径24
×
21cm)中，其中含有15cm深的水(25
±
0.5℃)。每只动物之间换水。测试持续6分钟，并使用数字三脚架固定相机对实验进行录像；使用视频(视频媒体播放器软件)进一步对数据进行两次评分，并由不了解条件的实验人员求平均值。对静止的潜伏期进行评分。在测试的最后4分钟测量静止的时间，静止被定义为除了轻微的动作以保持头部在水面上外完全没有运动。静止的增加意味着当动物屈服于其处境(习得性无助)时抑郁样行为的增加。
[0327]
方法
[0328]
动物每天接受pbs或在pbs中制备至109cfu/ml的食糖纺锤链杆菌的口服管饲。在整个行为范式中每天持续给药。
[0329]
结果
[0330]
如图5a所示，与媒介物对照相比，用食糖纺锤链杆菌处理的btbr小鼠表现出显著降低的刻板相关行为。用细菌处理引起刻板相关行为(即埋藏的弹珠数量)与没有疾病症状的对照小鼠相当。
[0331]
图6显示，在mia模型中，用食糖纺锤链杆菌处理引起更多的社交行为，因为mia小鼠在动物室中花费的时间明显多于在非社交刺激室中(图6e)。在btbr和mia模型中，小鼠在新动物室中花费的时间明显多于熟悉动物室(图6d和f)。这些数据表明，用食糖纺锤链杆菌处理后表现出的社交行为与非疾病对照小鼠相当。
[0332]
用食糖纺锤链杆菌处理对抑郁样行为也产生积极影响。如图7所示，btbr和mia小鼠在强迫游泳测试中的静止时间都明显减少。
[0333]
总之，在btbr和mia小鼠模型中，食糖纺锤链杆菌显示有效地治疗刻板、社交行为和抑郁样行为。在自闭症小鼠模型中逆转行为和生物表型的疗法有望对人类疾病有效。
[0334]
ema关于治疗自闭症谱系障碍药品临床开发的指南指出，由于疾病的异质性，单一化合物可能无法对所有核心症状产生显著效果，因此必须在至少一种核心症状上显示出短期疗效。食糖纺锤链杆菌已显示出对自闭症谱系障碍的至少一种核心症状的有效治疗，因此有望对人类疾病有效。同样，其它中枢神经系统病症或疾患表现出具有多种不同症状的复杂病理学，并且几乎没有获得批准的治疗方法。因此，应当理解，有效的治疗不需要治疗中枢神经系统疾病或病症的所有症状。如果治疗可治疗与中枢神经系统疾病或病症相关的症状之一，则认为其在治疗上是有用的。
[0335]
总之，这些结果表明来自纺锤链杆菌属的细菌可用于治疗或预防自闭症谱系障碍。
[0336]
实施例6-食糖纺锤链杆菌对自闭症谱系障碍模型中肠动力和胃肠道通透性的影响
[0337]
概述
[0338]
本研究调查了食糖纺锤链杆菌对mia和btbr自闭症谱模型中肠动力和通透性的影
响。
[0339]
材料和方法
[0340]
小鼠模型
[0341]
btbr和mia模型的产生和维持如实施例6中所述。
[0342]
评估肠动力的方法
[0343]
该程序涉及口服给定量的无毒有色标记(胭脂红(carmin red))以确定肠动力。将第一次有色便团排出的时间记录为
‘
全肠转运时间’，并用作全肠蠕动运动的指标。测定前将小鼠单独圈养3小时，以适应新笼。胭脂红染料(每只小鼠100-200μl含0.5％甲基纤维素额6％胭脂红)通过管饲法经口给药。每10分钟目视检查每个笼。记录第一次有色便团(红色)的时间。在第一次有色便团出现后，小鼠恢复到正常的圈养条件。
[0344]
评估胃肠道通透性的方法
[0345]
该方法如实施例1中所述进行。
[0346]
结果
[0347]
如图8所示，食糖纺锤链杆菌能够降低btbr和mia模型中的肠动力。用食糖纺锤链杆菌处理还引起回肠和结肠的通透性降低(图9)。这些结果表明，食糖纺锤链杆菌可以逆转mia模型中观察到的肠动力延长和胃肠道通透性增加(这与胃肠系统功能障碍有关)。因此，不希望受任何特定理论的束缚，食糖纺锤链杆菌可通过纠正胃肠系统功能障碍而特别有效地治疗自闭症谱系障碍。
[0348]
数据表明，来自纺锤链杆菌属的细菌可用于治疗或预防自闭症谱系障碍，特别是治疗或预防与自闭症谱系障碍相关的胃肠功能障碍。
[0349]
序列
[0350]
seq id no:1-16s核糖体rna的食糖纺锤链杆菌基因，部分序列，菌株：ht03-11(ab698910)
[0351]
[0352][0353]
seq id no:2-16s核糖体rna的食糖纺锤链杆菌基因，部分序列，菌株：ko-38
[0354]
[0355][0356]
seq id no:3-16s核糖体rna的食糖纺锤链杆菌基因，部分序列，菌株：tt-111
[0357]
[0358][0359]
seq id no:4-以登记号ncimb 43527保藏的菌株的16s核糖体rna
[0360]
[0361][0362]
实施方案
[0363]
1.一种组合物，其包含活的纺锤链杆菌属细菌菌株，所述组合物用于疗法中。
[0364]
2.一种组合物，其包含纺锤链杆菌属细菌菌株，所述组合物用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症的方法中：中枢神经系统疾病、病症或疾患，肠道屏障功能受损，与肠道通透性增加相关的疾病，炎性疾病，代谢疾病和心血管疾病。
[0365]
3.一种组合物，其包含具有与seq id no:1、2、3或4具有至少95％序列相似性的16s rrna序列的细菌菌株，所述组合物用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病症的方法中：中枢神经系统疾病、病症或疾患，肠道屏障功能受损，以肠道通透性增加为特征的疾病，炎性疾病，代谢疾病或心血管疾病。
[0366]
4.根据实施方案3的组合物，其中所述细菌菌株具有与seq id no:1、2、3或4至少96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相似的16s rrna序列。
[0367]
5.根据实施方案2至4中任一项的组合物，其中所述细菌菌株是活的。
[0368]
6.根据前述实施方案中的任一项使用的组合物，其中所述组合物用于治疗被鉴定为肠道屏障功能受损的患者。
[0369]
7.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述中枢神经系统疾病或病症由微生物群-肠-脑轴介导。
[0370]
8.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述组合物用于调节微生物群-肠-脑轴的方法中。
[0371]
9.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防神经退行性疾病、神经发育障碍或神经精神疾患的方法中。
[0372]
10.根据实施方案9使用的组合物，其中所述神经发育障碍或神经精神疾患选自由以下组成的组：自闭症谱系障碍(asd)；儿童发育障碍；强迫症(ocd)；重性抑郁障碍；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；精神分裂症谱系障碍；精神分裂症；双相障碍；精神病；心境障碍；慢性疼痛；格林-巴利综合征和脑膜炎，包括路易体、血管性和额颞叶痴呆在内的痴呆；原发性进行性失语；轻度认知障碍；hiv相关的认知障碍和皮质基底节变性。
[0373]
11.一种组合物，其包含纺锤链杆菌属细菌菌株，所述组合物用于治疗或预防自闭症谱系障碍的方法中。
[0374]
12.根据实施方案11使用的组合物，其中所述组合物用于减少或预防自闭症的方法中。
[0375]
13.根据实施方案12使用的组合物，其中所述组合物预防、减少或减轻刻板、重复、
强迫和/或焦虑的行为。
[0376]
14.根据实施方案1-9使用的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防神经退行性疾病的方法中。
[0377]
15.根据实施方案14使用的组合物，其中所述神经退行性疾病选自由以下组成的组：帕金森病，包括进行性核上性麻痹、进行性核上性麻痹、斯-里-奥三氏综合征、正常压力脑积水、血管性或动脉硬化性帕金森综合征和药源性帕金森综合征；阿尔茨海默病，包括本森综合征；多发性硬化；亨廷顿病；肌萎缩侧索硬化；卢伽雷病；运动炎症性神经元疾病；朊病毒病；脊髓小脑性共济失调或脊髓性肌萎缩。
[0378]
16.根据实施方案1-9使用的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防炎性疾病的方法中。
[0379]
17.根据实施方案16使用的组合物，其中所述炎性疾病是炎性肠病、败血症和急性肺损伤。
[0380]
18.根据实施方案1-9使用的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防代谢疾病的方法中。
[0381]
19.根据实施方案1-9使用的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防心血管疾病的方法中。
[0382]
20.根据实施方案19使用的组合物，其中所述心血管疾病是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉疾病、心绞痛和心肌梗塞、心律失常、心力衰竭、瓣膜性心脏病、心包疾病、中风、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、先天性心脏病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、血栓栓塞性疾病或静脉血栓形成。
[0383]
21.根据实施方案1-9使用的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防与肠道通透性增加相关的疾病的方法中。
[0384]
22.根据实施方案21使用的组合物，其中所述与肠道通透性增加相关的疾病是胃溃疡、感染性腹泻、肠易激综合征、功能性胃肠道疾病、炎性肠病、乳糜泻和癌症(食道、结肠直肠)、食物过敏、急性炎症(败血症、全身炎症反应综合征(sirs)、多器官衰竭)、肥胖、代谢疾病(例如nafld和nash、2型糖尿病或心血管疾病)和慢性炎症(例如关节炎)。
[0385]
23.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述组合物不用于治疗或预防艰难梭菌感染。
[0386]
24.根据实施方案1-23使用的组合物，其中所述细菌菌株具有与细菌物种食糖纺锤链杆菌的16s rrna序列至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rrna序列。
[0387]
25.根据实施方案1-23中任一项使用的组合物，其中所述细菌菌株具有与seq id no:1、2、3或4至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rrna序列。
[0388]
26.根据实施方案1-25使用的组合物，其中所述细菌菌株是食糖纺锤链杆菌物种。
[0389]
27.任一前述实施方案的组合物，其中所述组合物用于经口施用。
[0390]
28.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
[0391]
29.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述细菌菌株是有活力的。
[0392]
30.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述细菌菌株被冻干。
[0393]
31.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述细菌菌株能够部分或全部定殖于肠道。
[0394]
32.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述组合物包含纺锤链杆菌属单一物种。
[0395]
33.根据任一前述实施方案使用的组合物，其中所述组合物包含纺锤链杆菌属单一菌株。
[0396]
34.根据实施方案1-32使用的组合物，其包含所述纺锤链杆菌属细菌菌株作为微生物菌群的一部分。
[0397]
35.一种食品，其包含任一前述实施方案的组合物，所述食品用于任一前述实施方案的用途。
[0398]
36.一种疫苗组合物，其包含任一前述实施方案的组合物，所述疫苗组合物用于任一前述实施方案的用途。
[0399]
37.一种治疗或预防疾病的方法，其包括向有需要的患者施用包含活的纺锤链杆菌属细菌菌株的组合物。
[0400]
38.活的纺锤链杆菌属细菌菌株在制造用于预防或治疗疾病的药物中的用途。
[0401]
39.一种治疗或预防中枢神经系统疾病、与肠道通透性增加相关的疾病、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病的方法，其包括向有需要的患者施用包含活的纺锤链杆菌属细菌菌株的组合物。
[0402]
40.纺锤链杆菌属细菌菌株在制造用于预防或治疗中枢神经系统疾病、与肠道通透性增加相关的疾病、炎性疾病、代谢疾病或心血管疾病的药物中的用途。
[0403]
41.实施方案40的用途，其中所述细菌菌株是活的。
[0404]
42.一种治疗或预防自闭症的方法，其包括向有需要的患者施用包含纺锤链杆菌属细菌菌株的组合物。
[0405]
43.纺锤链杆菌属细菌菌株在制造用于预防或治疗自闭症的药物中的用途。
[0406]
44.一种组合物，其包含实施方案43中任一项的细胞，所述组合物用于实施方案1-34中任一项的用途。
[0407]
45.实施方案44的组合物，其包含药学上可接受的载体或赋形剂。
[0408]
46.一种以登记号ncimb 43527保藏的食糖纺锤链杆菌菌株或其衍生物的细胞。
[0409]
47.一种组合物，其包含实施方案46的细胞。
[0410]
48.实施方案47的组合物，其包含药学上可接受的载体或赋形剂。
[0411]
49.实施方案46的细胞或实施方案47或48的组合物，用于实施方案1-34中任一项的用途。
[0412]
参考文献
[0413]
[1]spor et al.(2011)nat rev microbiol.9(4)：279-90.
[0414]
[2]eckburg et al.(2005)science.10：308(5728)：1635-8.
[0415]
[3]tap et al.(2009)，environ microbiol，11(10)：2574-84.
[0416]
[4]macpherson et al.(2001)microbes infect.3(12)：1021-35
[0417]
[5]macpherson et al.(2002)cell mol life sci.59(12)：2088-96.
c.hunter-cevera，academic press
[0453]
[41]strobel(2009)methods mol biol.581：247-61.
[0454]
[42]gennaro(2000)remington：the science and practice of pharmacy.20th edition，isbn：0683306472.
[0455]
[43]molecular biology techniques：an intensive laboratory course，(ream et al.，eds.，1998，academic press).
[0456]
[44]methods in enzymology(s.colowick and n.kaplan，eds.，academic press，inc.)
[0457]
[45]handbook of experimental immunology，vols.i-iv(d.m.weir and c.c.blackwell.eds，1986.blackwell scientific publications)
[0458]
[46]sambrook et al.(2001)molecular cloning：a laboratory manual，3rd edition(cold spring harbor laboratory press).
[0459]
[47]handbook of surface and colloidal chemistry(birdi，k.s.ed.，crc press，1997)
[0460]
[48]ausubel et al.(eds)(2002)short protocols in molecular biology，5th edition(current protocols).
[0461]
[49]pcr(introduction to biotechniques series)，2nd ed.(newton&graham eds.，1997，springer verlag)
[0462]
[50]current protocols in molecular biology(f.m.ausubel et al.，eds.，1987)supplement 30
[0463]
[51]smith&waterman(1981)adv.appl.math.2：482-489.
[0464]
[52]golubeva et al(2017)ebiomedicine，24，166-178
[0465]
[53]meyza and blanchard(2017)neurosci biobehav rev 76(pt a)：99-110.
[0466]
[54]crawley(2012)dialogues in clinical neuroscience-vol 14，no.3。