包含牛乳外泌体的用于增强皮肤弹性及改善皱纹的组合物

1.本发明涉及包含牛乳外泌体的用于增强皮肤弹性和/或改善皱纹的组合物、通过给药牛乳外泌体来治疗皱纹的方法。


背景技术：

2.皮肤为覆盖身体外部的一层膜，执行保护身体免受各种外部刺激、障碍、干燥等的环境因素的影响的各种生理功能，从而起到保护调节内部器官和除此之外的体内器官的作用。
3.但是，皮肤随着年龄的增加，身体的生理功能降低而减少调节新陈代谢的各种激素的分泌，使得免疫细胞的功能和细胞活性降低。并且，由于反复暴露在光或热，改变皮肤的外观或功能，由此，皮肤中的胶原蛋白合成减少且丢失水分，在减少皮肤弹性的同时促进皮肤的老化现象，从而损伤皮肤。皮肤老化的代表性现象之一为生成皱纹(wrinkles)。
4.为了防止这种皮肤老化及损伤来保持更健康且美丽的皮肤，通过将从各种动物、植物、微生物等获得的具有生理活性的物质添加至化妆品来使用，从而保持皮肤的原有功能，并激活皮肤细胞来促进皮肤新陈代谢，并努力保持皮肤健康，由此研发了化妆品、皮肤外用剂等。
5.但是，当将这些物质适用于皮肤时，由于刺激、红斑、发红等的安全性问题，其使用量受限或者效果微乎其微，从而难以实质上期待皮肤功能改善效果。
6.由此，需要研究及研发增强皮肤弹性和/或改善皱纹的效果优秀的物质。


技术实现要素：

7.技术问题
8.本发明的目的在于，提供一种用于增强皮肤弹性和/或改善皱纹的组合物，其包含牛乳外泌体。
9.本发明的再一目的在于，提供一种用于增强皮肤弹性和/或改善皱纹的化妆品组合物，其包含牛乳外泌体。
10.本发明的另一目的在于，提供一种用于增强皮肤弹性和/或改善皱纹的食品组合物，其包含牛乳外泌体。
11.本发明的还有一目的在于，提供一种用于皮肤弹性和/或预防或治疗皱纹的药物组合物，其包含牛乳外泌体。
12.本发明的又一目的在于，提供一种皱纹的治疗方法，其包括向个体给药牛乳外泌体的步骤。
13.技术方案
14.用于实现如上所述的目的的本发明的一方面涉及一种用于增强皮肤弹性及改善皱纹的组合物，其包含牛乳外泌体。
15.本发明中，“牛乳外泌体”是指源自牛乳的脂质双层的囊泡。上述外泌体包含源自
牛乳的特有蛋白质及核酸等，是大小为30nm～200nm的生物纳米颗粒，在内部包含由dna、rna、肽等组成的信息。外泌体从体液内分解酶等安全地运输内部的物质来向相邻细胞或远处的细胞传递信息，从而影响细胞周围的微环境。尤其，具有如下的优点：源自牛乳的牛乳外泌体不仅可作为食品使用，而且可提取大量的外泌体，并长时间稳定保存。
16.另外，现有的外泌体主要用作生物标志物或载体，但最近发现，除了母乳，广泛用于制备各种乳制品的牛乳外泌体中存在各种小分子rna(small rna)，上述遗传物质参与免疫功能或破骨细胞生成过程，从而对骨质疏松的治疗及改善有用(mizoguchi et al.,2010)。因此，本发明人对牛乳外泌体进行研究，首次阐明上述牛乳外泌体参与调节关于增强皮肤弹性及改善皱纹的基因表达、合成胶原蛋白及抑制胶原酶和弹性蛋白酶活性等。
17.因此，在本发明中，对来源于牛的牛乳进行离心分离来获得了外泌体，并将上述牛乳外泌体用作用于增强皮肤弹性及改善皱纹的用途。具体地，上述外泌体可以来源于牛。
18.在本发明中，“皮肤弹性增强”是指改善因皮肤老化而降低皮肤弹性而产生的皱纹。即，在皮肤弹性降低的情况下，由于皮肤内的胶原蛋白纤维减少及改性而重复折叠并展开表皮下方的肌肉的运动，由此，产生皮肤皱纹。从而，通过改善降低的皮肤弹性来防止及抑制皱纹的生成。
19.在本发明中，“皮肤皱纹”是指皮肤衰老而产生的细纹，可通过由基因引起的原因、皮肤真皮中存在的胶原蛋白和弹性蛋白的减少、外部环境等而诱发。因此，上述“改善皮肤皱纹”是指抑制或控制在皮肤中生成皱纹或者缓解已生成的皱纹。
20.在本发明的一实施例中，确认皮肤弹性和/或皱纹相关基因的表达特性的结果，减少基质金属蛋白酶-1基因的表达量，另外，timp1、前胶原蛋白(procollagen)、cd34、弹性蛋白(elastin)的基因表达量均增加(图4)。如上所述的结果教示，牛乳外泌体调节增强皮肤弹性及皱纹相关基因的表达，从而可用作用于增强皮肤弹性及改善皱纹的组合物。
21.上述牛乳外泌体可抑制弹性蛋白酶活性及胶原酶活性。
22.上述弹性蛋白酶为参与作为在真皮内保持皮肤弹性的基质蛋白的弹性蛋白的分解而在分解体内的弹性蛋白的白细胞粒化酶之一。在上述酶的活性增加的情况下，成为破坏皮肤组织的直接原因，因此，弹性蛋白酶以成为皮肤的皱纹及弹力降低的原因而周知。在本发明的一实施例中，确认在处理上述牛乳外泌体的情况下，显著抑制弹性蛋白酶的活性(图6)。
23.上述胶原酶为分解胶原蛋白的酶之一，还以分解i型胶原蛋白的基质金属蛋白酶-i(matrix metalloproteinase i，mmp-1)而周知。在本发明的一实施例中，通过处理上述牛乳外泌体来测量胶原酶的抑制活性的结果，确认与牛乳外泌体未处理组相比，显著抑制胶原酶活性(图7)。
24.因此，确认牛乳外泌体控制或抑制作为对于皮肤弹性的降低及皱纹生成的直接原因而周知的弹性蛋白酶及胶原酶的活性，从而可用作增强皮肤弹性及改善皱纹的用途。
25.并且，具体地，上述组合物还可包括老化改善用途。
26.在本发明中，“老化”分为内因性老化和外因性老化，内因性老化为随着时间的推移而使身体功能降低引起的自然现象，外因性老化不仅包括阳光引起的光老化，还包括因吸烟、饮酒、压力等因素引起的老化。
27.上述老化具体可以为光老化。
28.上述光老化因紫外线影响皮肤细胞内信号传导系统而损伤dna及改变基因表达，从而因细胞老化及细胞凋亡而诱发。在皮肤细胞持续暴露在紫外线的情况下，真皮层的成纤维细胞中的活性氧增加，减少作为细胞因子的转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，tgf-β)的表达，激活激活蛋白-1(activator protein 1，ap-1)的表达，从而诱发老化。
29.例如，转化生长因子-β为促进胶原蛋白的合成的细胞因子，在转化生长因子-β的表达因紫外线减少的情况下，抑制胶原蛋白的合成，相反，激活蛋白-1通过调节基质金属蛋白酶来促进胶原蛋白的分解，从而促进胶原蛋白的分解。
30.在本发明的一实施例中，确认牛乳外泌体增加因老化而抑制的胶原蛋白的生物合成量(图5)，可通过抑制胶原酶及弹性蛋白酶的活性来防止胶原蛋白的分解(图7)。
31.在本发明的一实施例中，在通过处理紫外线uvb来诱发光老化后处理牛乳外泌体的结果，确认与未处理牛乳外泌体的对照组相比，胶原蛋白纤维量几乎没有减少，纤维密度稠密且排列规则(图8)。
32.如上所述的结果教示，牛乳外泌体不仅对于随着身体功能的降低而因皮肤弹性降低诱发的老化具有优秀的效果，还对于防止及改善紫外线引起的外因性老化也具有优秀的效果。
33.本发明的再一目的涉及一种用于增强皮肤弹性及改善皱纹的化妆品组合物，其包含牛乳外泌体。
34.关于上述“牛乳外泌体”、“增强皮肤弹性”及“改善皱纹”的说明如前所述。
35.具体地，上述牛乳外泌体可以来源于牛。
36.在本发明的一实施例中，将来源于牛的牛乳外泌体处理在人真皮成纤维细胞的结果，确认了几乎没有细胞毒性(图3)，可将牛乳外泌体用于化妆品组合物。
37.在本发明的一实施例中，确认牛乳外泌体调节皮肤弹性及皱纹相关基因的表达(图4)，增加胶原蛋白的合成量(图5)，尤其，对于弹性蛋白酶及胶原酶活性抑制具有优秀的效果(图6及图7)，确认可用作用于增强皮肤弹性及改善皱纹的化妆品组合物。
38.并且，具体地，上述化妆品组合物还可还包括老化改善用途。具体地，上述老化可以为光老化。
39.在本发明的一实施例中，确认即使用紫外线uvb处理，牛乳外泌体的胶原蛋白几乎没有减少，纤维密度稠密且排列规则(图8)，通过上述结果确认可将牛乳外泌体用作用于改善紫外线引起的老化的化妆品组合物。
40.本发明的化妆品组合物可制备为选自由溶液、外用软膏、霜剂、泡沫剂、滋养化妆水、柔肤化妆水、面膜、柔肤水、乳液剂、妆前乳、精华、香皂、液体洗涤剂、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳状液、糊剂、凝胶剂、乳液、散粉、香皂、含表面活性剂的清洁剂、油剂、粉末状粉底液、乳状粉底液、蜡粉底液、贴剂及喷雾剂组成的组中的剂型，但并不局限于此。
41.本发明的上述化妆品组合物还可包含一种以上的配合在通常的皮肤化妆品的化妆品学上可接受的载体，作为通常的成分，例如可适当配合油分、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、色素、防腐剂、香料等，但并不局限于此。
42.包含在本发明的化妆品组合物的化妆品学上可接受的载体根据化妆品组合物的剂型不同。
43.本发明的剂型为软膏、糊剂、霜剂或凝胶剂的情况下，可利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等作为载体成分，但并不局限于此。这些可单独使用或混合两种以上来使用。
44.在本发明的剂型为粉末或喷雾剂的情况下，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉等作为载体成分，尤其，在喷雾剂的情况下，还可包含如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂，但并不局限于此。这些可单独使用或混合两种以上来使用。
45.在本发明的剂型为溶液或乳状液的情况下，可利用溶剂、溶解剂或乳化剂等作为载体成分，例如，可利用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油等作为载体成分，尤其，可利用棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，但并不局限于此。这些可单独使用或混合两种以上来使用。
46.在本发明的剂型为悬浮液的情况下，可利用水、乙醇或丙二醇的液相稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等作为载体成分，但并不局限于此。这些可单独使用或混合两种以上来使用。
47.并且，本发明的组合物能够以直接涂敷或喷在皮肤等的透皮给药方法使用，本发明的组合物的给药途径可通过能够到达目标组织的任何通常的途径给药。
48.本发明的组合物的使用量可根据年龄、病变程度等的个人差异或剂型等适当调节，能够以一天一次或数次，向皮肤涂敷适当量来使用一周至数个月。
49.本发明的另一方面涉及一种用于增强皮肤弹性及改善皱纹的食品组合物，其包含牛乳外泌体。
50.关于上述“牛乳外泌体”、“增强皮肤弹性”及“改善皱纹”的说明如前所述。
51.上述食品的种类没有特别限制。可添加本发明的牛乳外泌体的食品有香肠、肉、面包、巧克力、零食、糖果、糖果糕点、拉面、比萨、其他面条、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、各种汤、饮料、茶、保健饮料、酒精饮料、维生素复合物等。在剂型化为饮料的情况下，除了本发明的牛乳外泌体外，所添加的液体成分虽并不限定于此，如通常的饮料可包含各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。上述的天然碳水化合物可以为单糖(例如，葡萄糖、果糖等)、二糖(例如，麦芽糖、蔗糖等)及多糖(例如，常规糖如糊精、环糊精等)以及糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。
52.上述食品的种类具体可以为保健功能食品。更具体地，可以为用于增强皮肤弹性及改善皱纹的保健功能食品。
53.上述保健功能食品可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂、天然调味剂等)、着色剂和增强剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。此外，本发明的保健功能食品可包含果肉以用于制备基于水果和蔬菜饮料。这些成分可以单独使用或组合使用，通常，相对于组合物的总重量，这种添加剂的比例可在0.001重量份至50重量份的范围内选择。
54.上述保健功能食品为强调食品的身体调节功能的食品，为通过物理、生物化学或生物工程方法而赋予附加价值以出于特定目的而工作和表达的食品。这种保健功能食品的
成分经过设计和加工，以在体内充分发挥身体的调节功能，如保护生物体、调节身体节律、预防疾病和从疾病中恢复，并且可以包含作为食品可接受的食品补充添加剂、甜味剂或功能性原料。
55.在将本发明的牛乳外泌体用作保健功能食品(或保健功能饮料添加物)的情况下，直接添加上述牛乳外泌体或者与其他食品或食品成分一同使用，可根据常规方法适当使用。上述牛乳外泌体的混合量可根据其使用目的(预防、保健或改善、治疗处置)适当确定。
56.本发明的还有一方面涉及一种用于增强皮肤弹性及预防或治疗皱纹的药物组合物，其包含牛乳外泌体。
57.在本发明中，“改善皮肤弹性”是指改善因皮肤老化降低皮肤弹性而产生的皱纹。即，在皮肤弹性降低的情况下，由于皮肤内的胶原蛋白纤维的减少及改性而重复折叠并展开表皮下方的肌肉的运动，由此产生皮肤皱纹。从而，通过改善降低的皮肤弹性来防止及抑制皱纹的生成。
58.在本发明中，“改善皮肤皱纹”是指抑制或控制在皮肤生成的皱纹，或者缓解已生成的皱纹。
59.具体地，上述牛乳外泌体可来源于牛。
60.在本发明的一实施例中，确认牛乳外泌体对于真皮成纤维细胞几乎没有细胞毒性(图3)。
61.在本发明的一实施例中，确认牛乳外泌体调节弹性降低及皱纹生成和/或抑制相关基因的表达(图4)，促进胶原蛋白的合成(图5)，尤其，直接确认抑制弹性蛋白酶及胶原酶的活性(图6及图7)。
62.并且，具体地，上述组合物还可包括老化的预防或治疗用途。
63.在本发明的一实施例中，在处理紫外线uvb来诱发光老化后处理牛乳外泌体的结果，确认与牛乳外泌体未处理组相比，胶原蛋白的纤维量几乎没有减少，纤维密度稠密且排列规则(图8)。
64.从如上所述的结果可知，包含本发明的牛乳外泌体的药物组合物抑制妨碍胶原蛋白的合成的基因表达及酶活性，同时，诱导胶原蛋白的合成，从而可用作用于增强皮肤弹性及改善皱纹的预防或治疗用途，进而，还可用作用于预防或治疗紫外线等引起的老化的用途。
65.为了给药，除了上述本发明的牛乳外泌体之外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。上述载体、赋形剂及稀释剂可例举乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
66.并且，本发明的药物组合物能够以任何剂型应用，更具体地，可以为用于肠胃外给药的剂型。用于肠胃外给药的剂型可以为注射用、涂敷用、气溶胶等的喷雾型。更具体地，可以为注射剂形式。
67.用于肠胃外给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳液、冷冻干燥制剂或栓剂。作为非水溶剂和悬浮剂，可使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射酯等。
68.本发明的又一方面涉及一种增强皮肤弹性及皱纹治疗方法，其包括以药学有效量向需要治疗的个体给药包含牛乳外泌体的药物组合物的步骤。关于“皮肤弹性”及“皱纹”的说明如前所述。具体地，可以涉及通过给药包含牛乳外泌体的药物组合物来治疗皱纹的方法。
69.并且，上述治疗方法还可包括老化治疗。“老化”如前所述。
70.在本发明中，“药学有效量”是指以可使用于医疗的合理利益/风险比率足以治疗疾病的量，有效量水平可根据患者的性别、年龄、疾病的种类、疾病的严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗持续时间、一同使用的药物以及医学领域已知的其他因素来确定。
71.可将本发明的药物组合物作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂联合给药，可与现有的治疗剂按序给药或同时给药。并且，可将本发明的药物组合物单次给药或多次给药。考虑到所有因素，重要的是，以能够以最小的量获得最大效果而没有副作用的量给药，普通技术人员可容易确定其量。
72.本发明的术语“个体”为患有可通过给药本发明的药物组合物来缓解症状的皮肤色素沉淀疾病的动物或人。可通过将本发明的用于治疗的组合物给药至个体来有效预防及治疗皮肤色素沉淀疾病。
73.本发明的术语“给药”是指通过任何适当的方法将规定物质提供给人或动物，对于本发明的用于治疗的组合物的给药途径，只要可到达目标组织，可通过任何常规途径口服给药或肠胃外给药。并且，本发明的用于治疗的组合物可通过可使有效成分移动至靶细胞的任何装置给药。
74.本发明的药物组合物的优选给药量根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形式、给药途径及给药持续时间不同，可被普通技术人员适当选择。
75.技术效果
76.本发明的包含牛乳外泌体的组合物没有毒性，具有优秀的生物相容性，弹性蛋白酶及胶原酶活性抑制及胶原蛋白合成效果优秀，因此，可作为用于增强皮肤弹性及改善皱纹的组合物用于各种领域。
77.本发明的效果并不限定于上述的效果，应理解为包括可从本发明的详细说明或发明要求保护范围中记载的发明的结构推论的所有效果。
附图说明
78.图1为确认牛乳外泌体的大小及外泌体标志物的结果。
79.图2为利用电子显微镜确认牛乳外泌体的形状及大小的结果。
80.图3为通过细胞存活率确认牛乳外泌体是否具有毒性的结果。
81.图4示出牛乳外泌体的参与皮肤弹性及皱纹生成/抑制的基因的mrna表达量。
82.图5为测量牛乳外泌体的胶原蛋白的生成量的结果。
83.图6为通过将牛乳外泌体处理在人真皮成纤维细胞来测量弹性蛋白酶抑制活性的结果。
84.图7为通过将牛乳外泌体处理在人真皮成纤维细胞来测量胶原酶抑制活性的结果。
85.图8示出牛乳外泌体对于光老化现象的改善效果。
86.最优实施方式
87.以下，通过实施例详细说明本发明。但，下述实施例仅用于例示本发明，本发明并不限定于下述实施例。
88.实施例1.牛乳外泌体(milk exosome)的制备方法
89.利用离心机从来源于牛的牛乳中提取外泌体。更具体地，将牛乳接种在管中，并分别以2000g和10000g离心分离10分钟来收集上清液。利用0.45μm、0.2μm的过滤器过滤所收集的上清液后，混合磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，pbs)。之后，将外泌体提取液(exoquick exosome precipitation solution)(system biosciences)与磷酸盐缓冲液混合并添加后，静置30分钟，以1500g再次分离30分钟或以10000g再次离心分离10分钟。去除上清液并将外泌体颗粒溶解在磷酸盐缓冲液后用于实验。
90.实验例1.确认牛乳外泌体的特性
91.1-1.测量牛乳外泌体的大小
92.为了确认牛乳外泌体的大小，通过动态光散射(dynamic light scattering，dls)测量外泌体的大小，由此确认示出80nm～190nm的大小(图1)。
93.1-2.确认cd9蛋白质表达
94.利用蛋白免疫印迹确认是否表达作为外泌体标志物的cd9，如图1所示，确认在外泌体中明显观察到作为外泌体标志物的cd9蛋白，在外泌体外的上清液中未观察到cd9的表达。
95.在牛乳外泌体中，利用10％的十二烷基硫酸钠(sds)聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质。将分离的上述蛋白质移至硝酸纤维素膜(ge health care)后，为了防止抗体的非特异性结合，在5％的脱脂奶粉中反应1小时。将cd9(abcam)以1∶1000的比例稀释，并在4℃的温度下与膜结合12小时～18小时。之后，与hrp标记的抗兔(hrp-tagged anti-rabbit)抗体结合来在常温条件下反应30分钟。通过使用ecl试剂盒(santa cruz inc)观察了蛋白带。
96.1-3.确认外泌体的形状及大小
97.利用电子显微镜观察了在上述实施例1中提取的牛乳外泌体的形状及大小。结果如图2所示，确认外泌体在200nm的大小内以球形存在。
98.实验例2.确认牛乳外泌体的细胞毒性
99.2-1.培养人真皮成纤维细胞
100.购入并使用作为人真皮成纤维细胞的正常人类真皮成纤维细胞(normal human dermal fibroblast，nhdf；lonza，new jersey，usa)，使用添加2％的胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)、0.1％的胰岛素(insulin)、0.1％的重组人成纤维细胞生长因子-β(recombinant human fibroblast growth factor-β)、0.1％的ga-1000的fgm-2培养基(lonza，new jersey，usa)并在37℃、5％的co2培养箱中培养。
101.2-2.确认细胞毒性
102.为了确认本发明的牛乳外泌体是否具有毒性，在nhdf细胞，分别处理20μg/ml及50μg/ml的牛乳外泌体24小时，由此测量细胞存活率。将未处理牛乳外泌体的组作为对照组(mock)。
103.将nhdf细胞接种在96孔板，以成为5
×
104cells/ml，在37℃、5％co2条件的培养箱
中培养24小时。在所培养的上述细胞处理牛乳外泌体，培养24小时后，使用ez-cytox细胞存活率分析试剂盒(daeil lab service)并根据制造商的方法测量对于细胞存活率的效果。
104.结果，如图3所示，为对照组和处理牛乳外泌体的组中均未示出存活率变化，并确认本发明的牛乳外泌体没有毒性。
105.实验例3.确认牛乳外泌体的皮肤弹性及皱纹改善效果
106.3-1.确认皮肤弹性及皱纹相关基因的表达特性
107.为了研究根据处理牛乳外泌体的皮肤弹性及皱纹相关基因的表达特性，将牛乳外泌体处理在nhdf细胞，并利用qrt-pcr确认timp1、前胶原蛋白(procollagen)、cd34、弹性蛋白(elastin)及基质金属蛋白酶-1的表达特性。
108.在nhdf细胞处理牛乳外泌体，24小时后收集细胞。在所收集的上述细胞反应tri试剂(bioline)来分离了总rna。为了实施逆转录反应，向1μg的rna添加dntp、m-mlv逆转录酶(reverse-transcriptase)(promega)等后，在37℃的温度下反应1小时来合成了cdna。为了测量timp1、前胶原蛋白、cd34、弹性蛋白及基质金属蛋白酶-1mrna的表达，利用sybr green pcr master mix(bioline)执行实时聚合酶链式反应。用于扩增特定基因的pcr条件如下。在95℃的温度下反应10分钟后，以15秒钟且95℃、15秒钟且60℃、72℃且15秒钟为一个周期，扩增40个循环(cycles)。利用对于肌动蛋白(actin)表达量的相对表达量校正靶基因mrna的表达量。所使用的引物如下述表1所示。
109.表1
110.[0111][0112]
结果，如图4所示，确认在处理牛乳外泌体的nhdf细胞中，浓度依赖性地抑制基质金属蛋白酶-1基因的mrna表达。另外，在作为参与保护胶原蛋白、弹性蛋白的基因的timp1的情况下，确认表达量随着牛乳外泌体的处理而增加，前胶原蛋白(procollagen)、cd34、弹性蛋白(elastin)的表达量也增加。上述结果教示，牛乳外泌体促进参与改善皱纹的基因表达，相反，可通过调节胶原蛋白分解酶相关基因的表达量来对于改善皮肤皱纹具有优秀的效果。
[0113]
3-2.确认i型胶原蛋白(type i collagen)生成量
[0114]
为了确认牛乳外泌体的胶原蛋白合成促进效果，在nhdf细胞处理牛乳外泌体后，确认胶原蛋白的合成量。在nhdf细胞，分别处理20μg/ml及50μg/ml的牛乳外泌体来测量胶原蛋白的生成量，将未处理牛乳外泌体的组作为对照组(mock)。
[0115]
具体地，以1.5
×
105cells/well接种nhdf细胞并全培养24小时后，处理20μg/ml及50μg/ml的牛乳外泌体来培养48小时。之后，对于培养基，以3000rpm离心分离10分钟后，利用sircol collagen assay试剂盒(bioclolor，uk)。对于所获取的上述上清液，在试剂盒以所提供的分离浓缩试剂(isolation&concentration reagent)处理来在4℃的温度下保持16小时以上，之后，以12000rpm离心分离10分钟来浓缩胶原蛋白。去除上清液后，将1ml的所提供的sircol染色试剂(dye reagent)添加至颗粒中，并保持30分钟。以12000rpm离心分离10分钟，并利用酸性盐清洗试剂(acid-salt wash reagent)洗涤颗粒后，再次以上述条件离心分离。离心分离后，处理碱性试剂(alkali reagent)来溶解吸附在胶原蛋白的染料，并在555nm的波长中测量吸光度。
[0116]
结果，如图5所示，确认在处理牛乳外泌体的情况下，胶原蛋白的合成量增加，尤其，确认胶原蛋白的合成促进效果依赖牛乳外泌体浓度而显著上升。
[0117]
3-3.确认弹性蛋白酶(elastase)的活性抑制效果
[0118]
弹性蛋白酶抑制活性测量根据cannell方法(r.j.cannell,s.j.kellam,a.m.owsianka,&j.m.walker,1988)测量。使用n-琥珀酰-(l-ala)3-对硝基苯胺(n-succinyl-(l-ala)3-p-nitroanilide)(sigma aldrich co.,usa)作为基质，在37℃的温度下，在415nm处测量从基质生成的对硝基苯胺(p-nitroanilide)的生成量20分钟。
[0119]
具体地，在20μl的牛乳外泌体处理120μl的50mm tris-盐酸缓冲液(ph 8.0)后，添加10μl的弹性蛋白酶(1unit/ml)和50μl的作为弹性蛋白酶基质的n-琥珀酰-(l-ala)3-对硝基苯胺，并在37℃的温度下反应20分钟。反应后，在415nm处测量吸光度。
[0120]
式1：抑制率(％)＝[1-(试料添加组的吸光度/无添加组的吸光度)]
×
100结果，如图6所示，确认在处理牛乳外泌体的情况下，与未处理牛乳外泌体的对照组相比，弹性蛋白酶(elastase)活性抑制效果显著上升，弹性蛋白酶活性抑制效果优秀。
[0121]
3-4.确认胶原酶(collagenase)活性抑制效果
[0122]
胶原酶抑制活性测量根据wunsch和heindrich(e.wunsch,&h.g.heidrich,1963)的方法测量。
[0123]
具体地，向0.25ml的基质液及0.1ml的牛乳外泌体的混合液添加0.15ml的0.2mg/
ml胶原酶(sigma aldrich co.,usa)，上述基质液为向0.1m的tris-盐酸缓冲液(ph 7.5)添加4mm的cacl2来溶解0.3mg/ml的4-苯基偶氮苄氧羰基-pro-leu-gly-pro-d-arg(4-phenyl azobenzyloxycarbonyl-pro-leu-gly-pro-d-arg)(sigma aldrich co.,usa)的基质液，并在室温条件下放置20分钟后，添加500μl的6％柠檬酸(citric acid)来停止反应后，添加2ml的乙酸乙酯(ethyl acetate)，利用vmax微孔板分光光度计(vmax microplate spectrophotometer)(molecular devices,sunnyvale,ca,usa)测量在320nm处的吸光度。以试料溶液的添加组和无添加组的吸光度抑制率示出胶原酶抑制活性。
[0124]
式2：抑制率(％)＝[1-(试料添加组的吸光度/无添加组的吸光度)]
×
100结果，如图7所示，确认在处理牛乳外泌体的情况下，胶原酶(collagenase)活性抑制效果显著上升，对于牛乳外泌体的胶原酶的活性抑制具有优秀的效果。
[0125]
实验例4.确认牛乳外泌体的老化改善效果
[0126]
为了研究对于紫外线uvb引起的光老化现象的牛乳外泌体的效果，通过松三色染色(masson's trichrome staining)方法观察胶原蛋白纤维的量和形状。
[0127]
首先，购入作为由表皮和真皮构成的人工皮肤的neoderm-ed(tego science)，并一天一次照射0.05j/cm2的紫外线，共照射8天，并每两天一次处理50μg/ml的牛乳外泌体，共处理8天。
[0128]
结果，如图8所示，确认在处理牛乳外泌体的情况下，胶原蛋白纤维密度稠密且排列规则，相反，在未处理牛乳外泌体的对照组中，破坏胶原蛋白纤维，并使密度松散且排列不规则，胶原蛋白的纤维量减少。
[0129]
通过上述结果确认牛乳外泌体对于紫外线引起的皮肤老化改善也具有优秀的效果。
[0130]
前述的本发明的说明仅用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员可理解的是，可在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下容易变形为其它具体实施方式。因此，应理解的是，以上所记述的实施例在所有方面仅为例示，并不是限定性的。例如，以单一型说明的各组件可分散实施，相同地，以分散型说明的组件也能够以结合的形式实施。
[0131]
本发明的范围由发明要求保护范围而示出，发明要求保护范围的含义及范围以及其等同概念导出的所有变更或变形形式解释为均包括在本发明的范围内。