用于腺相关病毒的稳定剂和通过使用所述稳定剂稳定腺相关病毒的方法与流程

1.本公开内容涉及用于腺相关病毒(aav)的稳定剂和使用所述稳定剂稳定腺相关病毒的方法。更具体地，本公开内容涉及用于腺相关病毒的稳定剂，其包括表面活性剂或白蛋白；腺相关病毒液体制剂，其包括腺相关病毒和稳定剂；以及具有改善的稳定性的腺相关病毒的生产方法。


背景技术：

2.基因疗法是通过基因转移和表达治疗疾病的技术。与药物疗法不同，基因疗法是通过靶向引起疾病的特定基因来纠正遗传缺陷的治疗。基因疗法的最终目的是通过遗传修饰活细胞获得有益的治疗效果。基因疗法的主要研究领域可以概括为引入对特定疾病具有治疗效果的基因，增强正常细胞对抗癌药物等显示出抗性的抗性功能，或者在患有各种遗传疾病的患者中替代修饰的或丢失的基因的领域。
3.用于基因疗法的基因递送技术可以主要分为使用病毒作为转运蛋白的方法(基于病毒载体的转移方法)，使用合成磷脂或阳离子聚合物等的非病毒递送方法，以及通过向细胞膜施加临时电刺激而引入基因的物理方法，如电穿孔。在以上递送技术中，基于病毒载体的转移方法使用治疗性基因替换基因而缺乏一些或全部复制能力的载体作为递送介质，并且是基因疗法的优选方法，因为可以有效地进行基因的递送。用作病毒媒介物或病毒载体的病毒包括rna病毒载体(逆转录病毒载体、慢病毒载体等)和dna病毒载体(腺病毒载体、腺相关病毒载体等)，此外还有单纯疱疹病毒载体、α病毒载体等。最近，有关慢病毒和腺相关病毒的研究已经在相关研究中积极进行(bric view2016-t22)。
4.腺相关病毒(aav)是属于细小病毒科(parvoviridae)和依赖性病毒属(dependovirus)的单链原病毒。腺相关病毒不具有单独增殖的能力，并且需要与辅助病毒如腺病毒和痘苗病毒共存以进行复制。在腺相关病毒的生产中，用表达rep部分和cap部分的其它质粒dna转染腺相关病毒，并加入腺病毒作为辅助病毒。
5.腺相关病毒是基因疗法中非常广泛使用的载体，因为腺相关病毒不在感染的细胞中复制，诱导相对温和的免疫应答，并且基因插入的位置在某种程度上是可预测的。然而，腺相关病毒通常产生野生型蛋白壳的遗传变体以提高生产效率或感染效率和靶标递送能力，并且这些病毒表面变化可降低在外部环境中的稳定性。特别地，由于重组腺相关病毒在水溶液中是不稳定的，因此随着时间的推移在聚集和表面吸附方面存在问题，因此在长期储存方面存在问题。特别地，即使当将功能性分子引入腺相关病毒的表面时，这种不稳定特性也是一个问题，并且大多数腺相关病毒在引入过程中聚集。这些聚集的病毒形成晶体并生长至10μm或更大的尺寸，从而诱导栓塞，其阻断血管并最终导致注射个体的死亡。
6.现有的提高腺相关病毒稳定性的技术集中在如何尽可能长时间储存腺相关病毒而不丧失腺相关病毒的感染性，但是防止功能性分子被引入表面时引起结晶的研究还没有很大进展。因此，有必要开发一种即使在引入功能性分子时也能保持稳定性，同时增强腺相
关病毒本身的稳定性的技术。公开内容技术问题
7.在相关技术中使用腺相关病毒(aav)作为基因载体的情况下，由于aav在体内/体外溶液中的不稳定特点，发生aav之间的聚集和表面吸附，导致不良的稳定性。此外，当用诸如多酚的材料对aav进行表面改性时，会发生过度聚集，导致可能在体内引起栓塞的结晶颗粒的形成。本技术的发明人已经证实，通过表面活性剂或白蛋白处理显著抑制aav之间的结晶颗粒的聚集和形成，并且长时间保持稳定性，从而完成本公开内容。
8.因此，本公开内容的目的是提供用于腺相关病毒(aav)的稳定剂，包括表面活性剂或白蛋白。
9.此外，本公开内容的另一个目的是提供腺相关病毒液体制剂，其包含腺相关病毒(aav)和被配置为包含表面活性剂或白蛋白的稳定剂。
10.此外，本公开内容的另一个目的是提供具有改善的稳定性的腺相关病毒的生产方法，所述方法包括用被配置为包含表面活性剂或白蛋白的稳定剂处理腺相关病毒(aav)。
[0011][0012]
然而，本公开内容要实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员将从以下描述清楚地理解未提及的其它问题。技术方案
[0013]
为了实现如上所述的本公开内容的目的，本公开内容提供了用于腺相关病毒(aav)的稳定剂，其包含表面活性剂或白蛋白。
[0012]
在本公开内容的一个实施方案中，所述表面活性剂可以具有5至20的亲水-亲油平衡(hlb)值。
[0015]
在本公开内容的另一个实施方案中，所述表面活性剂可以选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性离子表面活性剂。
[0016]
在本公开内容的另一个实施方案中，所述稳定剂可以抑制腺相关病毒的聚集。
[0017]
在本公开内容的另一个实施方案中，所述腺相关病毒可以用基于多酚的材料进行表面改性。
[0018]
在本公开内容的另一个实施方案中，所述基于多酚的材料可以是单宁酸、儿茶酚胺或表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)。
[0019]
在本公开内容的另一个实施方案中，所述白蛋白可以以10％至0.01％(w/w)的浓度被包含。
[0020]
此外，本公开内容还提供了腺相关病毒液体制剂，其包含腺相关病毒(aav)和被配置为包含表面活性剂或白蛋白的稳定剂。
[0021]
在本公开内容的一个实施方案中，所述液体制剂可以维持在ph3.0至8.0。
[0022]
此外，本公开内容还提供了具有改善的稳定性的腺相关病毒的生产方法，所述方法包括用被配置为包含表面活性剂或白蛋白的稳定剂处理腺相关病毒(aav)。有益效果
[0023]
根据本公开内容，用于基因转移的腺相关病毒(aav)本身是不稳定的，并且容易在病毒之间聚集。此外，当用多酚对表面进行改性以提供另外的功能时，aav之间会发生过度
的聚集，并且可能形成可能引起栓塞等的结晶颗粒。然而，当表面活性剂和/或白蛋白一起处理以进行表面改性时，aav之间的这种聚集被显著抑制，从而不形成结晶颗粒，因此提高了aav的体外稳定性。证实了当表面活性剂和白蛋白联合处理时出现了显著的协同效应。因此，当使用腺相关病毒产生基因转移病毒和治疗性纳米颗粒并为此目的形成另外的多酚缀合物时，根据本公开内容的技术抑制病毒之间的过度聚集，从而将颗粒尺寸维持在用于药物递送的有效尺寸并改善液相的稳定性。因此，预期在用于基因疗法的药物递送技术领域中非常有用。
附图说明
[0024]
图1a是将分别用吐温80和triton x的非离子表面活性剂中的每一种，chaps的两性离子表面活性剂，ctab的阳离子表面活性剂和脱氧胆酸钠的阴离子表面活性剂处理的aav溶液和单宁酸溶液混合后，在显微镜下观察晶体形成的结果和通过动态光散射(dls)法的平均粒径测量，以验证腺相关病毒(aav)根据表面活性剂类型的稳定性变化；
[0025]
图1b是通过将含有ctab、吐温80和chaps中的每一种的aav溶液与单宁酸溶液混合，然后混合fbs以观察是否形成晶体来确认通过血清混合形成潜在的结晶颗粒的结果；
[0026]
图2a是将在用浓度分别为0.2％、0.05％、0.0125％和0.003％的吐温80处理的aav溶液与单宁酸溶液混合之后测量用于散射测量的uv吸光度的结果，以验证aav根据每种表面活性剂的处理浓度的稳定性变化；
[0027]
图2b是将在用浓度分别为0.05％、0.0125％、0.003％和0.0008％的triton x处理的aav溶液与单宁酸溶液混合之后测量用于散射测量的uv吸光度的结果；
[0028]
图2c是将在用浓度分别为0.4％、0.1％、0.025％和0.006％的chaps处理的aav溶液与单宁酸溶液混合之后测量用于散射测量的uv吸光度的结果；
[0029]
图2d是将在用浓度分别为0.4％、0.1％、0.025％和0.006％的ctab处理的aav溶液与单宁酸溶液混合之后测量用于散射测量的uv吸光度的结果；
[0030]
图2e是将在用浓度分别为0.2％、0.05％、0.0125％和0.0003％的脱氧胆酸钠处理的aav溶液与单宁酸溶液混合之后测量用于散射测量的uv吸光度的结果；
[0031]
图3是验证aav根据ph条件的稳定性变化的结果，并且是在使用具有不同ph的缓冲溶液制备分别存在吐温80和chaps的aav溶液，将它们与单宁酸溶液混合之后测量平均粒径和观察结晶颗粒的形成的结果；
[0032]
图4a是将用吐温80处理的aav溶液和单宁酸溶液混合之后测量平均粒径的结果以验证根据表面活性剂处理aav的体外稳定性，并且是在0分钟、20分钟和1天时观察结晶颗粒的形成和测量平均粒径的结果；
[0033]
图4b是在将分别用吐温80、chaps和脱氧胆酸钠处理的aav溶液和单宁酸溶液混合之后0分钟、30分钟和1天测量uv吸光度，并通过与初始值相比的散射程度的增加确认颗粒尺寸随时间的变化的结果；
[0034]
图5是验证根据白蛋白处理的aav的稳定性增强效果的结果，并且是在将用各种浓度(10％、1％、0.1％、0.01％)的白蛋白处理的aav溶液和单宁酸溶液混合之后测量平均粒径并观察结晶颗粒的形成的结果；
[0035]
图6是验证通过表面活性剂和白蛋白的组合增强aav的稳定性的效果的结果，并且
是在将用吐温80、chaps和ctab中的每一种处理的aav溶液与单宁酸溶液混合之后，然后另外添加白蛋白溶液测量平均粒径和观察结晶颗粒的形成的结果；以及
[0036]
图7是验证作为aav以外的无机纳米颗粒的金纳米颗粒的稳定性是否也通过表面活性剂和单宁酸之间的结合作用而保持的结果，并且是在将用吐温80、chaps和ctab中的每一种处理的金纳米颗粒和单宁酸溶液之后测量平均粒径和观察结晶颗粒的形成的结果。最佳模式
[0037]
本技术的发明人发现，当腺相关病毒(aav)用作基因载体时，由于aav在体外溶液中的不稳定特点，发生aav之间的聚集和表面吸附，导致稳定性差。此外，当aav用诸如多酚的材料进行表面改性时，会发生过度聚集，导致可能引起体内栓塞的结晶颗粒的形成。本技术的发明人已经证实，通过表面活性剂或白蛋白处理显著抑制aav之间的聚集和结晶颗粒的形成，并且长时间保持稳定性，从而完成本公开内容。
[0038]
因此，本公开内容提供了用于腺相关病毒(aav)的稳定剂，其包含表面活性剂或白蛋白。
[0039]
如本文所用，术语“稳定剂”是指当生产、单独放置或保存材料时添加以防止状态变化或化学变化的材料。在本公开内容中，稳定剂可以抑制aav之间的聚集，并且可以抑制当用诸如多酚的材料进行表面改性时由于过度聚集而导致的结晶颗粒的形成。此外，稳定剂可以具有稳定功能，使得它可以在水溶液中长时间保持aav的大小和形状，直到施用至身体。
[0040]
在本公开内容中，表面活性剂(洗涤剂)是通过在稀溶液中吸附到界面而降低表面张力的材料。通常，在一个分子中包含亲脂性基团和亲水性基团的两亲性材料可以是表面活性剂。在本公开内容中，表面活性剂可以包括5至20的亲水-亲油平衡(hlb)值。更优选地，表面活性剂可以选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性离子表面活性剂。
[0041]
hlb值是表示表面活性剂的亲水性和亲脂性程度的量度，并且当通过1954年开发的用于非离子表面活性剂的griffin公式计算时，获得0至20的hlb值，并且hlb值为0意指完全亲脂性/疏水性分子，并且hlb值为20意指完全亲水性/疏油性分子。通过hlb值，可以在某种程度上推断表面活性剂分子的特性。
[0042]
阴离子表面活性剂是指其中当溶解在水中时，表现出表面活性的原子团通过离子化变成阴离子的表面活性剂。阴离子表面活性剂具有各种类型，并且它们可以广泛地分类为皂类、硫酸酯类和烷基芳基磺酸盐类的高级醇。在本公开内容中，使用脱氧胆酸钠，但可用的类型不限于此。在本公开内容中，阴离子表面活性剂可以以总溶液的0.1％至0.01％(w/w)的浓度范围被包含，并且优选地，可以以0.07％至0.03％(w/w)的浓度被包含，但不限于此。
[0043]
阳离子表面活性剂是指其中当溶解在水中时，表现出表面活性的原子团通过离子化变成阳离子的表面活性剂。阳离子表面活性剂具有亲水性和亲脂性原子基团，并且用于各种领域，如强力消毒剂、消毒剂、沉降促进剂和抗静电剂。它们中的大多数是氮化合物(胺盐、季铵盐)，但也有硫的叔锍盐或季锍盐，并且在本公开内容中，使用西曲溴铵(ctab)，但不限于此。在本公开内容中，阳离子表面活性剂可以以总溶液的0.3％至0.007％(w/w)的浓度被包含，优选可以以0.2％至0.01％(w/w)的浓度被包含，更优选可以以0.1％至0.02％
(w/w)的浓度被包含，但不限于此。
[0044]
非离子表面活性剂是这样的表面活性剂，其具有极性，但即使溶解在水中时也不会分离成离子，并且具有几个弱的亲水基团，因此表面活性剂的亲水性，即hlb，根据亲水基团的数目而变化。非离子表面活性剂具有高的气泡稳定性，对皮肤无害的反应，在低温下改善的稳定性，优异的清洁作用和较少的起泡，因此其用途逐渐扩大。非离子表面活性剂可以主要分为基于环氧乙烷的、基于二乙醇胺的、基于山梨糖醇的和基于甘油的，并且在本公开内容中使用吐温80和triton x，但不限于此。在本公开内容中，非离子表面活性剂可以以总溶液的0.05至0.0001％(w/w)的浓度范围被包含，优选可以以0.04％至0.0005％(w/w)的浓度被包含，更优选可以以0.03％至0.0008％(w/w)的浓度被包含，并且此外优选可以以0.02％至0.001％(w/w)的浓度被包含，但不限于此。
[0045]
两性离子表面活性剂是在分子中同时具有阳离子原子基团和阴离子原子基团的表面活性剂，并且存在具有各种两性电解质结构的有机化合物，因此其用作洗发剂、调理剂、软化剂、消毒剂等。各种类型的两性离子表面活性剂是已知的，并且在本公开内容中，使用chaps(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)，但类型不限于此。在本公开内容中，两性离子表面活性剂可以以总溶液的0.08％至0.005％(w/w)的浓度范围被包含，优选可以以0.06％至0.01％(w/w)的浓度范围被包含，更优选可以以0.04％至0.02％(w/w)的浓度被包含，但不限于此。
[0046]
白蛋白是广泛分布在活细胞或体液中的简单蛋白质，与球蛋白一起构成细胞的基本原料，并且广泛存在于动物和植物的组织中。白蛋白是一种两亲性材料，如具有亲水和疏水位点的表面活性剂，因此它已经广泛地用于生物技术中以将难溶性药物溶解在水中。在本公开内容中，白蛋白可以以总溶液的10％至0.01％(w/w)的浓度被包含，并且优选可以以10％至0.1％(w/w)的浓度被包含，但不限于此。
[0047]
本技术的发明人通过具体实例证实了以上表面活性剂有效地抑制aav的聚集并抑制晶体颗粒的形成。
[0048]
在本公开内容的一个实施方案中，在将用不同类型的表面活性剂处理的aav溶液和作为aav的表面改性材料的单宁酸溶液混合之后，测量平均粒径，并且在显微镜下观察晶体颗粒的形成。结果，当未用表面活性剂进行处理时，形成大量的结晶颗粒，而当用表面活性剂进行处理时，aav的聚集被有效地抑制，从而没有观察到结晶颗粒。证实了即使注射到小鼠中时也没有显著的效果。此外，通过处理fbs以确定当与血浆混合时是否形成能够阻断血管的潜在晶体结构，证实了不论fbs处理如何都不形成晶体，这是另外验证的结果(参见实施例2)。
[0049]
在本公开内容的另一个实施方案中，为了找出aav、单宁酸和表面活性剂之间的优选浓度比，通过用每种类型的表面活性剂的不同浓度的处理来验证aav的稳定性。不形成晶体的有效浓度根据表面活性剂的类型而不同，并且当浓度太高或太低时，aav聚集没有被有效地抑制，因此形成了结晶颗粒(参见实施例3)。
[0050]
在本公开内容的另一个实施方案中，由于颗粒形成的方面可根据ph而变化，因此将含有表面活性剂的aav和单宁酸溶液与各种ph的缓冲溶液混合，并且分析平均粒径和结晶颗粒形成。结果，在ph3.0之前和之后改变颗粒形成的方面，因此，证实了ph 3.0至8.0的范围优选是合适的(参见实施例4)。
[0051]
在本公开内容的另一个实施方案中，为了验证aav的体外稳定性在用表面活性剂处理后长时间保持，将经表面活性剂处理的aav和单宁酸溶液混合，并且静置1天后测量粒径变化。作为比较的结果，证实了粒径通常保持直至1天后，并且当使用吐温80作为非离子表面活性剂进行处理时，aav的稳定性保持最高(参见实施例5)。
[0052]
在本公开内容的另一个实施方案中，验证了白蛋白作为能够改善aav的稳定性的材料(如表面活性剂)的效果。为此，在将aav溶液和单宁酸溶液混合之后，以各种浓度(10％、1％、0.1％、0.01％)向其处理白蛋白以测量平均粒径并观察结晶颗粒的形成。结果，证实了在0.1％浓度范围内形成了微米尺寸的颗粒(参见实施例6-1)。此外，为了研究用表面活性剂处理的效果，将用每种表面活性剂处理的aav溶液和单宁酸溶液混合，并向其另外混合白蛋白溶液，然后测量平均粒径，并观察结晶颗粒的形成。结果，通过白蛋白处理将已经形成的颗粒进一步减小到几百纳米的尺寸，并且不形成晶体结构，证实了表面活性剂和白蛋白组合对aav的稳定性的协同作用(实施例6-2参考)。
[0053]
在本公开内容的另一个实施方案中，根据结果，验证了表面活性剂是否改善了金纳米颗粒的稳定性，所述金纳米颗粒是除aav以外的无机纳米颗粒，并且在金纳米颗粒的情况下，在所有情况下都形成了晶体结构，而不管表面活性剂的类型(参见实施例7)。
[0054]
根据本公开内容的实施例的结果，发现各种类型的表面活性剂具有不同的有效浓度，但通过抑制aav聚集和有效抑制结晶颗粒的形成而在稳定aav方面具有优异的效果，并且白蛋白在与表面活性剂组合时也表现出更协同的效果。
[0055]
因此，作为本公开内容的另一方面，本公开内容提供了腺相关病毒液体制剂，其被配置为包括腺相关病毒(aav)和包含表面活性剂或白蛋白的稳定剂。
[0056]
在本公开内容中，液体制剂可以保持在ph3.0至8.0。
[0057]
在本公开内容的另一个方面，本公开内容提供了具有改善的稳定性的腺相关病毒的生产方法，其被配置为包括用包含表面活性剂或白蛋白的稳定剂处理腺相关病毒(aav)。
[0058]
在本公开内容中，腺相关病毒的生产方法可以使用本领域常用的方法，并且本领域技术人员可以对其进行适当地选择和生产。
[0059]
腺相关病毒可以用基于多酚的材料进行表面改性，以便向病毒引入心脏靶向特点，并且基于多酚的材料是单宁酸、儿茶酚胺或表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)，优选单宁酸，但不限于此。
[0060][0061]
在下文中，呈现优选的实施例以帮助理解本公开内容。然而，提供以下实施例仅用于更容易地理解本公开内容，并且本公开内容的内容不受以下实施例的限制。
[0062]
[实施例]
[0064]
实施例1：实验材料和方法
[0065][0066]
在本公开内容的实施例中使用的单宁酸(t0200)和金纳米颗粒(900484)购自sigma-aldrich,co。
[0067]
通过瞬时转染制备本实施例中使用的基因重组腺相关病毒血清型9(aav 9)。
[0068]
简而言之，通过使用磷酸钙将具有cap3.45的相同质量的aav辅助质粒(其是aav 9的衣壳基因)，具有反向末端重复(itr)的cmv gfp载体质粒和腺病毒辅助质粒转染到aav-293细胞中来制备。此后，如先前研究中所述回收制备的病毒载体，并通过超速离心去除杂质。使用qpcr获得aav的基因组滴度。
[0069][0070]
实施例2：aav稳定性根据表面活性剂类型而变化的验证
[0071]
本技术的发明人试图通过表面活性剂处理以解决当使用aav制备基因递送系统时aav聚集的问题来检查aav稳定性的变化。为此，验证了本领域已知的各种类型的表面活性剂的效果。更具体地，在将50μl的0.5mm单宁酸溶液与1
×
108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)(其中吐温80、triton x、chaps、西曲溴铵(ctab)和脱氧胆酸钠各自以0.05％(w/w)的浓度存在)混合后，然后在约10分钟后，通过动态光散射(dls)测量平均粒径，并在显微镜下观察可引起血管阻塞的晶体的形成。此时，作为未用表面活性剂处理的条件，将50μl的1
×
108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)与50μl的0.5mm单宁酸溶液混合，并以与以上相同的方式进行平均粒径测量和显微镜观察。
[0072]
结果，如图1a中所示，当不存在表面活性剂时，观察到以数十至数百微米的形式形成结晶颗粒，而用表面活性剂，如吐温80和triton x作为非离子表面活性剂、chaps作为两性离子表面活性剂和ctab作为阳离子表面活性剂进行处理时，没有观察到aav聚集的结晶形式的颗粒。此外，当用阴离子表面活性剂脱氧胆酸钠进行处理时，观察到大的纤维状颗粒，但证实与未用表面活性剂处理的情况相比，出现了更好的方面。
[0073]
另一方面，是否存在这种结晶颗粒的形成是影响动物实验中实验动物存活的主要因素之一。大于10μm的结晶颗粒可阻断体内的毛细血管，并且阻塞的血管可引起缺血性疾病、心肌梗死、脑梗死、血管破裂等，并且在严重的情况下，导致死亡。因此，本技术的发明人试图通过实验证实在图1a的结果中证实的结晶度如何影响小鼠的存活。为此，将50μl的0.5mm或0.25mm的单宁酸溶液与50μl的含有浓度为0.01％(w/w)的吐温80的2
×
109基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)混合，然后通过在约30分钟内将100μl的混合溶液(0.01％(w/w)吐温80+0.5mm ta+aav/0.01％(w/w)吐温80+0.25mm ta+aav)注射到小鼠的尾静脉中来证实活力。此外，作为不存在表面活性剂的条件，在相同条件下将50μl的2
×
109基因组/μl aav溶液(不含吐温80)与单宁酸混合，并注射到小鼠的尾静脉中(0.5mm ta+aav/0.25mm ta+aav)。为了比较仅注射病毒的条件，在50μl的2
×
109基因组/μl aav溶液中制备50μl pbs溶液，并在相同条件(病毒)下注射。此外，分别注射100μl的0.5mm单宁酸溶液(ta)和100μl的pbs(pbs)。
[0074]
结果，如下表1所示，当aav与单宁酸混合并注射时，不管单宁酸的浓度如何，小鼠立即死亡。当仅注射aav或单宁酸时，小鼠不死亡，但是当aav与单宁酸混合并注射时，认为通过混合形成晶体，并且当aav与单宁酸在含有表面活性剂的条件下混合时，小鼠存活。因此，确定了表面活性剂在抑制晶体形成中的作用在抑制严重的血管阻塞中是非常重要的。
[0075]
[表1]条件结果0.01％吐温80+0.5mm ta+aav存活(n＝6)0.01％吐温80+0.25mm ta+aav存活(n＝5)
0.5mm ta+aav死亡(n＝1)0.25mm ta+aav死亡(n＝1)病毒存活(n＝2)pbs存活(n＝2)ta存活(n＝2)
[0076][0077]
此外，本技术的发明人已经尝试验证当与血浆混合时可能阻断血管的潜在晶体结构的形成是否可以通过另外表面活性剂处理而被抑制。为此，将50μl的0.5mm单宁酸溶液与50μl的含有浓度为0.05％(w/w)的ctab、吐温80和chaps中的每一种的1
×
108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)混合，然后在约5分钟之后，混合50μl的10％fbs溶液，并在显微镜下观察是否形成10μm或更大的晶体。结果，证实了即使在混合fbs之后，如图1b中所观察到的，未形成晶体的状态保持与混合之前相同。
[0078][0079]
实施例3：aav稳定性根据表面活性剂浓度而变化的验证
[0080]
根据实施例2的结果，证实了当aav和单宁酸通过一起处理表面活性剂而混合时，可以抑制晶体的聚集和形成。因此，除此之外，为了找出表面活性剂的优选浓度比，分析了表面活性剂各浓度的颗粒形成方面。
[0081][0082]
3-1.非离子表面活性剂
[0083]
将50μl的0.5mm单宁酸溶液与1
×
108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)混合，其中非离子表面活性剂吐温80分别以0.2％、0.05％、0.0125％和0.003％(w/w)的浓度存在，并且在约5分钟之后，测量600nm波长带的uv-vis吸光度以进行散射，并且在显微镜下观察晶体形成。
[0084]
此外，在另一种非离子表面活性剂triton x分别以0.05％、0.0125、0.003％和0.0008％(w/w)的浓度存在的条件下，aav和单宁酸溶液以与以上相同的方法混合，进行相同的实验，并观察结果。
[0085]
结果，如图2a中所示，当吐温80以0.2％和0.003％的浓度被包含时，形成晶体结构，但当吐温80以0.05％和0.0125％的浓度被包含时，分别形成微米和纳米尺寸的颗粒。此外，如图2b中所示，当triton x以0.05％和0.0125％的浓度被包含时，形成晶体结构，但当triton x以0.003％和0.0008％的浓度被包含时，形成纳米尺寸的颗粒。
[0086][0087]
3-2.两性离子表面活性剂
[0088]
将50μl的0.5mm单宁酸溶液与1
×
108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)混合，其中两性离子表面活性剂chaps分别以0.4％、0.1％、0.025％、0.006％(w/w)的浓度存在，并且在约5分钟之后，测量600nm波长带的uv-vis吸光度以进行散射，并且在显微镜下观察晶体形成。
[0089]
结果，如图2c中所示，当chaps以0.4％、0.1％和0.006％的浓度被包含时，形成晶体结构，但在0.025％的情况下，形成纳米尺寸的颗粒。
[0090][0091]
3-3.阳离子表面活性剂
[0092]
将50μl的0.5mm单宁酸溶液与1
×
108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)混合，其中阳离子表面活性剂ctab分别以0.4％、0.1％、0.025％、0.006％(w/w)的浓度存在，并且在约5分钟之后，测量600nm波长带的uv-vis吸光度以进行散射，并且在显微镜下观察晶体形成。
[0093]
结果，如图2d中所示，当ctab以0.4％和0.006％的浓度被包含时，形成晶体结构，但当ctab以0.1％和0.025％的浓度被包含时，分别形成微米和纳米尺寸的颗粒。
[0094][0095]
3-4.阴离子表面活性剂
[0096]
将50μl的0.5mm单宁酸溶液与1
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108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)混合，其中阴离子表面活性剂脱氧胆酸钠分别以0.2％、0.05％、0.0125％、0.0003％(w/w)的浓度存在，并且在约5分钟之后，测量600nm波长带的uv-vis吸光度以进行散射，并且在显微镜下观察晶体形成。
[0097]
结果，如图2e中所示，在脱氧胆酸钠的情况下，证实了晶体结构在所有浓度下形成。
[0098]
通过以上结果，不形成晶体的有效浓度根据表面活性剂的类型而不同，并且当浓度太高或太低时，不能有效地控制单宁酸和aav的结合，从而倾向于形成结晶颗粒。
[0099][0100]
实施例4：aav稳定性根据ph条件而变化的验证
[0101]
在形成微米或纳米尺寸的颗粒时，可以根据外部环境的影响来改变形成方面，并且特别地，颗粒形成的方面可以根据ph条件而变化。因此，本技术的发明人试图验证aav的稳定性是否根据ph条件而变化。为此，分别使用不同的缓冲溶液(pbs ph7.4，柠檬酸ph4.6,ddw ph3.0)制备1
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108基因组/μl aav溶液(pbs,ph7.4)，其中吐温80和chaps以0.05％(w/w)的浓度存在。在将50μl的0.5mm单宁酸溶液与溶液混合之后，通过动态光散射方法测量平均粒径，并在显微镜下观察结晶颗粒的形成。
[0102]
结果，如图3中所示，证实了在ph 3.0之前和之后形成的颗粒的尺寸和晶型的程度改变。发现，在ph3.0或更低的条件下，发生过度聚集，并形成结晶颗粒。此外，在多酚的情况下，由于在碱性ph条件下促进氧化反应，考虑到颗粒的长期稳定性，优选的ph范围被确定为约3.0至8.0。
[0103][0104]
实施例5：体外稳定性验证
[0105]
aav颗粒的尺寸和形状必须从混合到注射保持恒定。因此，分析粒度是否保持直到30分钟之后，这是从混合到注射所花费的时间，以及保持足够的时间，即一天。为此，将50μl的0.5mm单宁酸溶液与1
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108基因组/μl aav溶液(pbs,ph7.4)混合，其中吐温80以0.01％(w/w)的浓度存在；然后在约5分钟之后，通过动态光散射方法分别在0分钟、20分钟和1天测量平均粒径，并且将粒径的增加与初始值进行比较。
[0106]
结果，如图4a中所示，尽管直到第一天的粒径略有不同，但证实了在首次制备之后通常保持粒径。
[0107]
此外，将50μl的0.5mm单宁酸溶液与1
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108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)混合，
其中各种类型的表面活性剂，即吐温80、chaps和脱氧胆酸钠各自以0.05％(w/w)的浓度存在；然后在约5分钟之后，在0分钟(min)、30分钟和1天时测量每个600nm波长带的uv-vis吸光度以测量散射程度。通过与初始值相比的散射增加来分析粒度随时间的变化。
[0108]
结果，证实了当比较由每种表面活性剂形成的颗粒的尺寸变化时，在加入吐温80的条件下最稳定地保持粒径，如图4b所示。
[0109][0110]
实施例6：白蛋白对稳定性增强效果的验证
[0111]
本技术的发明人试图通过在颗粒形成中通过多酚和表面活性剂之间的键合来处理另外的添加剂来进一步减小颗粒的尺寸。为此，选择白蛋白作为添加剂，并验证其效果。
[0112][0113]
6-1.单独白蛋白的效果验证
[0114]
将50μl的0.5mm单宁酸溶液与1
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108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)混合，其中白蛋白分别以10％、1％、0.1％、0.01％(w/w)的不同浓度存在，在约10分钟之后，通过动态光散射测量平均粒径，并在显微镜下观察颗粒形成。
[0115]
结果，如在图5中所观察到的，当白蛋白以10％、1％和0.01％的浓度添加时，形成晶体结构，而在0.1％浓度的情况下，形成微米尺寸的颗粒。
[0116][0117]
6-2.表面活性剂与白蛋白的组合对稳定性增强效果的验证
[0118]
接着，为了发现白蛋白是否能够进一步减小已经通过每种表面活性剂形成的颗粒的尺寸，将50μl的0.5mm单宁酸溶液与1
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108基因组/μl aav溶液(pbs，ph7.4)混合，其中吐温80以0.01％(w/w)的浓度存在，chaps和ctab各自以0.05％(w/w)的浓度存在，在约5分钟之后，混合50μl的10％(w/w)白蛋白溶液，然后通过动态光散射测量平均粒径并在显微镜下观察。
[0119]
结果，如图6所示，证实了通过将白蛋白与表面活性剂一起加入，通过白蛋白处理将已经通过每种表面活性剂形成的颗粒减少到数百纳米，并且没有形成可能引起血管阻塞的10μm或更大的晶体结构。根据以上结果，发现表面活性剂和白蛋白的组合进一步改善了aav的稳定性。
[0120][0121]
实施例7：aav特异性的稳定性效果验证
[0122]
本技术的发明人进行了以下实验以发现金纳米颗粒的稳定性是否也通过表面活性剂和单宁酸的结合作用而保持，所述金纳米颗粒是可以用作aav以外的基因载体的无机纳米颗粒。具体地，将50μl的0.5mm单宁酸溶液与450nm吸光度为0.1au浓度的50μl的金纳米颗粒溶液(pbs，ph7.4)混合，其中吐温80、chaps和ctab分别以0.05％(w/w)的浓度存在。在约5分钟之后，通过动态光散射测量平均粒径并在显微镜下观察。此外，在没有添加表面活性剂作为对照组的相同条件下进行实验。
[0123]
结果，如图7所示，证实了在金纳米颗粒的情况下，无论表面活性剂的类型如何，在所有情况下都形成晶体结构，并且由于颗粒本身的重量，观察到比aav更严重的聚集。通过这种方式，在无机颗粒如金纳米颗粒的情况下，判断出不适合应用通过用表面活性剂处理颗粒来保持颗粒稳定性的技术。
[0124][0125]
本公开内容的上述描述是例如，并且本领域技术人员将理解，本公开内容可以容易地以其它具体形式修改而不改变本公开内容的技术精神或基本特征。因此，应当理解，上述实施方案是示例性的，而不是在所有方面进行限制。工业实用性
[0126]
当使用腺相关病毒产生基因递送病毒和治疗性纳米颗粒并为此形成另外的多酚结合物时，根据本公开内容的腺相关病毒的稳定技术抑制病毒之间的过度聚集。由于抑制了病毒之间的过度聚集，因此颗粒的尺寸保持在用于药物递送的有效尺寸，并且在液相中的稳定性增加。它可用于使用腺苷相关病毒的基因治疗和相关领域。