CD73抑制剂和A2A/A2B腺苷受体抑制剂组合疗法的制作方法

cd73抑制剂和a2a/a2b腺苷受体抑制剂组合疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年1月3日提交的美国临时申请号62/956,840的权利，所述申请以引用的方式整体并入本文。
3.序列表
4.本技术含有序列表，所述序列表已以ascii格式以电子方式提交并且特此以引用的方式整体并入。所述ascii副本于2020年12月23日创建，命名为20443-0645wo1_sl.txt并且大小为112,058字节。
技术领域
5.公开了包括施用cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂的组合疗法。所公开的组合疗法可用于治疗与a2a和/或a2b腺苷受体和/或cd73的活性相关的疾病，包括例如癌症、炎性疾病、心血管疾病和神经退行性疾病。还公开了抗cd73抑制剂和a2a/a2b腺苷受体抑制剂。


背景技术：

6.分化簇73(cd73)是糖基磷脂酰肌醇-(gpi-)连接的膜蛋白，其催化胞外单磷酸腺苷(amp)向腺苷的转化。其充当同源二聚体，并且可脱落并在循环中作为可溶性蛋白质具有活性。除了其酶促功能之外，cd73还是细胞粘附分子，并且在白细胞运输的调控中发挥作用。已知由于组织损伤或缺氧条件，cd73水平上调，并且许多实性肿瘤具有升高的cd73水平。肿瘤内cd73的上调有助于富含腺苷的肿瘤微环境，所述环境具有多种促肿瘤和免疫抑制作用。
7.腺苷是胞外信号传导分子，其可通过多种免疫细胞类型调节免疫反应。腺苷首先由drury和识别为冠状动脉血管张力的生理调节剂(sachdeva,s.和gupta,m.saudi pharmaceutical journ al,2013,21,245
–
253)，然而直至1970年，sattin和rall才证明腺苷经由占据细胞表面上的特定受体来调控细胞功能(sattin,a.和rall,t.w.,1970.mol.pharmacol.6,13
–
23；hasko
′
,g.等人,2007,pharmacol.ther.113,264
–
275)。
8.腺苷在各种其他生理功能中起着至关重要的作用。当与三个磷酸基团连接时，其参与核酸的合成；其形成atp，atp是细胞能量系统不可或缺的组分。腺苷可通过胞外atp的酶促分解产生，或者还可通过穿过受损的质膜从受伤的神经元和神经胶质细胞中释放(tautenhahn,m.等人neuropharmacology,2012,62,1756
–
1766)。腺苷通过作用于定位在细胞膜上的特定受体，在外周和中枢神经系统中产生各种药理作用(matsumoto,t.等人pharmacol.res.,2012,65,81
–
90)。已经描述了胞外腺苷产生的替代途径。这些途径包括通过cd38、cd203a和cd73的协同作用从烟酰胺二核苷酸(nad)代替atp产生腺苷。cd73非依赖性腺苷的产生还可通过其他磷酸(诸如碱性磷酸酶或前列腺特异性磷酸酶)发生。
9.人腺苷受体有四种已知的亚型，包括a1、a2a、a2b和a3受体。a1和a2a是高亲和力受
体，而a2b和a3是低亲和力受体。腺苷及其激动剂可经由这些受体中的一种或多种发挥作用，并且可调节腺苷酸环化酶的活性，所述腺苷酸环化酶是负责增加环状amp(camp)的酶。不同受体对这种酶具有不同的刺激和抑制作用。胞内camp浓度升高可抑制免疫细胞和炎性细胞的活性(livingston,m.等人,inflamm.res.,2004,53,171-178)。
10.a2a腺苷受体可在外周和中枢神经系统(cns)中信号传导，其中激动剂经探索用作抗炎药，而拮抗剂经探索用于神经退行性疾病(carlsson,j.等人,j.med.chem.,2010,53,3748
–
3755)。在大多数细胞类型中，a2a亚型抑制胞内钙水平，而a2b则增强此水平。a2a受体一般而言似乎抑制免疫细胞的炎性反应(borrmann,t.等人,j.med.chem.,2009,52(13),3994
–
4006)。
11.a2b受体在胃肠道、膀胱、肺和肥大细胞中高度表达(antonioli,l.等人,nature reviews cancer,2013,13,842-857)。尽管a2b受体在结构上与a2a受体密切相关并且能够激活腺苷酸环化酶，但在功能上有所不同。据推测，这种亚型可利用腺苷酸环化酶以外的信号转导系统(livingston,m.等人,inflamm.res.,2004,53,171-178)。在所有腺苷受体中，a2b腺苷受体是低亲和力受体，被认为在生理条件下保持沉默，并由于胞外腺苷水平升高而被激活(ryzhov,s.等人neoplasia,2008,10,987
–
995)。a2b腺苷受体的激活可分别通过gs和gq蛋白的激活来刺激腺苷酸环化酶和磷脂酶c。还已经描述了与有丝分裂原激活的蛋白激酶的偶联(borrmann,t.等人,j.med.chem.,2009,52(13),3994
–
4006)。
12.在免疫系统中，腺苷信号传导的参与可以是保护组织免受过度免疫反应的关键调节机制。腺苷可通过许多免疫细胞类型负调节免疫反应，所述免疫细胞类型包括t细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞和髓系衍生的抑制细胞(allard,b.等人current opinion in pharmacology,2016,29,7
–
16)。
13.在肿瘤中，这种途径被肿瘤微环境所束缚，并且破坏免疫系统的抗肿瘤能力，从而促进癌症进展。在肿瘤微环境中，腺苷主要从胞外atp通过两个外切核苷酸酶cd39和cd73产生。多种细胞类型可通过表达cd39和cd73产生腺苷。对于肿瘤细胞、效应t细胞、调节性t细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓系衍生的抑制细胞(mdsc)、内皮细胞、癌症相关成纤维细胞(caf)和间充质基质/干细胞(msc)而言，是这种情况。另外，在肿瘤微环境中常见的缺氧和炎症条件诱导cd39和cd73的表达，导致腺苷产生增加。结果，与正常生理条件相比，实体瘤中的腺苷水平更高。
14.a2a大多在淋巴系衍生的细胞上表达，包括效应t细胞、调节性t细胞和自然杀伤(nk)细胞。阻断a2a受体可阻止暂时使t细胞失活的下游免疫抑制信号。a2b受体主要在单核细胞衍生的细胞上表达，所述细胞包括树突状细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓系衍生的抑制细胞(mdsc)和间充质基质/干细胞(msc)。在临床前模型中阻断a2b受体可抑制肿瘤生长，阻断转移并增加肿瘤抗原的呈递。
15.就adora2a/adora2b(a2a/a2b)阻断的安全性特征而言，a2a和a2b受体敲除(ko)小鼠均能存活，没有显示出生长异常并且是能繁殖的(allard,b.等人current opinion in pharmacology,2016,29,7
–
16)。a2a ko小鼠仅在用脂多糖(lps)激发后才展示出升高的促炎细胞因子水平，并且在基线时没有炎症迹象(antonioli,l.等人,nature reviews cancer,2013,13,842-857)。a2b ko小鼠表现出正常血小板、红细胞和白细胞计数，但在基线时炎症增强，诸如tnf-α和il-6)(antonioli,l.等人,nature reviews cancer,2013,13,
842-857)。lps处理后，检测到tnf-α和il-6的产生进一步增加。a2b ko小鼠还表现出增加的血管粘附分子，所述粘附分子介导炎症以及白细胞粘附/滚动；增强的肥大细胞激活；在缺氧条件下增加的对ige介导的过敏反应的敏感性以及增加的血管渗漏和嗜中性粒细胞流入(antonioli,l.等人,nature reviews cancer,2013,13,842-857)。


技术实现要素：

16.在第一方面，本公开提供一种用于治疗有此需要的人受试者的癌症的方法，其包括向所述人受试者施用有效量的人cd73的抑制剂以及a2a腺苷受体和/或a2b腺苷受体的抑制剂。
17.在一些实施方案中，(1)人cd73的抑制剂包含：
18.(a)抗体，所述抗体包含可变重(vh)结构域，所述可变重(vh)结构域包含vh互补决定区(cdr)1、vh cdr2和vh cdr3，其中：
19.vh cdr1包含氨基酸序列gytftsyg(seq id no:1)；
20.vh cdr2包含氨基酸序列iypgsgnt(seq id no:2)；且
21.vh cdr3包含氨基酸序列arydylgssygfdy(seq id no:3)；并且
22.包含可变轻(vl)结构域，所述可变轻(vl)结构域包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其中：
23.vl cdr1包含氨基酸序列qdvsta(seq id no:4)；
24.vl cdr2包含氨基酸序列sas(seq id no:5)；且
25.vl cdr3包含氨基酸序列qqhyntpyt(seq id no:6)；
26.(b)在seq id no:70的氨基酸40-53内的表位处结合至人cd73的抗体；
27.(c)结合至人cd73并与具有包含seq id no:24的氨基酸序列的重链和包含seq id no:25的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；或
28.(d)包含vh结构域的抗体，所述vh结构域包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，其中：
29.vh cdr1包含氨基酸序列gftfssyd(seq id no:34)；
30.vh cdr2包含氨基酸序列msydgsnk(seq id no:35)或msyegsnk(seq id no:40)；并且
31.vh cdr3包含氨基酸序列ateiaakgdy(seq id no:36)；和
32.包含vl结构域的抗体，所述vl结构域包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其中：
33.vl cdr1包含氨基酸序列qgisny(seq id no:37)；
34.vl cdr2包含氨基酸序列aas(seq id no:38)；并且
35.vl cdr3包含氨基酸序列qqsystph(seq id no:39)；
36.(e)在seq id no:70的氨基酸386-399和470-489内的表位处结合至人cd73的抗体；
37.(f)结合至人cd73并与具有包含seq id no:30的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；
38.(g)结合至人cd73并与具有包含seq id no:33的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；
39.(h)选自由11e1、medi9447、cpi-006和bms-986179组成的组的抗体；或
40.(i)选自由cb-708和ab680组成的组的抑制剂。
41.在一些实施方案中，a2a腺苷受体和/或a2b腺苷受体(a2a/a2b)的抑制剂包含以下化合物：
42.(a)式(i)：
[0043][0044]
或其药学上可接受的盐，其中
[0045]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0046]
cy2是5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基，其中cy2的5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个各自独立地选自c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、nh2、nh(c
1-3
烷基)和n(c
1-3
烷基)2的基团取代；
[0047]
r2选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-和or
a2
，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的rc取代基取代；
[0048]ra2
是任选地被1或2个独立地选择的rc取代基取代的(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-；
[0049]
每个rc独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c6芳基、5-7元杂芳基、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-、or
a4
和nr
c4rd4
；并且
[0050]
每个r
a4
、r
c4
和r
d4
独立地选自h和c
1-6
烷基；
[0051]
(b)式(ii)：
[0052][0053]
或其药学上可接受的盐，其中
[0054]
r2选自h和cn；
[0055]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0056]
l是c
1-3
亚烷基，其中所述亚烷基任选地被1、2或3个独立地选择的r
8d
取代基取代；
[0057]
cy4选自苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基，其中所述苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基各自任选地被1、2或3个独立选自r
8d
和r8的取代基取代；
[0058]
每个r8独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r8的所述c
1-6
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8a
取代基取代；
[0059]
每个r
8a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、cn、or
a81
和nr
c81rd81
，其中r
8a
的所述c
1-3
烷基、5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0060]
每个r
a81
、r
c81
和r
d81
独立地选自h、c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基，其中r
a81
、r
c81
和r
d81
的所述c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0061]
每个r
8b
独立地选自卤基和c
1-3
烷基；并且
[0062]
每个r
8d
独立地选自oh、cn、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0063]
(c)式(iii)：
[0064][0065]
或其药学上可接受的盐，其中
[0066]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0067]
r2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中r2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；
[0068]
每个r
2a
独立地选自d、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0069]
r4选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r4的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
4a
取代基取代；
[0070]
每个r
4a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、cn、or
a41
和nr
c41rd41
；并且
[0071]
每个r
a41
、r
c41
和r
d41
独立地选自h和c
1-6
烷基；或
[0072]
(d)式(iv)；
[0073][0074]
[0075]
或其药学上可接受的盐，其中
[0076]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0077]
cy2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中cy2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r6取代基取代；
[0078]
每个r6独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0079]
r2是苯基-c
1-3
烷基-或(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-和(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；并且
[0080]
每个r
2a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基。
[0081]
或其药学上可接受的盐。
[0082]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含：
[0083]
(a)抗体，所述抗体包含可变重(vh)结构域，所述可变重(vh)结构域包含vh互补决定区(cdr)1、vh cdr2和vh cdr3，其中：
[0084]
vh cdr1包含氨基酸序列gytftsyg(seq id no:1)；
[0085]
vh cdr2包含氨基酸序列iypgsgnt(seq id no:2)；并且
[0086]
vh cdr3包含氨基酸序列arydylgssygfdy(seq id no:3)；并且
[0087]
包含可变轻(vl)结构域，所述可变轻(vl)结构域包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其中：
[0088]
vl cdr1包含氨基酸序列qdvsta(seq id no:4)；
[0089]
vl cdr2包含氨基酸序列sas(seq id no:5)；并且
[0090]
vl cdr3包含氨基酸序列qqhyntpyt(seq id no:6)；
[0091]
(b)在seq id no:70的氨基酸40-53内的表位处结合至人cd73的抗体；
[0092]
(c)结合至人cd73并与具有包含seq id no:24的氨基酸序列的重链和包含seq id no:25的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；或
[0093]
(d)包含vh结构域的抗体，所述vh结构域包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，其中：
[0094]
vh cdr1包含氨基酸序列gftfssyd(seq id no:34)；
[0095]
vh cdr2包含氨基酸序列msydgsnk(seq id no:35)或msyegsnk(seq id no:40)；并且
[0096]
vh cdr3包含氨基酸序列ateiaakgdy(seq id no:36)；和
[0097]
包含vl结构域的抗体，所述vl结构域包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其中：
[0098]
vl cdr1包含氨基酸序列qgisny(seq id no:37)；
[0099]
vl cdr2包含氨基酸序列aas(seq id no:38)；并且
[0100]
vl cdr3包含氨基酸序列qqsystph(seq id no:39)；
[0101]
(e)在seq id no:70的氨基酸386-399和470-489内的表位处结合至人cd73的抗体；
[0102]
(f)结合至人cd73并与具有包含seq id no:30的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；
[0103]
(g)结合至人cd73并与具有包含seq id no:33的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；
[0104]
(h)选自由11e1、medi9447、cpi-006和bms-986179组成的组的抗体；或
[0105]
(i)选自由cb-708和ab680组成的组的抑制剂；并且
[0106]
a2a腺苷受体和/或a2b腺苷受体(a2a/a2b)的抑制剂包含以下化合物：
[0107]
(a)式(i)：
[0108][0109]
或其药学上可接受的盐，其中
[0110]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0111]
cy2是5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基，其中cy2的5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个各自独立地选自c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、nh2、nh(c
1-3
烷基)和n(c
1-3
烷基)2的基团取代；
[0112]
r2选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-和or
a2
，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的rc取代基取代；
[0113]ra2
是任选地被1或2个独立地选择的rc取代基取代的(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-；
[0114]
每个rc独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c6芳基、5-7元杂芳基、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-、or
a4
和nr
c4rd4
；并且
[0115]
每个r
a4
、r
c4
和r
d4
独立地选自h和c
1-6
烷基；
[0116]
(b)式(ii)：
[0117][0118]
或其药学上可接受的盐，其中
[0119]
r2选自h和cn；
[0120]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0121]
l是c
1-3
亚烷基，其中所述亚烷基任选地被1、2或3个独立地选择的r
8d
取代基取代；
[0122]
cy4选自苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基，其中所述苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基各自任选地被1、2或3个独立选自r
8d
和r8的取代基取代；
[0123]
每个r8独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷
基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r8的所述c
1-6
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8a
取代基取代；
[0124]
每个r
8a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、cn、or
a81
和nr
c81rd81
，其中r
8a
的所述c
1-3
烷基、5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0125]
每个r
a81
、r
c81
和r
d81
独立地选自h、c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基，其中r
a81
、r
c81
和r
d81
的所述c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0126]
每个r
8b
独立地选自卤基和c
1-3
烷基；并且
[0127]
每个r
8d
独立地选自oh、cn、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0128]
(c)式(iii)：
[0129][0130]
或其药学上可接受的盐，其中
[0131]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0132]
r2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中r2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；
[0133]
每个r
2a
独立地选自d、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0134]
r4选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r4的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
4a
取代基取代；
[0135]
每个r
4a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、cn、or
a41
和nr
c41rd41
；并且
[0136]
每个r
a41
、r
c41
和r
d41
独立地选自h和c
1-6
烷基；或
[0137]
(d)式(iv)；
[0138][0139]
或其药学上可接受的盐，其中
[0140]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0141]
cy2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中cy2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r6取代基取代；
[0142]
每个r6独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0143]
r2是苯基-c
1-3
烷基-或(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-和(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；并且
[0144]
每个r
2a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基。
[0145]
或其药学上可接受的盐。
[0146]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是式(i)的化合物：
[0147][0148]
或其药学上可接受的盐，其中
[0149]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0150]
cy2是5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基，其中cy2的所述5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个各自独立地选自c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、nh2、nh(c
1-3
烷基)和n(c
1-3
烷基)2的基团取代；
[0151]
r2选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-和or
a2
，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的rc取代基取代；
[0152]ra2
是任选地被1或2个独立地选择的rc取代基取代的(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-；
[0153]
每个rc独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c6芳基、5-7元杂芳基、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-、or
a4
和nr
c4rd4
；并且
[0154]
每个r
a4
、r
c4
和r
d4
独立地选自h和c
1-6
烷基。在一些情况下，a2a/a2b的抑制剂选自：3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲
腈或其药学上可接受的盐；3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2h-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；3-(5-氨基-2-((3-甲基吡啶-2-基)甲氧基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；和3-(2-((5-(1h-吡唑-1-基)-1h-四唑-1-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
[0155]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是式(ii)的化合物：
[0156][0157]
或其药学上可接受的盐，其中
[0158]
r2选自h和cn；
[0159]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0160]
l是c
1-3
亚烷基，其中所述亚烷基任选地被1、2或3个独立地选择的r
8d
取代基取代；
[0161]
cy4选自苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基，其中所述苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基各自任选地被1、2或3个独立选自r
8d
和r8的取代基取代；
[0162]
每个r8独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r8的所述c
1-6
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8a
取代基取代；
[0163]
每个r
8a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、cn、or
a81
和nr
c81rd81
，其中r
8a
的所述c
1-3
烷基、5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0164]
每个r
a81
、r
c81
和r
d81
独立地选自h、c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基，其中r
a81
、r
c81
和r
d81
的所述c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0165]
每个r
8b
独立地选自卤基和c
1-3
烷基；并且
[0166]
每个r
8d
独立地选自oh、cn、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基。在一些情况下，a2a/a2b的抑制剂选自：3-(5-氨基-2-(羟基(苯基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐；5-氨基-7-(3-氰基-2-氟苯基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-8-甲腈或其药学上可接受
的盐；和3-(5-氨基-2-((2-氟-6-(((1-甲基-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基)甲基)苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐。
[0167]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是式(iii)的化合物：
[0168][0169]
或其药学上可接受的盐，其中
[0170]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0171]
r2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中r2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；
[0172]
每个r
2a
独立地选自d、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0173]
r4选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r4的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
4a
取代基取代；
[0174]
每个r
4a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、cn、or
a41
和nr
c41rd41
；并且
[0175]
每个r
a41
、r
c41
和r
d41
独立地选自h和c
1-6
烷基。在一些情况下，a2a/a2b的抑制剂选自：3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈；3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；3-(8-氨基-2-(氨基(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；和3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(2,6-二甲基吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
[0176]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是式(iv)的化合物：
[0177][0178]
或其药学上可接受的盐，其中
[0179]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0180]
cy2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中cy2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r6取代基取代；
[0181]
每个r6独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0182]
r2是苯基-c
1-3
烷基-或(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-和(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；并且
[0183]
每个r
2a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基。
[0184]
或其药学上可接受的盐。在一些情况下，a2a/a2b的抑制剂选自：3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(吡啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；和3-(4-氨基-7-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐。
[0185]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
[0186]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2h-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
[0187]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
[0188]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体包含：
[0189]
包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh结构域，其中：
[0190]
vh cdr1包含氨基酸序列gytftsyg(seq id no:1)；
[0191]
vh cdr2包含氨基酸序列iypgsgnt(seq id no:2)；并且
[0192]
vh cdr3包含氨基酸序列arydylgssygfdy(seq id no:3)；和
[0193]
包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl结构域，其中：
[0194]
vl cdr1包含氨基酸序列qdvsta(seq id no:4)；
[0195]
vl cdr2包含氨基酸序列sas(seq id no:5)；并且
[0196]
vl cdr3包含氨基酸序列qqhyntpyt(seq id no:6)。
[0197]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体在seq id no:70的氨基酸40-53内的表位处结合至人cd73。
[0198]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体结合至人cd73并与具有包含seq id no:24的氨基酸序列的重链和包含seq id no:25的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73。
[0199]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体包含：
[0200]
包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh结构域，其中：
[0201]
vh cdr1包含氨基酸序列gftfssyd(seq id no:34)；
[0202]
vh cdr2包含氨基酸序列msydgsnk(seq id no:35)或msyegsnk(seq id no:40)；并且
[0203]
vh cdr3包含氨基酸序列ateiaakgdy(seq id no:36)；和
[0204]
包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl结构域，其中：
[0205]
vl cdr1包含氨基酸序列qgisny(seq id no:37)；
[0206]
vl cdr2包含氨基酸序列aas(seq id no:38)；并且
[0207]
vl cdr3包含氨基酸序列qqsystph(seq id no:39)。
[0208]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体在seq id no:70的氨基酸386-399和470-489内的表位处结合至人cd73。
[0209]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体结合至人cd73并与具有包含seq id no:30的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73。
[0210]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体结合至人cd73并与具有包含seq id no:33的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73。
[0211]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含选自由11e1、medi9447、cpi-006和bms-986179组成的组的抗体。
[0212]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂选自由cb-708和ab680组成的组。
[0213]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体包含含有seq id no:22中列出的氨基酸序列的vh结构域和含有seq id no:23中列出的氨基酸序列的vl结构域，并且a2a/a2b的抑制剂包含3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0214]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，并且其中所述重链包含seq id no:24中列出的氨基酸序列并且所述轻链包含seq id no:25中列出的氨基酸序列，并且a2a/a2b的抑制剂包含3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0215]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体包含含有seq id no:62中列出的氨基酸序列的vh结构域和含有seq id no:61中列出的氨基酸序列的vl结构域，并且a2a/a2b的抑制剂包含3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0216]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，并且其中所述重链包含seq id no:30中列出的氨基酸序列并且所述轻链包含seq id no:31中列出的氨基酸序列，并且a2a/a2b的抑制剂包含3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0217]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体包含含有seq id no:63中列出的氨基酸序列的vh结构域和含有seq id no:61中列出的氨基酸序列的vl结构域，并且a2a/a2b的抑制剂包含3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0218]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，并且其
中所述重链包含seq id no:33中列出的氨基酸序列并且所述轻链包含seq id no:31中列出的氨基酸序列，并且a2a/a2b的抑制剂包含3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0219]
在第二方面，本公开提供一种用于治疗有此需要的人受试者的癌症的方法，其包括向所述人受试者施用有效量的结合至人cd73的抗体以及a2a腺苷受体和/或a2b腺苷受体的抑制剂，其中所述抗体：
[0220]
(a)包含含有vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh结构域，其中：
[0221]
vh cdr1包含氨基酸序列gytftsyg(seq id no:1)；
[0222]
vh cdr2包含氨基酸序列iypgsgnt(seq id no:2)；且
[0223]
vh cdr3包含氨基酸序列arydylgssygfdy(seq id no:3)；并且
[0224]
包含含有vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl结构域，其中：
[0225]
vl cdr1包含氨基酸序列qdvsta(seq id no:4)；
[0226]
vl cdr2包含氨基酸序列sas(seq id no:5)；且
[0227]
vl cdr3包含氨基酸序列qqhyntpyt(seq id no:6)；
[0228]
(b)在seq id no:70的氨基酸40-53内的表位处结合至人cd73；
[0229]
(c)结合至人cd73并与具有包含seq id no:24的氨基酸序列的重链和包含seq id no:25的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73；
[0230]
(d)包含含有vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh结构域，其中：
[0231]
vh cdr1包含氨基酸序列gftfssyd(seq id no:34)；
[0232]
vh cdr2包含氨基酸序列msydgsnk(seq id no:35)或msyegsnk(seq id no:40)；且
[0233]
vh cdr3包含氨基酸序列ateiaakgdy(seq id no:36)；并且
[0234]
其中所述抗体包含含有vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl结构域，其中：
[0235]
vl cdr1包含氨基酸序列qgisny(seq id no:37)；
[0236]
vl cdr2包含氨基酸序列aas(seq id no:38)；且
[0237]
vl cdr3包含氨基酸序列qqsystph(seq id no:39)；
[0238]
(e)在seq id no:70的氨基酸386-399和470-489内的表位处结合至人cd73；
[0239]
(f)结合至人cd73并与具有包含seq id no:30的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73；或
[0240]
(g)结合至人cd73并与具有包含seq id no:33的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73。
[0241]
在一些实施方案中，抗体包含含有vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh结构域，其中：
[0242]
vh cdr1包含氨基酸序列gytftsyg(seq id no:1)；
[0243]
vh cdr2包含氨基酸序列iypgsgnt(seq id no:2)；且
[0244]
vh cdr3包含氨基酸序列arydylgssygfdy(seq id no:3)；并且
[0245]
其中所述抗体包含含有vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl结构域，其中：
[0246]
vl cdr1包含氨基酸序列qdvsta(seq id no:4)；
[0247]
vl cdr2包含氨基酸序列sas(seq id no:5)；且
[0248]
vl cdr3包含氨基酸序列qqhyntpyt(seq id no:6)。在一些情况下，vh结构域包含
seq id no:22中列出的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链并且其中所述重链包含seq id no:24中列出的氨基酸序列。在一些情况下，vl结构域包含seq id no:23中列出的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链并且其中所述轻链包含seq id no:25中列出的氨基酸序列。在一些情况下，vh结构域与seq id no:22中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性并且vl结构域与seq id no:23中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性。在一些情况下，vh结构域包含seq id no:22中列出的氨基酸序列并且vl结构域包含seq id no:23中列出的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链和轻链，并且其中所述重链包含seq id no:24中列出的氨基酸序列并且所述轻链包含seq id no:25中列出的氨基酸序列。
[0249]
在一些实施方案中，抗体在seq id no:70的氨基酸40-53内的表位处结合至人cd73。
[0250]
在一些实施方案中，抗体结合至人cd73并与具有包含seq id no:24的氨基酸序列的重链和包含seq id no:25的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73。
[0251]
在一些实施方案中，抗体包含含有vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh结构域，其中：
[0252]
vh cdr1包含氨基酸序列gftfssyd(seq id no:34)；
[0253]
vh cdr2包含氨基酸序列msydgsnk(seq id no:35)或msyegsnk(seq id no:40)；且
[0254]
vh cdr3包含氨基酸序列ateiaakgdy(seq id no:36)；并且
[0255]
其中所述抗体包含含有vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl结构域，其中：
[0256]
vl cdr1包含氨基酸序列qgisny(seq id no:37)；
[0257]
vl cdr2包含氨基酸序列aas(seq id no:38)；且
[0258]
vl cdr3包含氨基酸序列qqsystph(seq id no:39)。
[0259]
在一些实施方案中，抗体包含含有vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh结构域，其中：
[0260]
vh cdr1包含氨基酸序列gftfssyd(seq id no:34)；
[0261]
vh cdr2包含氨基酸序列msydgsnk(seq id no:35)；
[0262]
vh cdr3包含氨基酸序列ateiaakgdy(seq id no:36)；并且
[0263]
其中所述抗体包含含有vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl结构域，其中：
[0264]
vl cdr1包含氨基酸序列qgisny(seq id no:37)；
[0265]
vl cdr2包含氨基酸序列aas(seq id no:38)；且
[0266]
vl cdr3包含氨基酸序列qqsystph(seq id no:39)。在一些情况下，vh结构域包含seq id no:62中列出的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链并且其中所述重链包含seq id no:30中列出的氨基酸序列。在一些情况下，vl结构域包含seq id no:61中列出的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链并且其中所述轻链包含seq id no:31中列出的氨基酸序列。在一些情况下，vh结构域与seq id no:62中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性并且vl结构域与seq id no:61中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性。在一些情况下，vh结构域包含seq id no:62中列出的氨基酸序列并且vl结构域包含seq id no:61中列出的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链和轻链，并且其中所述重链包含seq id no:30中列出的氨基酸序列并且所述轻链包含seq id no:31中列出的氨基酸序列。
[0267]
在一些实施方案中，抗体包含含有vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh结构域，其中：
[0268]
vh cdr1包含氨基酸序列gftfssyd(seq id no:34)；
[0269]
vh cdr2包含氨基酸序列msyegsnk(seq id no:40)；
[0270]
vh cdr3包含氨基酸序列ateiaakgdy(seq id no:36)；并且
[0271]
其中所述抗体包含含有vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl结构域，其中：
[0272]
vl cdr1包含氨基酸序列qgisny(seq id no:37)；
[0273]
vl cdr2包含氨基酸序列aas(seq id no:38)；且
[0274]
vl cdr3包含氨基酸序列qqsystph(seq id no:39)。在一些情况下，vh结构域包含seq id no:63中列出的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链并且其中所述重链包含seq id no:33中列出的氨基酸序列。在一些情况下，vl结构域包含seq id no:61中列出的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链并且其中所述轻链包含seq id no:31中列出的氨基酸序列。在一些情况下，vh结构域与seq id no:63中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性并且vl结构域与seq id no:61中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性。在一些情况下，vh结构域包含seq id no:63中列出的氨基酸序列并且vl结构域包含seq id no:61中列出的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链和轻链，并且其中所述重链包含seq id no:33中列出的氨基酸序列并且所述轻链包含seq id no:31中列出的氨基酸序列。
[0275]
在一些实施方案中，抗体在seq id no:70的氨基酸386-399和470-489内的表位处结合至人cd73。
[0276]
在一些实施方案中，抗体结合至人cd73并与具有包含seq id no:30的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73。
[0277]
在一些实施方案中，抗体结合至人cd73并与具有包含seq id no:33的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73。
[0278]
在一些实施方案中，抑制剂选自由以下组成的组：7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-[[6-[[(3s)-氧杂环戊烷-3-基]氧基甲基]吡啶-2-基]甲基]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺；3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2h-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈；3-[2-氨基-6-[1-[[6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基]甲基]三唑-4-基]嘧啶-4-基]-2-甲基苯甲腈；6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1,2,4-三嗪-3-胺；5-溴-2,6-二(1h-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；和eos100850。
[0279]
在一些实施方案中，抑制剂选自由以下组成的组：7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-[[6-[[(3s)-氧杂环戊烷-3-基]氧基甲基]吡啶-2-基]甲基]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺；3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈；3-[2-氨基-6-[1-[[6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基]甲基]三唑-4-基]嘧啶-4-基]-2-甲基苯甲腈；6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1,2,4-三嗪-3-胺；5-溴-2,6-二(1h-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；和eos100850。
[0280]
在前述方法的一些实施方案中，癌症具有高腺苷特征。在前述方法的一些实施方案中，癌症是头颈癌、结肠直肠癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌或肾细胞癌。
附图说明
[0281]
图1a示出了人源化cl25抗体cl_hu10-4、hzcl25、cl25_hu_10-6和cl25_hu_11-4的重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)氨基酸序列。
[0282]
图1b示出了人源化cl25抗体cl25_hu_11-5、cl25_hu_11-6、cl25_hu_8-4和cl25_
hu_8-5的vh和vl氨基酸序列。
[0283]
图1c示出了人源化cl25抗体cl25_hu_8-6、cl25_hu_9-4、cl25_hu_9-5和cl25_hu_9-6的vh和vl氨基酸序列。
[0284]
图1d示出了cl25与人源化cl25抗体的vh的比对。根据imgt定义的cdr是加下划线的。
[0285]
图1e示出了cl25与人源化cl25抗体的vl的比对。根据imgt定义的cdr是加下划线的。
[0286]
图2a是描绘指示抗体在指示浓度下在mda-mb-231细胞上的细胞结合(通过几何平均荧光强度[gmfi]所测量)的图。
[0287]
图2b是描绘cl25或同种型对照(iso ctrl)在指示浓度下在a375细胞上的细胞结合(通过gmfi所测量)的图。
[0288]
图3a是描绘细胞cd73对用指示抗体或同种型对照(iso ctrl)在指示浓度下处理的a375细胞的抑制的图。
[0289]
图3b是描绘细胞cd73对用指示抗体或同种型对照(iso ctrl)在指示浓度下处理的mda-mb-231细胞的抑制的图。
[0290]
图3c是描绘细胞cd73对用指示抗体或同种型对照(iso ctrl)在指示浓度下处理的mda-mb-231细胞的抑制的图。
[0291]
图4是描绘用指示抗体或同种型对照(iso ctrl)在指示浓度下处理的重组cd73的抑制的图。
[0292]
图5是人cd73的晶体结构(4h2f.pdb)的图，其中cl25抗体表位以深灰色(带箭头)指示。
[0293]
图6是描绘在与指示抗体或同种型对照(iso ctrl)一起孵育24小时之后或在无处理(nt)下的表面cd73水平的图，如用直接缀合的非竞争性抗体所测量。
[0294]
图7a是描绘抗体3-f03在指示浓度下在mda-mb-231细胞上的细胞结合(gmfi)的图。
[0295]
图7b是描绘3-f03或同种型对照(iso ctrl)在指示浓度下在a375细胞上的细胞结合(通过gmfi所测量)的图。
[0296]
图8a是描绘细胞cd73对用3-f03或同种型对照(iso ctrl)在指示浓度下处理的a375细胞的抑制的图。
[0297]
图8b是描绘细胞cd73对用3-f03或同种型对照(iso ctrl)在指示浓度下处理的mda-mb-231细胞的抑制的图。
[0298]
图9是描绘用3-f03或同种型对照(iso control)在指示浓度下处理的重组cd73的抑制的图。
[0299]
图10是人cd73的晶体结构(4h2f.pdb)的图，其中3-f03抗体表位以深灰色(带箭头)指示。
[0300]
图11是描绘在与3-f03、同种型对照(iso ctrl)一起孵育24小时之后或在无处理(nt)下的cd73表面水平的图，如用直接缀合的非竞争性抗体cl43-dy650所测量。
[0301]
图12a-图12j示出了3-f03和示例性3-f03变体的vh和vl氨基酸序列。
[0302]
图13是描绘指示抗体在指示浓度下在mda-mb-231细胞上的细胞结合(gmfi)的图。
[0303]
图14是描绘细胞cd73对用指示抗体或同种型对照在指示浓度下处理的mda-mb-231细胞的抑制的图。
[0304]
图15示出了具有n297a突变的人igg1重链ch1-铰链-ch2-ch3(seq id no:73)、具有含c末端赖氨酸的n297a突变的人igg1重链ch1-铰链-ch2-ch3(seq id no:75)和人κ轻链恒定区(seq id no:74)的示例性氨基酸序列。
[0305]
图16a是示出在用以下各项处理的cd4
+
t细胞中的ifnγ均相时间分辨荧光(htrf)信号比的图：(i)滴定的hzcl25，(ii)滴定的化合物9，或(iii)滴定的hzcl25和0.5μm化合物9。
[0306]
图16b是示出在用以下各项处理的cd4
+
t细胞中的ifnγhtrf信号比的图：(i)滴定的抗体a，(ii)滴定的化合物9，或(iii)滴定的抗体a和0.5μm化合物9。
[0307]
图16c是示出在用以下各项处理的cd4
+
t细胞中的ifnγhtrf信号比的图：(i)滴定的抗体b，(ii)滴定的化合物9，或(iii)滴定的抗体b和0.5μm化合物9。
[0308]
图17a是示出在用以下各项处理的cd4+t细胞中的ifnγhtrf信号比的图：(i)滴定的hzcl25，(ii)滴定的化合物9，或(iii)滴定的化合物9和1μg/ml hzcl25。
[0309]
图17b是示出在用以下各项处理的cd4+t细胞中的ifnγhtrf信号比的图：(i)滴定的hzcl25，(ii)滴定的化合物a，或(iii)滴定的化合物a和1μg/ml hzcl25。
[0310]
图17c是示出在用以下各项处理的cd4+t细胞中的ifnγhtrf信号比的图：(i)滴定的hzcl25，(ii)滴定的化合物b，或(iii)滴定的化合物b和1μg/ml hzcl25。
[0311]
图18a是示出在用以下各项处理的供体细胞中的cd4
+
t增殖百分比的图：(i)滴定的化合物9，(ii)滴定的hzcl25，或(iii)滴定的hzcl25和0.5μm化合物9。
[0312]
图18b是示出在用以下各项处理的供体细胞中的cd4+t增殖百分比的图：(i)滴定的化合物9，(ii)滴定的抗体a，或(iii)滴定的抗体a和0.5μm化合物9。
[0313]
图18c是示出在用以下各项处理的供体细胞中的cd4+t增殖百分比的图：(i)滴定的化合物9，(ii)滴定的抗体b，或(iii)滴定的抗体b和0.5μm化合物9。
[0314]
图19a是描绘在施用以下各项的小鼠中的肿瘤体积的图：(i)人igg1和媒介物(圆形)，或(ii)hzcl25和化合物9(方形)。
[0315]
图19b是描绘在施用以下各项的小鼠中的肿瘤体积的图：(i)人igg1和媒介物(圆形)，或(ii)3-f03_413和化合物9(方形)。
[0316]
图20a示出了编码hzcl25重链和轻链的dna序列。
[0317]
图20b示出了编码3-f03_411重链的dna序列。
[0318]
图20c示出了编码3-f03_411和3-f03_413轻链以及3-f03_413重链的dna序列。
具体实施方式
[0319]
本文提供了组合疗法，其包括施用cd73抑制剂与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂。所公开的组合疗法可用于治疗与a2a和/或a2b腺苷受体和/或cd73的活性相关的疾病，包括例如癌症、炎性疾病、心血管疾病和神经退行性疾病。还公开了cd73抑制剂和a2a/a2b腺苷受体抑制剂。
[0320]
cd73
[0321]
cd73(也称为“5'-核苷酸酶”和“外-5'-核苷酸酶”)是二聚酶(ec:3.1.3.5)，其充
当通过gpi键联与质膜外表面结合的同源二聚体。cd73可脱落，并在循环中作为可溶性蛋白具有活性。cd73催化胞外amp转化为腺苷。cd73的酶促活性要求底物以开放的cd73构象结合。底物结合后，cd73经历从开放构象向封闭构象的大构象变化，以将amp转化为腺苷(参见例如knapp等人,2012,structure,20(12):2161-73)。cd73还充当细胞粘附分子，并且在白细胞运输的调控中发挥作用。
[0322]
cd73酶促活性在癌症的促进和转移中发挥作用(参见例如stagg和smyth,2010,oncogene,29:5346-5358；salmi和jalkanen,2012,oncoimmunology,1:247-248,2012；stagg,2012,oncoimmunology,1:217-218；zhang,2012,oncoimmunology,167-70)。cd73在癌细胞中的过表现削弱适应性抗肿瘤免疫反应，增强肿瘤生长和转移(参见例如等人,2004,j.immunol.,172:1646-1653；sadej等人,2006,nucleosides nucleotides nucleic acids,25:1119-1123；braganhol等人,2007,biochim.biophys.acta.,1770:1352-1359；zhang,2010,cancer res.,70:6407-6411；zhang,2012,oncoimmunology,1:67-70)。
[0323]
成熟人cd73蛋白(genbank登录号np_002517的氨基酸27-549)的示例性氨基酸序列是：
[0324][0325]
成熟鼠cd73蛋白(genbank登录号np_035981的氨基酸29-551)的示例性氨基酸序列是：
[0326][0327]
成熟食蟹猴cd73蛋白的示例性氨基酸序列是：
[0328]
[0329]
抗cd73抗体
[0330]
本公开提供抗cd73抗体，其可与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂组合用于治疗疾病，例如癌症。这些抗cd73抗体可结合人cd73。
[0331]
在一些情况下，这些抗体结合人cd73和食蟹猴cd73。在一些情况下，这些抗体结合人cd73和食蟹猴cd73并且不结合鼠cd73。此类抗cd73抗体包括抗cd73单克隆抗体cl25及其人源化型式hzcl25的序列，其人源化型式与人和食蟹猴cd73均以高亲和力结合，并且与小鼠cd73具有不可检测的结合。
[0332]
在一些情况下，这些抗体结合人cd73、食蟹猴cd73和鼠cd73。此类抗cd73抗体包括人抗cd73单克隆抗体3-f03的序列，其与人、食蟹猴和鼠cd73的每一个的开放构象以高亲和力结合。
[0333]
抗体hzcl25
[0334]
抗体hzcl25是人源化igg1/κ单克隆抗体，其在重链恒定区的天冬酰胺-297(n297，根据eu编号)位置处具有丙氨酸以降低效应子功能。它以高亲和力(kd≤0.5nm)特异性结合人和食蟹猴cd73并且具有低效应子功能性。
[0335]
hzcl25由cl25抗体的嵌合型式构建。cl25鼠重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)从用包含his-标签的重组人cd73(seq id no:70)免疫的小鼠获得。确定b细胞的抗体序列并且将鼠重链可变结构域(vh)(seq id no:26)和轻链可变结构域(vl)(seq id no:27)表达为具有人igg1 fc(包含seq id no:73的氨基酸序列的重链恒定区和包含seq id no:74的氨基酸序列的κ轻链恒定区)的嵌合体。下表1示出了根据imgt、chothia、abm、kabat和contact编号的cl25互补决定区(cdr)的氨基酸序列。下表1还示出了cl25成熟vh和vl的氨基酸序列。
[0336]
表1.cl25 cdr、vh和vl
[0337][0338]
为了构建hzcl25，将cl25 vh和vl序列与人vh和vk基因的数据库比对。将来自鼠cl25抗体的cdr(表1)接枝至人vh和vk基因中。
[0339]
下表2示出了根据imgt、chothia、abm、kabat和contact编号的hzcl25 cdr的氨基酸序列。下表2还示出了hzcl25成熟vh、vl、重链和轻链的氨基酸序列。
[0340]
表2.hzcl25 cdr、vh、vl、重链和轻链的氨基酸序列
[0341]
[0342][0343]
抗cd73抗体可涵盖hzcl25或cl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3以及vl cdr 1、vl cdr2和vl cdr3。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见表2)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见表2)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见表2)以及含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见表2)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有cl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见表1)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有cl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见表1)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有cl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见表1)以及含有cl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见表1)。在一些情况下，抗cd73抗体可在hzcl25或cl25的六个cdr的一个或多个(即1、2、3、4、5或6个)中具有例如1、2或3个取代。在一些情况下，抗体(i)抑制细胞cd73(例如，如通过例如实施例3中所描述的测定所测定，与同种型对照相比细胞cd73活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(ii)抑制可溶性cd73(例如，如通过例如实施例4中所描述的测定所测定，与同种型对照相比可溶性cd73活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(iii)以高亲和力(例如kd≤0.5nm)结合呈开放构象的人或食蟹猴cd73，但不显著结合来自小鼠的呈开放构象的cd73(例如，如通过实施例5中所描述的结合测定所测定)；和/或(iv)以高亲和力(例如kd≤0.5nm)结合呈封闭构象的人或食蟹猴cd73，但不显著结合来自小鼠的呈封闭构象的cd73；和/或(v)结合至seq id no:70的氨基酸40-53内(即tkvqqirraepnvl(seq id no:76)内)的表位(例如，如通过实施例5中所描述的结合测定所测定)；和/或(vi)减少amp介导的t细胞增殖抑制(例如，如通过例如实施例16中所描述的测定所测定，与同种型对照相比t细胞增殖减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(vii)降低细胞表面cd73的水平(与同种型对照相比，例如在癌细胞上，例如在黑色素瘤癌细胞上降低了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(viii)减少肿瘤生长(例如，如通过例如实施例17中所描述的测定所测定，与同种型对照相比黑色素瘤减少了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(ix)减少细胞上的游离表面cd73(与同种型对照相比，
例如癌细胞，例如黑色素瘤癌减少了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)。
[0344]
抗cd73抗体可包含hzcl25或cl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，根据imgt定义或替代cdr定义，诸如但不限于kabat定义、chothia定义、abm cdr定义或接触定义。这些抗cd73抗体可在hzcl25或cl25的vh cdr1和/或vh cdr2和/或vh cdr3中包含零个、一个、两个或三个取代。在一些实施方案中，抗cd73抗体还包含hzcl25或cl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，根据imgt定义或替代cdr定义，诸如但不限于kabat定义、chothia定义、abm cdr定义或接触定义。这些抗cd73抗体可在hzcl25或cl25的vl cdr1和/或vl cdr2和/或vl cdr3中包含零个、一个、两个或三个取代。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:1、2和3中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:4、5和6中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:7、8和9中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:10、11和6中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:12、13和9中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:10、11和6中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:14、15和9中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:10、11和6中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:16、17和18中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:19、20和21中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:7、8和9中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:10、29和6中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:12、13和9中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:10、29和6中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:14、15和9中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:10、29和6中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:16、28和18中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:19、20和21中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，这些抗体(i)抑制细胞cd73(例如，如通过例如实施例3中所描述的测定所测定，与同种型对照相比细胞cd73活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(ii)抑制可溶性cd73(例如，如通过例如实施例4中所描述的测定所测定，与同种型对照相比可溶性cd73活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(iii)以高亲和力(例如kd≤0.5nm)结合呈开放构象的人或食蟹猴cd73，但不显著结合来自小鼠的呈开放构象的cd73(例如，如通过实施例5中所述的结合测定所测定)；和/或(iv)以高亲和力(例如kd≤0.5nm)结合呈封闭构象的人或食蟹猴cd73，但不显著结合来自小鼠的呈封闭构象的cd73；和/或(v)结合至seq id no:70的氨基酸40-53内(即tkvqqirraepnvl(seq id no:76)内)的表位(例如，如通过实施例5中所述的结合测定所测定)；和/或(vi)减少amp介导的t细胞增殖抑制(例如，如通过例如实施例16中所描述的测定
所测定，与同种型对照相比t细胞增殖减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(vii)降低细胞表面cd73的水平(与同种型对照相比，例如在癌细胞上，例如在黑色素瘤癌细胞上降低了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(viii)减少肿瘤生长(例如，如通过例如实施例17中所描述的测定所测定，与同种型对照相比黑色素瘤减少了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(ix)减少细胞上的游离表面cd73(与同种型对照相比，例如癌细胞，例如黑色素瘤癌减少了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)。
[0345]
在某些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:1-3中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含相对于seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于seq id no:24中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:1-3中列出的氨基酸序列)的重链，其中重链包含相对于seq id no:24中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)的vl，其中vl包含相对于seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于seq id no:25中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)的轻链，其中轻链包含相对于seq id no:25中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)相对于seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)相对于seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定
义，即分别在seq id no:1-3中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含相对于seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)的vl，其中vl包含相对于seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)相对于seq id no:24中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)相对于seq id no:25中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:1-3中列出的氨基酸序列)的重链，其中重链包含相对于seq id no:24中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)的轻链，其中轻链包含相对于seq id no:25中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。
[0346]
在某些实施方案中，抗cd73抗体包含与seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的vh具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:1-3中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含与seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的vh具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含与seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的vl具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)的vl，其中vl包含与seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的vl具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含与seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的vh具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列以及与seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的vl具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同
一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:1-3中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含与seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的vh具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)的vl，其中vl包含与seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的vl具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0347]
在某些实施方案中，抗cd73抗体包含与hzcl25的vh(即seq id no:22中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:1-3中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含与hzcl25的vh(即seq id no:22中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:22中列出的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含与hzcl25的重链(即seq id no:24中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有vh的重链，所述vh包含hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:1-3中列出的氨基酸序列)，其中vh包含与hzcl25的vh(即seq id no:22中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中重链包含与hzcl25的重链(即seq id no:24中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:24中列出的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含与hzcl25的vl(即seq id no:23中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)的vl，其中vl包含与hzcl25的vl(即seq id no:23中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、
至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:23中列出的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含与hzcl25的轻链(即seq id no:25中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有vl的轻链，所述vl包含hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)，其中vl包含与hzcl25的vl(即seq id no:23中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述轻链包含与hzcl25的轻链(即seq id no:25中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:25中列出的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)与hzcl25的vh(即seq id no:22中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；以及(ii)与hzcl25的vl(即seq id no:23中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:1-3中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含与hzcl25的vh(即seq id no:22中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)的vl，其中vl包含与hzcl25的vl(即seq id no:23中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含：含有seq id no:22中列出的氨基酸序列的vh以及(ii)含有seq id no:23中列出的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)与hzcl25的重链(即seq id no:24中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；以及(ii)与hzcl25的轻链(即seq id no:25中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)包含含有hzcl25的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:
1-3中列出的氨基酸序列)的vh的重链，其中重链包含与hzcl25的重链(即seq id no:24中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)包含含有hzcl25的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表1，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:4-6中列出的氨基酸序列)的vl的轻链，其中轻链包含与hzcl25的轻链(即seq id no:25中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)包含seq id no:24中列出的氨基酸序列的重链和(ii)包含seq id no:25中列出的氨基酸序列的轻链。
[0348]
hzcl25的cd73结合表位在氨基酸序列tkvqqirraepnvl(seq id no:76)(即seq id no:70中列出的氨基酸序列的氨基酸40-53)内。本公开提供了结合至序列tkvqqirraepnvl(seq id no:76)内的cd73的抗体。本公开提供了结合至与hzcl25相同的表位的抗体。本公开还提供了竞争性抑制hzcl25与人cd73的结合的抗体。
[0349]
在一些实施方案中，hzcl25的vh连接至包含ch1结构域和铰链区的重链恒定区。在一些实施方案中，hzcl25的vh连接至包含ch3结构域的重链恒定区。在一些实施方案中，ch3结构域缺乏c末端赖氨酸(k)氨基酸残基。在一些实施方案中，ch3结构域含有c末端赖氨酸(k)氨基酸残基。在某些实施方案中，hzcl25的vh连接至重链恒定区，所述重链恒定区包含来自人igg1的ch1结构域、铰链区、ch2结构域和ch3结构域。在一些实施方案中，来自人igg1的ch3结构域缺乏c末端赖氨酸(k)氨基酸残基。在一些实施方案中，来自人igg1的ch3结构域含有c末端赖氨酸(k)氨基酸残基。在某些实施方案中，此类抗体在重链恒定区中含有提高抗体稳定性的一个或多个另外的突变。在某些实施方案中，重链恒定区包括改变抗体的特性(例如，减少fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与c1q的结合)的取代。在某些实施方案中，重链恒定区在重链恒定区的天冬酰胺-297(n297，根据eu编号)位置处包括丙氨酸以降低效应子功能。
[0350]
在某些实施方案中，抗cd73抗体是igg抗体。在一个实施方案中，抗体是igg1抗体。在一个实施方案中，抗体是igg4抗体。在另一实施方案中，抗体是igg2抗体。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于野生型重链恒定区缺乏一个或多个赖氨酸(k)氨基酸残基的重链恒定区。例如，在某些实施方案中，抗体包含缺乏重链恒定区的ch3结构域的c末端赖氨酸(k)氨基酸残基的重链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含具有seq id no:73中列出的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含具有seq id no:75中列出的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含具有seq id no:74中列出的氨基酸序列的轻链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含具有seq id no:73中列出的氨基酸序列的重链恒定区和具有seq id no:74中列出的氨基酸序列的轻链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含具有seq id no:75中列出的氨基酸序列的重链恒定区和具有seq id no:74中列出的氨基酸序列的轻链恒定区。
[0351]
抗体3-f03
[0352]
抗体3-f03是人igg1/κ单克隆抗体，其在重链恒定区的天冬酰胺-297(n297，根据eu编号)位置处具有丙氨酸以降低效应子功能。3-f03以高亲和力(kd≤2nm)特异性结合人、
食蟹猴和鼠cd73并且具有低效应子功能。
[0353]
3-f03是由通过单个供体文库的多轮选择获得的序列工程化的。然后将来自此池的scfv盒重组至酵母展示载体文库中，用鼠cd73(seq id no:71)对其进行fac选择。酵母3-f03 scfv盒的氨基酸序列分别在seq id no:77和65中列出：
[0354]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssydmhwvrqapgkglewvavmsydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycateiaakgdywgqgtlvtvss(seq id no:77)；和
[0355]
aiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgisnylawyqqkpgkapklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystphfgqgtrleik(seq id no:65)。
[0356]
为了构建3-f03抗体，将酵母3-f03 vh和vl如下进行修饰并克隆至人igg1/κ支架中。对于vh，去除酵母3-f03 vh(seq id no:77)的n末端谷氨酸(e)，并且用丙氨酸(a)取代seq id no:77的kabat位置h77(即seq id no:77的位置78)处的苏氨酸(t)。对于vl，去除seq id no:65的n末端丙氨酸(a)。所产生的全长人3-f03抗体含有分别在seq id no:60和61的氨基酸序列中列出的vh和vl。所产生的全长人3-f03抗体在本文中被称为“3-f03”。下表3示出了根据imgt、chothia、abm、kabat和contact编号的3-f03 cdr的氨基酸序列。下表3还示出了3-f03成熟vh、vl、重链和轻链的氨基酸序列。
[0357]
表3.3-f03 cdr、vh和vl的氨基酸序列
[0358]
[0359][0360]
本文中描述还3-f03的变体。3-f03_411与3-f03相同，不同的是3-f03_411重链(i)含有3-f03中缺乏的n末端谷氨酸(e)和(ii)不包括3-f03中存在的c末端赖氨酸。下表4示出了3-f03_411成熟vh、vl、重链和轻链的氨基酸序列。3-f03_413与3-f03_411相同，不同的是其在vh kabat位置h53(seq id no:60的位置54)处含有谷氨酸(e)代替天冬氨酸(d)。下表5示出了根据imgt、chothia、abm、kabat和contact编号的3-f03_413cdr的氨基酸序列。下表5还示出了3-f03_413成熟vh、vl、重链和轻链的氨基酸序列。另外的变体描述于以下实施例中(参见图12a-图12j)。
[0361]
表4.3-f03_411hc和lc的氨基酸序列
[0362][0363]
表5.3-f03_413cdr、vh、vl、hc、lc的氨基酸序列
[0364]
[0365][0366]
抗cd73抗体可涵盖3-f03或3-f03_413的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3以及vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有3-f03的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见表3)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有3-f03的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见表3)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有3-f03的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见表3)以及含有3-f03的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见表3)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有3-f03_413的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见表5)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有3-f03_413的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见表5)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有3-f03_413的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见表5)以及含有3-f03_413的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见表5)。在一些情况下，抗cd73抗体可在3-f03或3-f03_413的六个cdr的一个或多个(即1、2、3、4、5或6个)中具有例如1、2或3个取代。在一些情况下，这些抗体(i)抑制细胞cd73(例如，如通过例如实施例10中所描述的测定所测定，与同种型对照相比细胞cd73活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(ii)抑制可溶性cd73(例如，如通过例如实施例11中所描述的测定所测定，与同种型对照相比可溶性cd73活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(iii)以高亲和力(例如kd≤2nm)结合呈开放构象的人、食蟹猴或鼠cd73(例如，如通过实施例12中所描述的结合测定所测定)；和/或(iv)不结合呈封闭构象的人、食蟹猴或鼠cd73；和/或(v)结合至seq id no:70的氨基酸386-399内(即aavlpfggtfdlvq
(seq id no:78)内)seq id no:70的氨基酸470-489内(即ilpnflanggdgfqmikdel(seq id no:79)内)的表位(例如，如通过实施例12中所描述的结合测定所测定)；和/或(vi)减少amp介导的t细胞增殖抑制(例如，如通过例如实施例16中所描述的测定所测定，与同种型对照相比t细胞增殖减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(vii)降低细胞表面cd73的水平(与同种型对照相比，例如在癌细胞上，例如在黑色素瘤癌细胞上降低了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(viii)减少肿瘤生长(例如，如通过例如实施例17中所描述的测定所测定，与同种型对照相比黑色素瘤减少了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)。
[0367]
抗cd73抗体可包含3-f03或3-f03_413的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，根据imgt定义或替代cdr定义，诸如但不限于kabat定义、chothia定义、abm cdr定义或接触定义。这些抗cd73抗体可在3-f03或3-f03_413的vh cdr1和/或vh cdr2和/或vh cdr3中包含零个、一个、两个或三个取代。在一些实施方案中，抗cd73抗体还包含3-f03或3-f03_413的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，根据imgt定义或替代cdr定义，诸如但不限于kabat定义、chothia定义、abm cdr定义或接触定义。这些抗cd73抗体可在3-f03或3-f03_413的vl cdr1和/或vl cdr2和/或vl cdr3中包含零个、一个、两个或三个取代。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:34、35和36中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:37、38和39中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:41、42和52中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:44、45和39中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:46、47和52中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:44、45和39中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:49、50和52中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:44、45和39中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:53、54和56中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:57、58和59中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:34、40和36中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:37、38和39中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:41、43和52中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:44、45和39中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:46、48和52中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:44、45和39中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:49、51和52中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:44、45和39中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有分别在seq id no:53、55和56中列出的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh以及含有分别在seq id no:57、58和59中列出的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl。在一些情况下，这些抗体
(i)抑制细胞cd73(例如，如通过例如实施例10中所描述的测定所测定，与同种型对照相比细胞cd73活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(ii)抑制可溶性cd73(例如，如通过例如实施例11中所描述的测定所测定，与同种型对照相比可溶性cd73活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(iii)以高亲和力(例如kd≤2nm)结合呈开放构象的人、食蟹猴或鼠cd73(例如，如通过实施例12中所描述的结合测定所测定)；和/或(iv)不结合呈封闭构象的人、食蟹猴或鼠cd73；和/或(v)结合至seq id no:70的氨基酸386-399内(即aavlpfggtfdlvq(seq id no:78)内)seq id no:70的氨基酸470-489内(即ilpnflanggdgfqmikdel(seq id no:79)内)的表位(例如，如通过实施例12中所描述的结合测定所测定)；和/或(vi)减少amp介导的t细胞增殖抑制(例如，如通过例如实施例16中所描述的测定所测定，与同种型对照相比t细胞增殖减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(vii)降低细胞表面cd73的水平(与同种型对照相比，例如在癌细胞上，例如在黑色素瘤癌细胞上降低了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)；和/或(viii)减少肿瘤生长(例如，如通过例如实施例17中所描述的测定所测定，与同种型对照相比黑色素瘤减少了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)。
[0368]
在某些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见，例如表3和表5，例如根据imgt定义，例如分别在seq id no:34-36或分别在seq id no:34、40和36中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含相对于seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于seq id no:30、33和66中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见，例如表3和表5，例如根据imgt定义，例如分别在seq id no:34-36或分别在seq id no:34、40和36中列出的氨基酸序列)的重链，其中重链包含相对于seq id no:30、33和66中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见，例如表3和表5，例如根据imgt定义，例如分别在seq id no:37-39中列出的氨基酸序列)的vl，其中vl包含相对于seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/
或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于seq id no:31中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见，例如表3和表5，例如根据imgt定义，例如分别在seq id no:37-39中列出的氨基酸序列)的轻链，其中轻链包含相对于seq id no:31中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)相对于seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)相对于seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)含有3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见，例如表3和表5，例如根据imgt定义，例如分别在seq id no:34-36或分别在seq id no:34、40和36中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含相对于seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)含有3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见，例如表3和表5，例如根据imgt定义，例如分别在seq id no:37-39中列出的氨基酸序列)的vl，其中vl包含相对于seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)相对于seq id no:30、33和66中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)相对于seq id no:31中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)含有3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见，例如表3和表5，例如根据imgt定义，例如分别在seq id no:34-36或分别在seq id no:34、40和36中列出的氨基酸序列)的重链，其中重链包含相对于seq id no:30、33和66中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)含有3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见，例如表3和表5，例如根据imgt定义，例如分别在seq id no:37-39中列出的氨基酸序列)的轻链，其中轻链包含相对于seq id no:31中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。
[0369]
在某些实施方案中，抗cd73抗体包含与seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的vh具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见，例如表3和表5，例如根据imgt定义，例如分别在seq id no:34-36或分别在seq id no:34、40和36中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含与seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中
no:34、40和36中列出的氨基酸序列)的vh，其中vh包含与3-f03_411的vh(即seq id no:63中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:62中列出的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:63中列出的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含与3-f03_411或3-f03_f13的重链(即分别在seq id no:30或33中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有vh的重链，所述vh包含3-f03_411的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表3，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:34-36中列出的氨基酸序列)，其中重链包含与3-f03_411的重链(即seq id no:30中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有vh的重链，所述vh包含3-f03_413的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表5，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:34、40和36中列出的氨基酸序列)，其中重链包含与3-f03_413的重链(即seq id no:33中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:30中列出的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:33中列出的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含与3-f03_411或3-f03_413的vl(即seq id no:61中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有3-f03_411或3-f03_413的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表3，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:37-39中列出的氨基酸序列)的vl，其中vl包含与3-f03_411或3-f03_413的vl(即在seq id no:61中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:61中列出的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含与3-f03_411或3-f03_413的轻链(即seq id no:31中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含含有vl的轻链，所述vl包含3-f03_411或3-f03_413的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表5，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:37-39中列出的氨基酸序列)，其中轻链包含与3-f03_411或3-f03_413的轻链(即在seq id no:31中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少
no:34-36中列出的氨基酸序列)的vh的重链，其中重链包含与3-f03_411的重链(即seq id no:30中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)包含含有3-f03_411的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表3，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:37-39中列出的氨基酸序列)的vl的轻链，其中轻链包含与3-f03的轻链(即seq id no:31中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)包含含有3-f03_413的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见表5，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:34、40和36中列出的氨基酸序列)的vh的重链，其中重链包含与3-f03的重链(即seq id no:33中列出的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)包含含有3-f03_413的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见表5，例如根据imgt定义，即分别在seq id no:37-39中列出的氨基酸序列)的vl的轻链，其中轻链包含与3-f03_413(即seq id no:31中列出的氨基酸序列)的轻链具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)包含seq id no:30中列出的氨基酸序列的重链；和(ii)包含seq id no:31中列出的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，抗cd73抗体包含：(i)包含seq id no:33中列出的氨基酸序列的重链；和(ii)包含seq id no:31中列出的氨基酸序列的轻链。
[0371]
3-f03(及其变体，例如3-f03_411和3-f03_413)的cd73结合表位含有aavlpfggtfdlvq(seq id no:78)(即seq id no:70中列出的氨基酸序列的氨基酸386-399)和ilpnflanggdgfqmikdel(seq id no:79)(即seq id no:70中列出的氨基酸序列的氨基酸470-489)。本公开提供了结合至aavlpfggtfdlvq(seq id no:78)和ilpnflanggdgfqmikdel(seq id no:79)内的cd73表位的抗体。本公开提供了结合至与3-f03(或其变体，例如3-f03_411或3-f03_413)相同的表位的抗体。本公开还提供了竞争性抑制3-f03(或其变体，例如3-f03_411或3-f03_413)与人cd73的结合的抗体。
[0372]
在一些实施方案中，3-f03(或其变体，例如3-f03_411或3-f03_413)的vh连接至包含ch1结构域和铰链区的重链恒定区。在一些实施方案中，3-f03(或其变体，例如3-f03_411或3-f03_413)的vh连接至包含ch3结构域的重链恒定区。在一些实施方案中，ch3结构域缺乏c末端赖氨酸(k)氨基酸残基。在一些实施方案中，ch3结构域含有c末端赖氨酸(k)氨基酸残基。在某些实施方案中，3-f03(或其变体，例如3-f03_411或3-f03_413)的vh连接至重链恒定区，所述重链恒定区包含来自人igg1的ch1结构域、铰链区、ch2结构域和ch3结构域。在一些实施方案中，来自人igg1的ch3结构域缺乏c末端赖氨酸(k)氨基酸残基。在一些实施方案中，来自人igg1的ch3结构域含有c末端赖氨酸(k)氨基酸残基。在某些实施方案中，此类抗体在重链恒定区中含有提高抗体稳定性的一个或多个另外的突变。在某些实施方案中，重链恒定区包括修饰抗体的特性(例如，减少fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与
c1q的结合)的取代。在某些实施方案中，重链恒定区在重链恒定区的天冬酰胺-297(n297，根据eu编号)位置处包括丙氨酸(a)以降低效应子功能。
[0373]
在某些实施方案中，抗cd73抗体是igg抗体。在一个实施方案中，抗体是igg1抗体。在一个实施方案中，抗体是igg4抗体。在另一实施方案中，抗体是igg2抗体。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含相对于野生型重链恒定区缺乏一个或多个赖氨酸(k)氨基酸残基的重链恒定区。例如，在某些实施方案中，抗体包含缺乏重链恒定区的ch3结构域的c末端赖氨酸(k)氨基酸残基的重链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:73中列出的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:75中列出的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:74中列出的氨基酸序列的轻链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:73中列出的氨基酸序列的重链恒定区和含有seq id no:74中列出的氨基酸序列的轻链恒定区。在某些实施方案中，抗cd73抗体包含含有seq id no:75中列出的氨基酸序列的重链恒定区和含有seq id no:74中列出的氨基酸序列的轻链恒定区。
[0374]
另外的抗cd73抗体和抑制剂
[0375]
本公开提供另外的抗cd73抗体和cd73抑制剂，其可与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂组合用于治疗疾病，例如癌症。
[0376]
可在本文所述的方法中与a2a和/或a2b腺苷受体组合使用的其他抗cd73抗体是本领域已知的。参见，例如美国专利号9,090,697、9,388,249、9,605,080、9,938,356、10,100,129和10,287,362，美国专利申请公布号2004/0142342、2007/0009518、2011/0300136、2018/0009899、2018/0030144、2018/0237536、2018/0264107、2019/0031766、2019/0225703、2019/0077873和2019/0256598，以及国际专利申请公布号wo 2004/079013、wo 2011/089004、wo 2014/153424、wo 2017/100670、wo 2001/080884、wo 2018/110555、wo 2018/137598、wo 2018/187512、wo 2018/215535、wo 2018/237173、wo 2019/170131、wo 2019/173692和wo 2019/173291，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
[0377]
在一些情况下，抗cd73抗体包含vh，所述vh包含含有氨基酸序列eiqlqqsgpelvkpgasvkvsckasgyaftsynmywvkqshgkslewigyidpynggtsynqkfkgkatltvdkssstaymhlnsltsedsavyycargygnykawfaywgqgtlvtvsa(seq id no:100)的vh的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；以及vl，所述vl包含含有氨基酸序列davmtqtpkfllvsagdrvtitckasqsvtndvawyqqkpgqspklliyyasnrytgvpdrftgsgygtdftftistvqaedlavyfcqqdyssltfgagtklelk(seq id no:101)的vl的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有seq id no:100中列出的氨基酸序列的vh和含有seq id no:101中列出的氨基酸序列的vl。在一些情况下，抗cd73抗体是11e1(参见美国专利申请公布号2018/0237536，所述专利以引用的方式整体并入本文)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有seq id no:102中列出的氨基酸序列的重链。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有seq id no:103中列出的氨基酸序列的轻链。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有seq id no:102中列出的氨基酸序列的重链和含有seq id no:103中列出的氨基酸序列的轻链。
[0378]
在一些情况下，抗cd73抗体包含vh，所述vh包含含有氨基酸序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyayswvrqapgkglewvsaisgsggrtyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarlgygrvdewgrgtlvtvss(seq id no:96)的vh的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；以及
vl，所述vl包含含有氨基酸序列qsvltqppsasgtpgqrvtiscsgslsnigrnpvnwyqqlpgtapklliyldnlrlsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycatwddshpgwtfgggtkltvl(seq id no:97)的vl的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有seq id no:96中列出的氨基酸序列的vh和含有seq id no:97中列出的氨基酸序列的vl。在一些情况下，抗cd73抗体是medi9447(参见美国专利号10,287,362，所述专利以引用的方式整体并入本文)。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有seq id no:98中列出的氨基酸序列的重链。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有seq id no:99中列出的氨基酸序列的轻链。在一些情况下，抗cd73抗体包含含有seq id no:98中列出的氨基酸序列的重链和含有seq id no:99中列出的氨基酸序列的轻链。
[0379]
在一些情况下，cd73抑制剂是cpi-006(corvus；参见美国专利申请公布号us 2018/0009899 a1和国际专利申请公布号wo 2017/100670 a1，所述专利各自以引用的方式整体并入本文)。
[0380]
在一些情况下，cd73抑制剂是cb-708 sm(calithera)。
[0381]
在一些情况下，cd73抑制剂是ab680(arcus)。
[0382]
在一些情况下，cd73抑制剂是bms-986179(bms)。
[0383]
抗体片段
[0384]
在一些情况下，抗cd73抗体是抗体片段。本文所述的抗体片段(例如fab、fab
′
、f(ab
′
)2、facb和fv)可通过完整抗体的蛋白水解消化来制备。例如，抗体片段可通过用酶诸如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶处理整个抗体而获得。整个抗体的木瓜蛋白酶消化产生f(ab)2或fab片段；整个抗体的胃蛋白酶消化产生f(ab
′
)2或fab
′
；并且整个抗体的纤溶酶消化产生facb片段。
[0385]
或者，抗体片段可重组产生。例如，编码所关注的抗体片段的核酸可被构建，引入表达载体中，并在合适的宿主细胞中表达。参见，例如co,m.s.等人,j.immunol.,152:2968-2976(1994)；better,m.和horwitz,a.h.,methods in enzymology,178:476-496(1989)；plueckthun,a.和skerra,a.,methods in enzymology,178:476-496(1989)；lamoyi,e.,methods in enzymology,121:652-663(1989)；rousseaux,j.等人,methods in enzymology,(1989)121:663-669(1989)；以及bird,r.e.等人,tibtech,9:132-137(1991))。抗体片段可在大肠杆菌(e.coli)中表达并从大肠杆菌分泌，因此允许容易地产生大量这些片段。抗体片段可从抗体噬菌体文库中分离。或者，可直接从大肠杆菌回收fab
′‑
sh片段并化学偶联以形成f(ab)2片段(carter等人,bio/technology,10:163-167(1992))。根据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离f(ab
′
)2片段。包含补救受体结合表位残基且体内半衰期增加的fab和f(ab
′
)2片段描述于美国专利号5,869,046中。
[0386]
微抗体
[0387]
在一些情况下，抗cd73抗体是微抗体。抗cd73抗体的微抗体包括双抗体、单链(scfv)和单链(fv)2(sc(fv)2)。
[0388]“双抗体”是通过基因融合构建的二价微抗体(参见，例如holliger,p.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,90:6444-6448(1993)；ep404,097；wo 93/11161)。双抗体是由两条多肽链构成的二聚体。双抗体的每条多肽链的vl与vh结构域通过接头结合。构成接头的氨基酸残基的数目可在2至12个残基之间(例如3-10个残基或五个或约五个残基)。双
抗体中多肽的接头通常太短以致于不允许vl与vh彼此结合。因此，在相同多肽链中编码的vl和vh不能形成单链可变区片段，而是与不同的单链可变区片段形成二聚体。因此，双抗体具有两个抗原结合位点。
[0389]
scfv是通过用接头将vh和vl连接而获得的单链多肽抗体(参见，例如huston等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,85:5879-5883(1988)；以及plickthun,“the pharmacology of monoclonal antibodies”第113卷,resenburg和moore编,springer verlag,new york,第269-315页,(1994))。vh与vl的连接顺序没有特别限制，并且可以任何顺序排列。排列的实例包括：[vh]接头[vl]；或[vl]接头[vh]。scfv中重链可变结构域和轻链可变结构域可衍生自本文所述的任何抗cd73抗体。
[0390]
sc(fv)2是微抗体，其中两个vh与两个vl通过接头连接形成单链(hudson,等人,j.immunol.methods,(1999)231:177-189(1999))。例如，可通过将scfv与接头连接来制备sc(fv)2。本发明的sc(fv)2包括抗体，优选其中两个vh与两个vl按以下顺序排列：vh、vl、vh和vl([vh]接头[vl]接头[vh]接头[vl])，从单链多肽的n末端开始；然而，两个vh与两个vl的顺序不限于上述排列，并且它们可以任何顺序排列。
[0391]
双特异性抗体
[0392]
在一些情况下，抗cd73抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可结合至cd73蛋白的两个不同表位。其他此类抗体可将cd73结合位点与另一蛋白质的结合位点组合。可将双特异性抗体制备为全长抗体或其低分子量形式(例如f(ab
′
)2双特异性抗体、sc(fv)2双特异性抗体、双抗体双特异性抗体)。
[0393]
全长双特异性抗体的传统产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(millstein等人,nature,305:537-539(1983))。根据不同的方法，将具有所期望结合特异性的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。将编码免疫球蛋白重链融合物和在需要时免疫球蛋白轻链的dna插入单独的表达载体中，并共转染至合适的宿主细胞中。由此在调节三个多肽片段的比例方面提供更大灵活性。然而，当以相等比率表达至少两条多肽链导致高产率时，可能在单一表达载体中插入两条或所有三条多肽链的编码序列。
[0394]
根据美国专利号5,731,168中描述的另一种方法，在一对抗体分子之间的界面可被工程化以使从重组细胞培养物回收的异源二聚体的百分比最大化。优选界面包含ch3结构域的至少一部分。在此方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个较小氨基酸侧链被更大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链来在第二抗体分子的界面上产生尺寸与大侧链相同或类似的补偿性“腔穴”。这提供了一种用于提高异源二聚体而不是其他不需要的终产物诸如同源二聚体的产率的机制。
[0395]
双特异性抗体包括交联或“异源缀合物”抗体。例如，所述异源缀合物中的一种抗体可偶联至抗生物素蛋白，另一种抗体可偶联至生物素。异源缀合物抗体可使用任何方便的交联方法制备。
[0396]“双抗体”技术为制备双特异性抗体片段提供替代机制。片段包含通过接头连接至vl的vh，所述接头太短以致于不允许在相同的链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个
片段的vh和vl结构域与另一个片段的互补vl和vh结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。
[0397]
多价抗体
[0398]
在一些情况下，抗cd73抗体是多价抗体。多价抗体可通过表达抗体所结合至的抗原的细胞比二价抗体更快地内化(和/或异化)。本文所述的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)，其可容易地通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸而产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。示例性二聚化结构域包含(或由以下组成)fc区或铰链区。多价抗体可包含(或由以下组成)三至约八个(例如四个)抗原结合位点。多价抗体任选地包含至少一条多肽链(例如至少两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，所述多肽链可包含vd1-(x1)
n-vd2-(x2)
n-fc，其中vd1是第一可变结构域，vd2是第二可变结构域，fc是fc区的多肽链，x1和x2表示氨基酸或肽间隔物，并且n是0或1。
[0399]
缀合抗体
[0400]
在一些情况下，抗cd73抗体是缀合抗体。本文所公开的抗体可以是缀合抗体，其结合至各种分子，包括大分子物质，诸如聚合物(例如聚乙二醇(peg)、经peg改性的聚乙烯亚胺(pei)(pei-peg)、聚谷氨酸(pga)(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(hpma)共聚物)、透明质酸、放射性材料(例如
90
y、
131
i)、荧光物质、发光物质、半抗原、酶、金属螯合物、药物和毒素(例如，calcheamicin、假单胞菌外毒素a、蓖麻毒蛋白(例如，去糖基化蓖麻毒蛋白a链))。
[0401]
在一个实施方案中，为了改善抗cd73抗体的细胞毒性作用并因此改善其治疗效果，将抗体与高毒性物质(包括放射性同位素和细胞毒性剂)缀合。这些缀合物可选择性地将毒性负荷递送至靶位点(即表达抗体识别的抗原的细胞)，而抗体未识别的细胞得以保留。为了使毒性最小化，一般基于具有短血清半衰期的分子(因此，使用鼠序列和igg3或igg4同种型)来工程化缀合物。
[0402]
在某些实施方案中，抗cd73抗体经部分修饰，所述部分将所述抗体在循环(例如血液、血清或其他组织)中的稳定性和/或保留改善了例如至少1.5、2、5、10或50倍。例如，抗cd73抗体可与聚合物例如基本上非抗原性聚合物诸如聚环氧烷或聚环氧乙烷缔合(例如缀合)。合适的聚合物将在重量上明显变化。可使用具有在约200至约35,000道尔顿(或约1,000至约15,000和2,000至约12,500)范围内的分子数平均重量的聚合物。例如，抗cd73抗体可缀合至水溶性聚合物，例如亲水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。此类聚合物的实例包括聚环氧烷均聚物，诸如聚乙二醇(peg)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。另外的有用的聚合物包括聚氧化烯，诸如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯和聚氧化乙烯与聚氧化丙烯的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；以及支链或非支链多糖。
[0403]
可通过分别对抗体或本文描述的其较低分子量形式进行化学修饰来制备上述缀合抗体。修饰抗体的方法是本领域众所周知的(例如，us 5,057,313和us 5,156,840)。
[0404]
产生抗体的方法
[0405]
抗体可在细菌或真核细胞中产生。一些抗体(例如fab)可在细菌细胞(例如，大肠杆菌(e.coli)细胞)中产生。抗体还可在诸如转化细胞系(例如cho、293e、cos)的真核细胞中产生。另外，抗体(例如，scfv)可在酵母细胞诸如毕赤醇母(pichia)(参见例如powers等
人,j immunol methods.251:123-35(2001))、汉逊酵母(hanseula)或酿酒酵母(saccharomyces)中表达。为了产生所关注的抗体，构建编码抗体的多核苷酸，将其引入至表达载体中，然后在合适的宿主细胞中表达。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞并回收抗体。
[0406]
如果要在细菌细胞(例如，大肠杆菌)中表达抗体，则表达载体应具有允许载体在细菌细胞中扩增的特征。另外，当将大肠杆菌诸如jm109、dh5α、hb101或xl1-blue用作宿主时，载体必须具有允许在大肠杆菌中实现有效表达的启动子，例如lacz启动子(ward等人,341:544-546(1989)、arab启动子(better等人,science,240:1041-1043(1988))或t7启动子。此类载体的实例包括例如m13系列载体、puc系列载体、pbr322、pbluescript、pcr-script、pgex-5x-1(pharmacia)、“qiaexpress系统”(qiagen)、pegfp和pet(当使用这种表达载体时，宿主优选为表达t7 rna聚合酶的bl21)。表达载体可含有用于抗体分泌的信号序列。用于产生至大肠杆菌的周质中，可将pelb信号序列(lei等人,j.bacteriol.,169:4379(1987))用作用于抗体分泌的信号序列。用于细菌表达，可使用氯化钙法或电穿孔法将表达载体引入细菌细胞中。
[0407]
如果要在动物细胞诸如cho、cos和nih3t3细胞中表达抗体，则表达载体包括在这些细胞中表达所必需的启动子，例如sv40启动子(mulligan等人,nature,277:108(1979))、mmlv-ltr启动子、ef1α启动子(mizushima等人,nucleic acids res.,18:5322(1990))或cmv启动子。除编码免疫球蛋白或其结构域的核酸序列之外，重组表达载体还可携带另外的序列诸如在宿主细胞中调控载体的复制的序列(例如，复制起点)和可选择标志物基因。可选择标志物基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标志物基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物诸如g418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。具有可选择标志物的载体的实例包括pmam、pdr2、pbk-rsv、pbk-cmv、poprsv和pop13。
[0408]
在一个实施方案中，抗体在哺乳动物细胞中产生。用于表达抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho细胞)(包括dhfr
–
cho细胞，描述于urlaub和chasin(1980)proc.natl.acad.sci.usa 77:4216-4220中，与dhfr可选择标志物一起使用，例如如kaufman和sharp(1982)mol.biol.159:601 621中所描述)、人胚胎肾293细胞(例如293、293e、293t)、cos细胞、nih3t3细胞、淋巴细胞细胞系例如ns0骨髓瘤细胞和sp2细胞、以及来自转基因动物例如转基因哺乳动物的细胞。例如，细胞是乳腺上皮细胞。
[0409]
在用于抗体表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗cd73抗体(例如，cl25、hzcl25、3-f03、3-f03_411或3-f03_413)的抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr
–
cho细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至增强子/启动子调控元件(例如，衍生自sv40、cmv、腺病毒等，诸如cmv增强子/admlp启动子调控元件或sv40增强子/admlp启动子调控元件)以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带dhfr基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增已用载体转染的cho细胞的选择。培养所选的转化体宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基中回收抗体。
[0410]
抗体还可由转基因动物产生。例如，美国专利号5,849,992描述了一种在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建转基因，其包括乳特异性启动子和编码所关注的抗体和用于分泌的信号序列的核酸。由此类转基因哺乳动物的雌性动物产生的乳包括其中分
泌的所关注的抗体。抗体可从乳纯化或对于一些应用而言直接使用。还提供了包含本文所述的一种或多种核酸的动物。
[0411]
本公开的抗体可从宿主胞内或外(诸如培养基)分离并纯化为基本上纯的且同源的抗体。通常用于抗体纯化的分离和纯化方法均可用于分离和纯化抗体，并且不限于任何特定的方法。可通过适当地选择和组合例如柱色谱法、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、渗析和重结晶来分离和纯化抗体。色谱法包括例如亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、反相色谱法和吸附色谱法(strategies for protein purification and characterization:a laboratory course manual.daniel r.marshak等人编,cold spring harbor laboratory press,1996)。可使用液相色谱法诸如hplc和fplc进行色谱。用于亲和色谱法的柱包括蛋白a柱和蛋白g柱。使用蛋白a柱的柱的实例包括hyper d、poros和sepharose ff(ge healthcare biosciences)。本公开还包括使用这些纯化方法高度纯化的抗体。
[0412]
多核苷酸、表达载体和细胞
[0413]
本公开还提供了编码本文所述的抗cd73抗体或其部分(例如vh、vl、hc或lc)的多核苷酸和载体。本公开的多核苷酸可呈rna或dna的形式。在一些情况下，多核苷酸是dna。在一些情况下，多核苷酸是互补dna(cdna)。在一些情况下，多核苷酸是rna。
[0414]
在一些情况下，多核苷酸编码包含本文所述的任何抗体的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见，例如表1、2、3和5)。在一些情况下，多核苷酸编码包含本文所述的任何抗体的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见，例如表1、2、3和5)。在一些情况下，多核苷酸编码包含含有本文所述的任何抗体的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh的重链(参见，例如表1、2、3和5)。在一些情况下，多核苷酸编码包含含有本文所述的任何抗体的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl的轻链(参见，例如表1、2、3和5)。在一些情况下，多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0415]
在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中第一多肽包含含有本文所述的任何抗体的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的vh(参见，例如表1、2、3和5)；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中第二多肽包含含有本文所述的任何抗体的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的vl(参见，例如表1、2、3和5)。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中第一多肽包含含有vh的重链，所述vh包含本文所述的任何抗体的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3(参见，例如表1、2、3和5)；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中第二多肽包含含有vl的轻链，所述vl包含本文所述的任何抗体的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3(参见，例如表1、2、3和5)。在一些情况下，第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且第二核酸可操作地连接至第二启动子。
[0416]
在一些情况下，多核苷酸编码cl25或其变体(例如，其人源化形式，例如hzcl25)的vh。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含与seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含相对于seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核
苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:22中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0417]
在一些情况下，多核苷酸编码cl25或其变体(例如，其人源化形式，例如hzcl25)的vl。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含与seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含相对于seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:23中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0418]
在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含cl25或其变体(例如，其人源化形式，例如hzcl25)的vh；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含cl25或其变体(例如，其人源化形式，例如hzcl25)的vl。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中第一多肽包含与seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中第二多肽包含与seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中第一多肽包含相对于seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中第二多肽包含相对于seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，第一核酸编码seq id no:22、26和82-84中的任一者中列出的氨基酸序列并且第二核酸编码seq id no:23、27、80和81中的任一者中列出的氨基酸序列。在一些情况下，第一核酸编码seq id no:22中列出的氨基酸序列并且第二核酸编码seq id no:23中列出的氨基酸序列。在一些情况下，第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且第二核酸可操作地连接至第二启动子。
[0419]
在一些情况下，多核苷酸编码cl25或其变体(例如，其人源化形式，例如hzcl25)的重链。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含与seq id no:24中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含相对于seq id no:24中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:24中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含seq id no:89中列出的序列。在一些情况下，多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0420]
在一些情况下，多核苷酸编码cl25或其变体(例如，其人源化形式，例如hzcl25)的轻链。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含与seq id no:25中列出的氨基酸序
列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含相对于seq id no:25中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:25中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含seq id no:90中列出的序列。在一些情况下，多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0421]
在一些情况下，多核苷酸编码cl25或其变体(例如，其人源化形式，例如hzcl25)的重链和cl25或其变体(例如，其人源化形式，例如hzcl25)的轻链。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含与seq id no:24中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含与seq id no:25中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含相对于seq id no:24中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含相对于seq id no:25中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含seq id no:24中列出的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含seq id no:25中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)包含seq id no:89中列出的氨基酸序列的第一核酸；和(ii)包含seq id no:90中列出的氨基酸序列的第二核酸。在一些情况下，第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且第二核酸可操作地连接至第二启动子。
[0422]
在一些情况下，多核苷酸编码3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vh。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含与seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含相对于seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:62中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:63中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0423]
在一些情况下，多核苷酸编码3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vl。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含与seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含相对于seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多
肽，所述多肽包含seq id no:61中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0424]
在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vh；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的vl。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中第一多肽包含与seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中第二多肽包含与seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中第一多肽包含相对于seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中第二多肽包含相对于seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，第一核酸编码seq id no:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者中列出的氨基酸序列并且第二核酸编码seq id no:61、64和65中的任一者中列出的氨基酸序列。在一些情况下，第一核酸编码seq id no:62中列出的氨基酸序列并且第二核酸编码seq id no:61中列出的氨基酸序列。在一些情况下，第一核酸编码seq id no:63中列出的氨基酸序列并且第二核酸编码seq id no:61中列出的氨基酸序列。在一些情况下，第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且第二核酸可操作地连接至第二启动子。
[0425]
在一些情况下，多核苷酸编码3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的重链。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含与seq id no:30、33和66中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含相对于seq id no:30、33和66中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:30、33和66中的任一者中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:30中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:33中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含seq id no:91中列出的序列。在一些情况下，多核苷酸包含seq id no:93中列出的序列。在一些情况下，多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0426]
在一些情况下，多核苷酸编码3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的轻链。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含与seq id no:31中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含相对于seq id no:31中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:31中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸编码多肽，所述多肽包含seq id no:31中列出的氨基酸序列。在一
些情况下，多核苷酸包含seq id no:92中列出的序列。在一些情况下，多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0427]
在一些情况下，多核苷酸编码3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的重链和3-f03或其变体(例如3-f03_411或3-f03_413)的轻链。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含与seq id no:30、33和66中的任一者中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含与seq id no:31中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含相对于seq id no:30、33和66中的任一者中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含相对于seq id no:31中列出的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含seq id no:30、33和66中的任一者中列出的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含seq id no:31中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含seq id no:30中列出的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含seq id no:31中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包含seq id no:33中列出的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包含seq id no:31中列出的氨基酸序列。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)包含seq id no:91中列出的氨基酸序列的第一核酸；和(ii)包含seq id no:92中列出的氨基酸序列的第二核酸。在一些情况下，多核苷酸包含：(i)包含seq id no:93中列出的氨基酸序列的第一核酸；和(ii)包含seq id no:92中列出的氨基酸序列的第二核酸。在一些情况下，第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且第二核酸可操作地连接至第二启动子。
[0428]
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸是分离的。
[0429]
本文还提供了表达载体，其编码本文所述的抗cd73抗体或其部分(例如vh、vl、hc和/或lc)。本文还提供了表达载体，其包含一种或多种本文所述的多核苷酸。各种类型的表达载体是本领域已知的并且在本文中描述(例如，参见上述章节“产生抗体的方法”)。
[0430]
本文还提供了包含本文所述的抗cd73抗体的细胞。本文还提供了包含一种或多种本文所述的多核苷酸的细胞。本文还提供了包含一种或多种本文所述的表达载体的细胞。各种类型的细胞是本领域已知的并且在本文中描述(例如，参见上述章节“产生抗体的方法”)。
[0431]
糖基化改变的抗cd73抗体
[0432]
不同糖型会深刻影响治疗剂的特性，包括药代动力学、药效学、受体相互作用和组织特异性靶向(graddis等人,2002,curr pharm biotechnol.3:285-297)。特别是对于抗体而言，寡糖结构会影响与蛋白酶抗性、fcrn受体介导的抗体的血清半衰期、吞噬作用和抗体反馈相关的特性，以及抗体的效应子功能(例如，与补体复合物c1的结合，后者诱导cdc，并且与fcγr受体结合，所述受体负责调节adcc途径)(nose和wigzell,1983；leatherbarrow
和dwek,1983；leatherbarrow等人,1985；walker等人,1989；carter等人,1992,pnas,89:4285-4289)。
[0433]
因此，调节抗体的效应子功能的另一种手段包括改变抗体恒定区的糖基化。改变的糖基化包括例如糖基化残基数目的减少或增加、糖基化残基的模式或位置的改变以及糖结构的改变。在人igg上发现的寡糖会影响其效应子功能的程度(raju,t.s.bioprocess international2003年4月.44-53)；人igg寡糖的微异质性会影响生物学功能，诸如cdc和adcc、与各种fc受体的结合以及与clq蛋白的结合(wright a.和morrison sl.tibtech 1997,15 26-32；shields等人j biol chem.2001 276(9):6591-604；shields等人j biol chem.2002；277(30):26733-40；shinkawa等人j biol chem.2003 278(5):3466-73；umana等人nat biotechnol.1999年2月；17(2):176-80)。例如，igg结合c1q并激活补体级联的能力可取决于位于两个ch2结构域之间的碳水化合物部分(通常锚定在asn297上)的存在、不存在或修饰(ward和ghetie,therapeutic immunology 2:77-94(1995)。因此，在一些情况下，抗cd73抗体相对于野生型恒定区含有asn297ala取代。
[0434]
可通过标准技术鉴定含fc的多肽例如抗体诸如igg抗体中的糖基化位点。糖基化位点的鉴定可以是实验性的或基于序列分析或建模数据。已描述了共有基序，即由各种糖基转移酶识别的氨基酸序列。例如，n-连接的糖基化基序的共有基序时常是nxt或nxs，其中x可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。还已描述了用于定位潜在糖基化基序的若干种算法。因此，为了鉴定抗体或含fc的片段内的潜在糖基化位点，例如，通过使用可公开获得的数据库，诸如由生物序列分析中心提供的网站，检查抗体的序列(关于预测n-连接的糖基化位点，参见netnglyc服务；并且关于预测o-连接的糖基化位点，参见netoglyc服务)。
[0435]
体内研究已证实，无糖基抗体的效应子功能降低。例如，无糖基抗cd8抗体无法耗尽小鼠中带有cd8的细胞(isaacs,1992j.immunol.148:3062)并且无糖基抗cd3抗体不会在小鼠或人中诱导细胞因子释放综合征(boyd,1995上述；friend,1999transplantation 68:1632)。抗cd73抗体的无糖基化形式也具有降低的效应子功能。
[0436]
重要的是，尽管去除ch2结构域中的聚糖似乎对效应子功能具有显著影响，但抗体的其他功能和物理特性仍保持不变。具体地说，已经证明，去除聚糖对血清半衰期和与抗原的结合几乎没有影响(nose,1983上述；tao,1989上述；dorai,1991上述；hand,1992上述；hobbs,1992mol.immunol.29:949)。
[0437]
可修饰或改变本发明的抗cd73抗体以引起增加或降低的效应子功能(与第二cd73特异性抗体相比)。用于改变抗体的糖基化位点的方法描述于例如us 6,350,861和us 5,714,350、wo 05/18572和wo05/03175中；这些方法可用于产生糖基化改变、减少或无糖基化的本发明的抗cd73抗体。
[0438]
a2a/a2b腺苷受体
[0439]
a2a腺苷受体是高亲和力受体，而a2b是低亲和力受体。腺苷及其激动剂可经由这些受体之一或两者起作用，并且可调节腺苷酸环化酶的活性，所述腺苷酸环化酶是负责增加环状amp(camp)的酶。不同受体对这种酶具有不同的刺激性和抑制性作用。胞内camp浓度升高可抑制免疫细胞和炎性细胞的活性。
[0440]
a2a腺苷受体可在外周和中枢神经系统中信号传导，其中激动剂经探索用作抗炎药，并且拮抗剂经探索用于神经退行性疾病。在大多数细胞类型中，a2a亚型抑制胞内钙水
平，而a2b则增强此水平。a2a受体一般而言似乎抑制免疫细胞的炎性反应。a2a大多数在淋巴系衍生的细胞(包括效应t细胞、调节性t细胞和自然杀伤细胞)上表达。
[0441]
a2b腺苷受体是低亲和力受体。a2b受体在胃肠道、膀胱、肺和肥大细胞中高度表达。尽管a2b受体在结构上与a2a受体密切相关并且能够激活腺苷酸环化酶，但在功能上有所不同。据推测，这种亚型可利用除腺苷酸环化酶以外的信号转导系统。在所有腺苷受体中，a2b腺苷受体是低亲和力受体，被认为在生理条件下保持沉默，并由于胞外腺苷水平升高而被激活。a2b腺苷受体的激活可分别通过gs和gq蛋白的激活来刺激腺苷酸环化酶和磷脂酶c。还已描述了与有丝分裂原激活的蛋白激酶的偶联。a2b受体主要在单核细胞衍生的细胞上表达，所述细胞包括树突状细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓系衍生的抑制细胞(mdsc)和间充质基质/干细胞(msc)。
[0442]
人a2a腺苷受体蛋白的示例性氨基酸序列(genbank登录号np_001265428)为：
[0443][0444]
人a2b腺苷受体蛋白的示例性氨基酸序列(genbank登录号np_000667)为：
[0445][0446]
a2a/a2b腺苷受体抑制剂
[0447]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是选自表6的化合物或其药学上可接受的盐。
[0448]
表6.
[0449]
[0450]
[0451]
[0452][0453]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是式(i)的化合物：
[0454][0455]
或其药学上可接受的盐，其中
[0456]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0457]
cy2是5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基，其中cy2的所述5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个各自独立地选自c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、nh2、nh(c
1-3
烷基)和n(c
1-3
烷基)2的基团取代；
[0458]
r2选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-、(4-7元
杂环烷基)-c
1-3
烷基-和or
a2
，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的rc取代基取代；
[0459]ra2
是任选地被1或2个独立地选择的rc取代基取代的(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-；
[0460]
每个rc独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c6芳基、5-7元杂芳基、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-、or
a4
和nr
c4rd4
；并且
[0461]
每个r
a4
、r
c4
和r
d4
独立地选自h和c
1-6
烷基。
[0462]
在式(i)化合物的一些实施方案中，cy2是嘧啶基。
[0463]
在式(i)化合物的一些实施方案中，r2选自吡啶-2-基甲基、(2,6-二氟苯基)(羟基)甲基、(5-(吡啶-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基、(3-甲基吡啶-2-基)甲氧基和(5-(1h-吡唑-1-基)-1h-四唑-1-基)甲基。
[0464]
在一些实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物1，表6)。
[0465]
在一些实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物2，表6)。
[0466]
在一些实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2h-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物3a，表6)。
[0467]
在一些实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物3b，表6)。
[0468]
在一些实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((3-甲基吡啶-2-基)甲氧基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物4，表6)。
[0469]
在一些实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐是3-(2-((5-(1h-吡唑-1-基)-2h-四唑-2-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物21a，表6)。
[0470]
在一些实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐是3-(2-((5-(1h-吡唑-1-基)-1h-四唑-1-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物21b，表6)。
[0471]
式(i)化合物的合成和表征可在wo2019/168847和us 62/891,685中找到，所述专利两者特此均以引用的方式整体并入。
[0472]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是式(ii)的化合物：
[0473][0474][0475]
或其药学上可接受的盐，其中
[0476]
r2选自h和cn；
[0477]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0478]
l是c
1-3
亚烷基，其中所述亚烷基任选地被1、2或3个独立地选择的r
8d
取代基取代；
[0479]
cy4选自苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基，其中所述苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基各自任选地被1、2或3个独立选自r
8d
和r8的取代基取代；
[0480]
每个r8独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r8的所述c
1-6
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8a
取代基取代；
[0481]
每个r
8a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、cn、or
a81
和nr
c81rd81
，其中r
8a
的所述c
1-3
烷基、5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0482]
每个r
a81
、r
c81
和r
d81
独立地选自h、c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基，其中r
a81
、r
c81
和r
d81
的所述c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0483]
每个r
8b
独立地选自卤基和c
1-3
烷基；并且
[0484]r8d
独立地选自oh、cn、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基。
[0485]
在一些实施方案中，式(ii)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-(羟基(苯基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物5，表6)。
[0486]
在一些实施方案中，式(ii)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物6，表6)。
[0487]
在一些实施方案中，式(ii)化合物或其药学上可接受的盐是5-氨基-7-(3-氰基-2-氟苯基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-8-甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物7，表6)。
[0488]
在一些实施方案中，式(ii)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((2-氟-6-(((1-甲基-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基)甲基)苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物8，表6)。
[0489]
式(ii)化合物的合成和表征可在wo2019/222677中找到，所述专利特此以引用的方式整体并入。
[0490]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是式(iii)的化合物：
[0491][0492]
或其药学上可接受的盐，其中
[0493]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0494]
r2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中r2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；
[0495]
每个r
2a
独立地选自d、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0496]
r4选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r4的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
4a
取代基取代；
[0497]
每个r
4a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、cn、or
a41
和nr
c41rd41
；并且
[0498]
每个r
a41
、r
c41
和r
d41
独立地选自h和c
1-6
烷基。
[0499]
在一些实施方案中，式(iii)化合物或其药学上可接受的盐是3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物9，表6)。
[0500]
在一些实施方案中，式(iii)化合物或其药学上可接受的盐是3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物10，表6)。
[0501]
在一些实施方案中，式(iii)化合物或其药学上可接受的盐是3-(8-氨基-2-(氨基(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物11，表6)。
[0502]
在一些实施方案中，式(iii)化合物或其药学上可接受的盐是3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(2,6-二甲基吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物12，表6)。
[0503]
式(iii)化合物的合成和表征可在pct/us2019/040496中找到，所述专利特此以引用的方式整体并入。
[0504]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是式(iv)的化合物：
[0505][0506]
或其药学上可接受的盐，其中
[0507]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0508]
cy2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中cy2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r6取代基取代；
[0509]
每个r6独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0510]
r2是苯基-c
1-3
烷基-或(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-和(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；并且
[0511]
每个r
2a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基。
[0512]
在一些实施方案中，式(iv)化合物或其药学上可接受的盐是3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物13，表6)。
[0513]
在一些实施方案中，式(iv)化合物或其药学上可接受的盐是3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物14，表6)。
[0514]
在一些实施方案中，式(iv)化合物或其药学上可接受的盐是3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(吡啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物15，表6)。
[0515]
在一些实施方案中，式(iv)化合物或其药学上可接受的盐是3-(4-氨基-7-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物16，表6)。
[0516]
式(iv)化合物的合成和表征可在us 62/798,180中找到，所述专利特此以引用的方式整体并入。
[0517]
在一些实施方案中，a2a/a2b的抑制剂是式(v)的化合物：
[0518]
[0519]
或其药学上可接受的盐，其中
[0520]
r2选自h、d、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0521]
r3选自h和c
1-6
烷基；
[0522]
r4选自h和c
1-6
烷基；
[0523]
r5选自h、卤基、cn、c
1-6
烷基；
[0524]
r6选自苯基、c
3-7
环烷基、5-7元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中r6的所述苯基、c
3-7
环烷基、5-7元杂芳基和4-7元杂环烷基任选地被1、2或3个独立地选择的ra取代基取代；
[0525]
每个ra独立地选自(5-10元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-10元杂环烷基)-c
1-3
烷基-，其中ra的所述(5-10元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-10元杂环烷基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1或2个独立地选择的rb取代基取代；
[0526]
每个rb独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c(o)r
b26
；
[0527]rb26
独立地选自h和c
1-3
烷基，其中r
b26
的所述c
1-3
烷基任选地被1或2个独立地选择的rc取代基取代
[0528]
每个rc独立地选自卤基、c
1-6
烷基、cn、or
a36
和nr
c36rd36
；并且
[0529]
每个r
a36
、r
c36
和r
d36
独立地选自h和c
1-6
烷基。
[0530]
在一些实施方案中，式(v)化合物或其药学上可接受的盐是7-(1-((5-氯吡啶-3-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮或其药学上可接受的盐(参见化合物17，表6)。
[0531]
在一些实施方案中，式(v)化合物或其药学上可接受的盐是3-甲基-7-(1-((5-甲基吡啶-3-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮或其药学上可接受的盐(参见化合物18，表6)。
[0532]
在一些实施方案中，式(v)化合物或其药学上可接受的盐是3-甲基-9-戊基-7-(1-(噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基甲基)-1h-吡唑-4-基)-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮或其药学上可接受的盐(参见化合物19，表6)。
[0533]
在一些实施方案中，式(v)化合物或其药学上可接受的盐是7-(1-((2-(2-(二甲基氨基)乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮或其药学上可接受的盐(参见化合物20，表6)。
[0534]
式(v)化合物的合成和表征可在us-2019-0337957中找到，所述专利特此以引用的方式整体并入。
[0535]
如本文所用，“约”当提及可测量值诸如量、剂量、持续时间等时，意在涵盖
±
10％的变化。在某些实施方案中，“约”可包括与规定值相差
±
5％、
±
1％或
±
0.1％的变化以及介于其间的任何变化，因为此类变化对于进行所公开的方法是适当的。
[0536]
在一些实施方案中，本文所公开的化合物是化合物的(s)-对映体或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，化合物是化合物的(r)-对映体或其药学上可接受的盐。
[0537]
还应理解，为清晰起见描述于单独实施方案的上下文中的某些本发明特征还可组合提供于单一实施方案中。相反地，为简洁起见描述于单一实施方案的上下文中的各种本发明特征还可单独或以任何合适的子组合提供。
[0538]
术语“n元”(其中n是整数)通常描述其中成环原子数目是n的部分中的成环原子数
目。例如，哌啶基是6元杂环烷基环的实例，吡唑基是5元杂芳基环的实例，吡啶基是6元杂芳基环的实例，并且1,2,3,4-四氢-萘是10元环烷基的实例。
[0539]
如本文所用，短语“任选地被取代”表示未被取代或被取代。取代基是独立地选择的，并且取代可在任何化学上可及的位置处。如本文所用，术语“被取代”意指氢原子被去除并被取代基替换。单个二价取代基(例如，氧代)可替换两个氢原子。应理解给定原子上的取代受化合价限制。
[0540]
如本文所用，短语“每个
‘
变量’独立地选自”意指与其中
“‘
变量’在每次出现时选自”基本上相同。
[0541]
在整个定义中，术语“c
n-m”指示包括端点的范围，其中n和m是整数并指示碳数目。实例包括c
1-3
、c
1-4
、c
1-6
等。
[0542]
如本文所用，术语“c
n-m
烷基”单独或与其他术语组合使用时是指可以是直链或支链的具有n至m个碳的饱和烃基团。烷基部分的实例包括但不限于化学基团，诸如甲基(me)、乙基(et)、正丙基(n-pr)、异丙基(ipr)、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；高级同系物，诸如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等。在一些实施方案中，烷基含有1至6个碳原子、1至4个碳原子、1至3个碳原子、或1至2个碳原子。
[0543]
如本文所用，术语“c
n-m
烷氧基”单独或与其他术语组合使用时是指式-o-烷基的基团，其中烷基具有n至m个碳。示例性烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基和异丙氧基)、丁氧基(例如正丁氧基和叔丁氧基)等。
[0544]
如本文所用，术语“芳基”单独或与其他术语组合使用时是指芳族烃基团，其可以是单环或多环(例如，具有2、3或4个稠环)。术语“c
n-m
芳基”使指具有n至m个环碳原子的芳基。芳基包括例如苯基、萘基、蒽基、菲基、茚满基、茚基等。在一些实施方案中，芳基具有5至10个碳原子。在一些实施方案中，芳基是苯基或萘基。在一些实施方案中，芳基是苯基(即c6芳基)。
[0545]
如本文所用，“卤基”或“卤素”是指f、cl、br或i。在一些实施方案中，卤基是f、cl或br。在一些实施方案中，卤基是f或cl。在一些实施方案中，卤基是f。在一些实施方案中，卤基是cl。
[0546]
如本文所用，术语“c
n-m
卤代烷基”单独或与其他术语组合使用时是指具有一个卤素原子至2s+1个可相同或不同的卤素原子的烷基，其中“s”是烷基中的碳原子数目，其中烷基具有n至m个碳原子。在一些实施方案中，卤代烷基仅被氟化。在一些实施方案中，烷基具有1至6、1至4、或1至3个碳原子。示例性卤代烷基包括cf3、c2f5、chf2、ch2f、ccl3、chcl2、c2cl5等。
[0547]
如本文所用，“环烷基”是指包括环化烷基和烯基的非芳族环状烃。环烷基可包括单环或多环(例如，具有2个稠环)基团、螺环和桥接环(例如，桥接双环烷基)。环烷基的成环碳原子可任选地被氧代或硫代(例如c(o)或c(s))取代。环烷基的定义中还包括一个或多个芳族环稠合于环烷基环(即具有与环烷基环共用的键)的部分，例如环戊烷、环己烷等的苯并或噻吩基衍生物。含有稠合芳族环的环烷基可通过任何成环原子(包括所述稠合芳族环的成环原子)连接。环烷基可具有3、4、5、6、7、8、9或10个成环碳(即c
3-10
)。在一些实施方案中，环烷基是c
3-10
单环或双环环烷基。在一些实施方案中，环烷基是c
3-7
单环环烷基。在一些实施方案中，环烷基是c
4-7
单环环烷基。在一些实施方案中，环烷基是c
4-10
螺环或桥接环烷
基(例如，桥接双环烷基)。示例性环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚三烯基、降冰片基、降蒎烷基、降蒈烷基、立方烷、金刚烷、双环[1.1.1]戊基、双环[2.1.1]己基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.1.1]庚基、双环[2.2.2]辛基、螺[3.3]庚基等。在一些实施方案中，环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
[0548]
如本文所用，“杂芳基”是指具有至少一个选自n、o、s和b的杂原子环成员的单环或多环(例如，具有2个稠环)芳族杂环。在一些实施方案中，杂芳基环具有1、2、3或4个独立地选自n、o、s和b的杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基部分中的任何成环n可以是n-氧化物。在一些实施方案中，杂芳基是具有1、2、3或4个独立地选自n、o、s和b的杂原子环成员的5-10元单环或双环杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基是具有1、2、3或4个独立地选自n、o和s的杂原子环成员的5-10元单环或双环杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基是具有1或2个独立地选自n、o、s和b的杂原子环成员的5-6单环杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基是具有1或2个独立地选自n、o和s的杂原子环成员的5-6单环杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基含有3至10、4至10、5至10、5至7、3至7或5至6个成环原子。在一些实施方案中，杂芳基具有1至4个成环杂原子、1至3个成环杂原子、1至2个成环杂原子或1个成环杂原子。当杂芳基含有多于一个杂原子环成员时，所述杂原子可相同或不同。示例性杂芳基包括但不限于噻吩基(或苯硫基)、呋喃基(furyl)(或呋喃基(furanyl))、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、1,2,3-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-三唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-三唑基、1,3,4-噻二唑基、1,3,4-噁二唑基和1,2-二氢-1,2-氮杂硼烷、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、氮杂茂基、三唑基、噻二唑基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异噁唑基、咪唑并[1,2-b]噻唑基、嘌呤基、三嗪基、噻吩并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、1,5-萘吡啶基、1h-吡唑并[4,3-b]吡啶基、三唑并[4,3-a]吡啶基、1h-吡咯并[3,2-b]吡啶基、1h-吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、吲唑基等。
[0549]
如本文所用，“杂环烷基”是指具有至少一个非芳族环(饱和或部分不饱和环)的单环或多环杂环，其中杂环烷基的一个或多个成环碳原子被选自n、o、s和b的杂原子替换，并且其中杂环烷基的成环碳原子和杂原子可任选地被一个或多个氧代或硫代(例如c(o)、s(o)、c(s)或s(o)2等)取代。当杂环烷基的成环碳原子或杂原子任选地被一个或多个氧代或硫代取代时，所述基团的o或s是除了本文所指定的成环原子数目之外(例如1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基是6元杂环烷基，其中成环碳原子被氧代基团取代，并且其中6元杂环烷基进一步被甲基取代)。杂环烷基包括单环和多环(例如，具有2个稠环)系统。杂环烷基中包括单环和多环3至10、4至10、5至10、4至7、5至7或5至6元杂环烷基。杂环烷基还可包括螺环和桥接环(例如5至10元桥接双杂环烷基环，其具有一个或多个被独立地选自n、o、s和b的杂原子取代的成环碳原子)。杂环烷基可通过成环碳原子或成环杂原子连接。在一些实施方案中，杂环烷基含有0至3个双键。在一些实施方案中，杂环烷基含有0至2个双键。
[0550]
杂环烷基的定义中还包括具有一个或多个与非芳族杂环稠合(即具有共用的键)的芳族环的部分，例如哌啶、吗啉、氮杂等的苯并或噻吩基衍生物。含有稠合芳环的杂环烷基可通过包括稠合芳环的成环原子的任何成环原子连接。
[0551]
在一些实施方案中，杂环烷基含有3至10个成环原子、4至10个成环原子、3至7个成环原子或5至6个成环原子。在一些实施方案中，杂环烷基具有1至4个杂原子、1至3个杂原
子、1至2个杂原子或1个杂原子。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1或2个独立地选自n、o、s和b的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环4-6元杂环烷基。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1、2、3或4个独立地选自n、o、s和b的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环或双环5-10元杂环烷基。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1、2、3或4个独立地选自n、o和s的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环或双环5至10元杂环烷基。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1、2、3或4个独立地选自n、o和s的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环5至6元杂环烷基。
[0552]
示例性杂环烷基包括吡咯烷-2-酮(或2-氧代吡咯烷基)、1,3-异噁唑烷-2-酮、吡喃基、四氢吡喃、氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基、吗啉代、硫代吗啉代、哌嗪基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、吡咯烷基、异噁唑烷基、异噻唑烷基、吡唑啶基、噁唑烷基、噻唑烷基、咪唑烷基、氮杂环庚烷基、1,2,3,4-四氢异喹啉、苯并氮杂环庚三烯、氮杂双环[3.1.0]己基、二氮杂双环[3.1.0]己基、氧代双环[2.1.1]己基、氮杂双环[2.2.1]庚基、二氮杂双环[2.2.1]庚基、氮杂双环[3.1.1]庚基、二氮杂双环[3.1.1]庚基、氮杂双环[3.2.1]辛基、二氮杂双环[3.2.1]辛基、氧代双环[2.2.2]辛基、氮杂双环[2.2.2]辛基、氮杂金刚烷基、二氮杂金刚烷基、氧代-金刚烷基、氮杂螺[3.3]庚基、二氮杂螺[3.3]庚基、氧代-氮杂螺[3.3]庚基、氮杂螺[3.4]辛基、二氮杂螺[3.4]辛基、氧代-氮杂螺[3.4]辛基、氮杂螺[2.5]辛基、二氮杂螺[2.5]辛基、氮杂螺[4.4]壬基、二氮杂螺[4.4]壬基、氧代-氮杂螺[4.4]壬基、氮杂螺[4.5]癸基、二氮杂螺[4.5]癸基、二氮杂螺[4.4]壬基、氧代-二氮杂螺[4.4]壬基、氧代-二氢哒嗪基、氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛基、氧代六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪基、3-氧代哌嗪基、氧代-吡咯烷基、氧代-吡啶基等。例如，杂环烷基包括以下基团(有和无n-甲基取代)：
[0553][0554]
如本文所用，“c
o-p
环烷基-c
n-m
烷基
‑”
是指式环烷基-亚烷基-的基团，其中环烷基具有o至p个碳原子，并且亚烷基连接基团具有n至m个碳原子。
[0555]
如本文所用，“c
o-p
芳基-c
n-m
烷基
‑”
是指式芳基-亚烷基-的基团，其中芳基具有o至p个碳原子，并且亚烷基连接基团具有n至m个碳原子。
[0556]
如本文所用，“杂芳基-c
n-m
烷基
‑”
是指式杂芳基-亚烷基-的基团，其中亚烷基连接基团具有n至m个碳原子。
[0557]
如本文所用，“杂环烷基-c
n-m
烷基
‑”
是指式杂环烷基-亚烷基-的基团，其中亚烷基连接基团具有n至m个碳原子。
[0558]
在某些地方，定义或实施方案是指特定环(例如氮杂环丁烷环、吡啶环等)。除非另外指示，否则这些环可连接至任何环成员，条件是不超过原子的化合价。例如，氮杂环丁烷环可在所述环的任何位置处连接，而吡啶-3-基环在3-位置处连接。
[0559]
如本文所用，术语“氧代”是指作为二价取代基的氧原子(即＝o)，当连接至碳时形成羰基(例如c＝o或c(o))，或当连接至氮或硫杂原子时，形成亚硝基、亚磺酰基或磺酰基。
[0560]
如本文所用，术语“独立地选自”意指变量或取代基在每次出现时独立地选自适用的列表。
[0561]
本文所述的化合物可以是不对称的(例如，具有一个或多个立构中心)。除非另外指示，否则意指所有立体异构体，诸如对映体和非对映体。含有不对称取代的碳原子的本公开的化合物可以光学活性或外消旋形式分离。关于如何由光学非活性起始材料制备光学活性形式的方法是本领域已知的，诸如通过拆分外消旋混合物或通过立体选择性合成。烯烃、c＝n双键等的许多几何异构体也可存在于本文所述的化合物中，并且所有此类稳定异构体均涵盖在本发明中。描述了本公开的化合物的顺式和反式几何异构体并且其可以异构体混合物形式或以分离的异构体形式分离。在一些实施方案中，所述化合物具有(r)-构型。在一些实施方案中，所述化合物具有(s)-构型。本文所提供的式(例如式(i)、(ii)等)包括化合物的立体异构体。
[0562]
化合物的外消旋混合物的拆分可通过本领域已知的多种方法中的任一种来进行。示例性方法包括使用手性拆分酸进行分步重结晶，所述酸是光学活性、成盐有机酸。用于分步重结晶方法的合适的拆分剂是例如光学活性酸，诸如酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸的d和l形式，或各种光学活性樟脑磺酸，诸如β-樟脑磺酸。其他适用于分步结晶方法的拆分剂包括立体异构纯形式的α-甲基苯甲胺(例如s和r形式，或非对映异构纯形式)、2-苯基甘氨醇、降麻黄碱、麻黄碱、n-甲基麻黄碱、环己基乙胺、1,2-二氨基环己烷等。
[0563]
外消旋混合物的拆分还可通过在填充有光学活性拆分剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱上洗脱来进行。合适的洗脱溶剂组合物可由本领域技术人员确定。
[0564]
本文所提供的化合物还包括互变异构体形式。互变异构体形式由单键与相邻双键交换并伴随质子迁移而产生。互变异构体形式包括质子转移互变异构体，其是具有相同经验式和总电荷的异构体质子化状态。示例性质子转移互变异构体包括酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内酰胺-内酰亚胺对、烯胺-亚胺对、以及其中质子可占据杂环系统的两个或更多个位置的环形式，例如1h-咪唑和3h-咪唑、1h-1,2,4-三唑、2h-1,2,4-三唑和4h-1,2,4-三唑、1h-异吲哚和2h-异吲哚、2-羟基吡啶和2-吡啶酮、以及1h-吡唑和2h-吡唑。互变异构体形式可处于平衡状态或通过适当取代而在空间上锁定为一种形式。
[0565]
所有化合物及其药学上可接受的盐可连同诸如水和溶剂的其他物质一起存在(例如水合物和溶剂化物)或可分离。
[0566]
在一些实施方案中，化合物制备可涉及添加酸或碱以影响例如对所期望反应的催化作用或诸如酸加成盐的盐形式的形成。
[0567]
在一些实施方案中，本文所提供的化合物或其盐基本上被分离。“基本上被分离”意指化合物从其形成或检测时所处的环境至少部分或基本上分离。部分分离可包括例如本文所提供的化合物富集的组合物。基本上分离可包括含有按重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的本文所提供的化合物或其盐的组合物。用于分离化合物及其盐的方法是本领域常规的。
[0568]
如本文所用的术语“化合物”意指包括所描绘结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。除非另外规定，否则由名称或结构鉴定为一种特定互变异构体形式的本文化合物意图包括其他互变异构体形式。
[0569]
短语“药学上可接受”在本文中用于指在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，符合合理的效益/
风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0570]
本技术还包括本文所述的化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过使现有酸或碱部分转化成其盐形式而被修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机酸或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱盐或有机盐；等。本公开的药学上可接受的盐包括由例如无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般而言，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水或有机溶剂或两者的混合物中反应来制备；一般而言，如醚、乙酸乙酯、醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇)或乙腈(acn)的非水性介质是优选的。合适的盐的列表可在remington’s pharmaceutical sciences,第17版,mack publishing company,easton,pa.,1985,第1418页和journal of pharmaceutical science,66,2(1977)中找到，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。
[0571]
本文所述的化合物(包括其盐)可使用已知的有机合成技术制备并且可根据许多可能的合成路线中的任一个来合成。
[0572]
制备本文所述的化合物的反应可在合适的溶剂中进行，所述溶剂可容易地由有机合成领域的技术人员选择。合适的溶剂在进行反应的温度(例如，可在溶剂的凝固温度至溶剂的沸点温度范围内的温度)下可基本上不与起始材料(反应物)、中间体或产物反应。给定反应可在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。取决于特定反应步骤，用于特定反应步骤的合适的溶剂可由本领域技术人员选择。
[0573]
本文所述的化合物的制备可涉及各种化学基团的保护与脱保护。对保护与脱保护的需要以及对适当保护基的选择可容易地由本领域技术人员确定。保护基的化学性质可在例如t.w.greene和p.g.m.wuts,protective groups in organic synthesis,第3版,wiley&sons,inc.,new york(1999)中找到，所述文献以引用的方式整体并入本文。
[0574]
反应可根据本领域已知的任何合适的方法监测。例如，产物形成可通过以下方法监测：光谱手段，诸如核磁共振谱法(例如1h或
13
c)、红外光谱学、分光光度法(例如紫外-可见光)、质谱法；或通过色谱方法，诸如高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-质谱法(lcms)或薄层色谱法(tlc)。化合物可由本领域技术人员通过多种方法纯化，所述方法包括高效液相色谱法(hplc)(“preparative lc-ms purification:improved compound specific method optimization”karl f.blom,等人j.combi.chem.2004,6(6),874-883，所述文献以引用的方式整体并入本文)和正相硅胶色谱法。
[0575]
本文所述的化合物可调节各种g蛋白偶联受体(gpcr)中的一种或多种的活性，所述g蛋白偶联受体包括例如a2a/a2b。术语“调节”意指提高或降低a2a/a2b家族的一个或多个成员的活性的能力。因此，本文所述的化合物可用于调节a2a/a2b的方法中，通过使a2a/a2b与本文所述的化合物或组合物中的任何一种或多种接触来实现所述调节。在一些实施方案中，本发明化合物可充当a2a和a2b之一或两者的抑制剂。在另外的实施方案中，本文所述的化合物可用于通过施用调节量的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐来调节需要调节受体的个体中的a2a/a2b的活性。在一些实施方案中，调节是抑制。
[0576]
鉴于癌细胞的生长和存活受到多重信号传导途径的影响，本发明可用于治疗特征为抗药性突变体的疾病状态。另外，可组合使用不同gpcr抑制剂，它们在活性受到所述抑制
剂调节的gpcr中表现出不同偏好。这种方法可证明在通过靶向多重信号传导途径治疗疾病状态中的高效性，减小了在细胞中出现抗药性的可能性并降低了用于疾病的治疗的毒性。
[0577]
本发明化合物结合和/或调节(例如抑制)的gpcr包括a2a/a2b家族的任何成员。
[0578]
在一些实施方案中，将多于一种本文所述的化合物用于抑制一种gpcr(例如，a2a)的活性。
[0579]
在一些实施方案中，将多于一种本文所述的化合物用于抑制多于一种gpcr，诸如至少两种gpcr(例如a2a和a2b)。
[0580]
在一些实施方案中，一种或多种化合物与另一种gpcr拮抗剂组合使用以抑制一种gpcr(例如，a2a或a2b)的活性。
[0581]
本文所述的a2a/a2b抑制剂可具有选择性。“选择性”意指化合物与至少一种其他gpcr相比分别以较大亲和力或效力结合至或抑制gpcr。在一些实施方案中，本文所述的化合物是a2a或a2b的选择性抑制剂。在一些实施方案中，本文所述的化合物是a2a的选择性抑制剂(例如，相对于a2b)。在一些实施方案中，本文所述的化合物是a2b的选择性抑制剂(例如，相对于a2a)。在一些实施方案中，选择性可以是至少约2倍、5倍、10倍、至少约20倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍。选择性可通过本领域常规的方法来测量。在一些实施方案中，选择性可在针对每种gpcr的生化亲和力下测试。在一些实施方案中，本文所述的化合物的选择性可通过与特定a2a/a2b活性相关的细胞测定来测定。
[0582]
如本文所用，术语“接触”是指在体外系统或体内系统中使所指定的部分集合在一起。例如，使a2a/a2b与本文所述的化合物“接触”包括向具有a2a/a2b的个体或患者(诸如人)施用本发明化合物以及例如将本文所述的化合物引入含有包含a2a/a2b的细胞或纯化制剂的样品中。
[0583]
a2a和/或a2b腺苷受体的另外的抑制剂
[0584]
在本文所述的方法中与cd73抑制剂组合使用的a2a和/或a2b腺苷受体的其他抑制剂是本领域已知的。
[0585]
在一些情况下，a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂是cpi-444(在本文中也称为“化合物b”；7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-[[6-[[(3s)-氧杂环戊烷-3-基]氧基甲基]吡啶-2-基]甲基]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺)。
[0586]
在一些情况下，a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂是ab928(3-[2-氨基-6-[1-[[6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基]甲基]三唑-4-基]嘧啶-4-基]-2-甲基苯甲腈)。
[0587]
在一些情况下，a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂是azd4635(6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1,2,4-三嗪-3-胺)。
[0588]
在一些情况下，a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂是nir-178(5-溴-2,6-二(1h-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺)。
[0589]
在一些情况下，a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂是eos100850。
[0590]
在一些情况下，a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂是美国专利申请公布号2019/0292188中描述的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些情况下，a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂包含以下化合物或由以下化合物组成
[0591][0592]
(3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈)或其药学上可接受的盐或其立体异构体。
[0593]
在一些情况下，a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂包含以下化合物或由以下化合物组成
[0594][0595]
(3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2h-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈)或其药学上可接受的盐或其立体异构体。
[0596]
标记的剂和测定方法
[0597]
本公开的另一方面涉及标记(放射性标记、荧光标记等)的本公开的剂(即标记的cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂)，其不仅可用于成像技术，而且可用于体外测定和体内测定，所述测定用于定位和量化组织样品(包括人)中的cd73或a2a和/或a2b受体，并且用于通过抑制标记化合物的结合来鉴定cd73或a2a和/或a2b拮抗剂。本公开的化合物的一个或多个原子的取代还可用于产生分化的adme(吸收、分布、代谢和排泄)。因此，本公开包括含有此类标记或取代的化合物的腺苷受体(例如a2a和/或a2b)测定。
[0598]
本公开还包括同位素标记的本公开的剂。“同位素”或“放射性标记的”剂是其中一个或多个原子被具有不同于自然界中通常发现(即，天然存在)的原子质量或质量数的原子质量或质量数的原子替换或取代的本公开的剂。可掺入本公开的剂中的合适的放射性核素包括但不限于2h(对于氘也写作d)、3h(对于氚也写作t)、
11
c、
13
c、
14
c、
13
n、
15
n、
15
o、
17
o、
18
o、
18
f、
35
s、
36
cl、
82
br、
75
br、
76
br、
77
br、
123
i、
124
i、
125
i和
131
i。例如，本公开的化合物中的一个或多个氢原子可被氘原子替换(例如，式(i)的c
1-6
烷基的一个或多个氢原子可任选地被氘原子取代，诸如
–
cd3取代
–
ch3)。在一些实施方案中，所公开的式(例如式(i))中的任一者中的烷基可被全氘化。
[0599]
本文呈现的剂的一个或多个组成原子可以天然或非天然丰度被所述原子的同位素替换或取代。在一些实施方案中，化合物包括至少一个氘原子。例如，本文呈现的化合物中的一个或多个氢原子可被氘替换或取代(例如，c
1-6
烷基的一个或多个氢原子可被氘原子替换，诸如
–
cd3取代
–
ch3)。在一些实施方案中，剂包括两个或更多个氘原子。在一些实施方案中，剂包括1-2个、1-3个、1-4个、1-5个或1-6个氘原子。在一些实施方案中，剂中的所有氢原子都可被氘原子替换或取代。
[0600]
在一些实施方案中，连接至如本文所述的任何“烷基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”、“苯基”、“环烷基”、“杂环烷基”或“杂芳基”取代基或
“‑c1-6
烷基
‑”
、“亚烷基”、“亚烯基”和“亚炔基”连接基团的碳原子的1、2、3、4、5、6、7或8个氢原子各自任选地被氘原子替换。
[0601]
用于将同位素纳入有机化合物中的合成方法是本领域已知的(deuterium labeling in organic chemistry by alan f.thomas(new york,n.y.,appleton-century-crofts,1971；the renaissance of h/d exchange by jens atzrodt,volker derdau,thorsten fey和jochen zimmermann,angew.chem.int.ed.2007,7744-7765；the organic chemistry of isotopic labelling by james r.hanson,royal society of chemistry,2011)。同位素标记的剂可用于各种研究诸如nmr波谱法、代谢实验和/或测定中。
[0602]
用诸如氘的较重同位素进行的取代可提供由于较大代谢稳定性(例如，体内半衰期增加或剂量需求减少)所产生的某些治疗优势，并且因此在某些情况下可以是优选的。(参见，例如a.kerekes等人j.med.chem.2011,54,201-210；r.xu等人j.label compd.radiopharm.2015,58,308-312)。特别地，在一个或多个代谢位点处的取代可提供一种或多种治疗优势。
[0603]
掺入本发明的放射性标记的剂中的放射性核素将取决于所述放射性标记的剂的特定应用。例如，对于体外腺苷受体标记和竞争测定，掺入有3h、
14
c、
82
br、
125
i、
131
i或
35
s的剂可以是有用的。对于放射性成像应用，
11
c、
18
f、
125
i、
123
i、
124
i、
131
i、
75
br、
76
br或
77
br可以是有用的。
[0604]
应理解，“放射性标记”或“标记的剂”是掺入有至少一种放射性核素的剂。在一些实施方案中，放射性核素选自由以下组成的组：3h、
14
c、
125
i、
35
s和
82
br。
[0605]
本公开可进一步包括用于将放射性同位素掺入本公开的剂中的合成方法。用于将放射性同位素掺入有机化合物和抗体中的合成方法是本领域众所周知的，并且本领域普通技术人员将容易地识别适用于本公开的化合物和抗体的方法。
[0606]
标记的本公开的剂可在筛选测定中用于鉴定/评价剂。例如，可通过经由跟踪标记分别监测标记的新合成或所鉴定的剂(即，测试剂)在其与腺苷受体或cd73接触时的浓度变化，来评价其结合腺苷受体或cd73的能力。例如，可评价测试剂(标记的)减少已知会结合至腺苷受体或cd73的另一种剂(即标准剂)的结合的能力。因此，测试剂与标准剂竞争结合至腺苷受体或cd73的能力与其结合亲和力直接相关。相反，在一些其他筛选测定中，标准剂被标记，而测试剂未被标记。因此，监测标记的标准剂的浓度以评价标准剂与测试剂之间的竞争，并且因此确定测试剂的相对结合亲和力。
[0607]
组合疗法和适应症
[0608]
本公开的cd73抑制剂可调节cd73的活性。因此，本文所述的cd73抑制剂可用于抑制cd73的方法中，通过使cd73与本文所述的抗体或其组合物中的任何一种或多种接触来实现所述抑制。同样，本公开的a2a和/或a2b抑制剂可调节a2a和/或a2b腺苷受体的活性。因此，本文所述的a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂、盐或立体异构体可用于抑制a2a和/或a2b腺苷受体的方法中，通过使a2a和/或a2b腺苷受体分别与本文所述的a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂或其组合物中的任何一种或多种接触来实现所述抑制。本公开的cd73抑制剂以及本公开的a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂可协同作用，以例如治疗疾病或病症，例如癌症。因此，
本文所述的cd73抑制剂可与本文所述的a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂组合用于抑制cd73以及a2a和/或a2b腺苷受体的方法中，通过使cd73与本文所述的cd73抑制剂或其组合物中的任何一种或多种接触并且通过使a2a和/或a2b腺苷受体与本文所述的a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂或其组合物中的任何一种或多种接触来实现所述抑制。
[0609]
在一些实施方案中，cd73抑制剂与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂可组合用于抑制以下各项的方法中：(i)在需要所述抑制的个体/患者中cd73的活性，以及(ii)在需要所述抑制的个体/患者中a2a和/或a2b腺苷受体的活性，通过施用有效量的本文所述的cd73抑制剂以及本文所述的a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂来实现所述抑制。在一些实施方案中，调节是抑制。在一些实施方案中，所述接触是体内的。在一些实施方案中，所述接触是离体或体外的。
[0610]
本公开的另一方面涉及在个体(例如患者)中治疗cd73和/或a2a和/或a2b腺苷受体相关疾病或病症的方法，通过向需要此类治疗的个体施用治疗有效量或剂量的一种或多种本公开的cd73抑制剂或其药物组合物以及治疗有效量或剂量的一种或多种本公开的a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂或其药物组合物来实现所述治疗。cd73相关疾病或病症可包括直接或间接与cd73的表达或活性(包括过表达和/或异常活性水平)关联的任何疾病、病症或病状。a2a和/或a2b腺苷受体相关疾病或病症可包括直接或间接与a2a和/或a2b腺苷受体的表达或活性(包括过表达和/或异常活性水平)关联的任何疾病、病症或病状。cd73和/或a2a和/或a2b腺苷受体相关疾病或病症可包括直接或间接与cd73和/或a2a和/或a2b腺苷受体的表达或活性(包括cd73和/或a2a和/或a2b腺苷受体的过表达和/或异常活性水平)关联的任何疾病、病症或病状。
[0611]
本公开的另一方面涉及在个体(例如患者)中治疗疾病或病症(例如癌症)的方法，通过向需要此类治疗的个体施用治疗有效量或剂量的一种或多种本公开的cd73抑制剂或其药物组合物以及治疗有效量或剂量的一种或多种本公开的a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂或其药物组合物来实现所述治疗，其中所述疾病或病症具有高腺苷特征。确定疾病或病症具有高腺苷特征的方法是本领域已知的。例如，可使用限定的一组腺苷反应性基因来进行肿瘤组织的基因表达分析。
[0612]
本公开的cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂可用于以组合形式治疗与cd73和/或a2a和/或a2b腺苷受体的活性相关的疾病，包括例如癌症、炎性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病、免疫调节性疾病、中枢神经系统疾病和糖尿病。
[0613]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含：
[0614]
(a)抗体，所述抗体包含可变重(vh)结构域，所述可变重(vh)结构域包含vh互补决定区(cdr)1、vh cdr2和vh cdr3，其中：
[0615]
vh cdr1包含氨基酸序列gytftsyg(seq id no:1)；
[0616]
vh cdr2包含氨基酸序列iypgsgnt(seq id no:2)；且
[0617]
vh cdr3包含氨基酸序列arydylgssygfdy(seq id no:3)；并且
[0618]
包含可变轻(vl)结构域，所述可变轻(vl)结构域包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其中：
[0619]
vl cdr1包含氨基酸序列qdvsta(seq id no:4)；
[0620]
vl cdr2包含氨基酸序列sas(seq id no:5)；且
[0621]
vl cdr3包含氨基酸序列qqhyntpyt(seq id no:6)；
[0622]
(b)在seq id no:70的氨基酸40-53内的表位处结合至人cd73的抗体；
[0623]
(c)结合至人cd73并与具有包含seq id no:24的氨基酸序列的重链和包含seq id no:25的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；或
[0624]
(d)包含vh结构域的抗体，所述vh结构域包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，其中：
[0625]
vh cdr1包含氨基酸序列gftfssyd(seq id no:34)；
[0626]
vh cdr2包含氨基酸序列msydgsnk(seq id no:35)或msyegsnk(seq id no:40)；并且
[0627]
vh cdr3包含氨基酸序列ateiaakgdy(seq id no:36)；和
[0628]
包含vl结构域的抗体，所述vl结构域包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其中：
[0629]
vl cdr1包含氨基酸序列qgisny(seq id no:37)；
[0630]
vl cdr2包含氨基酸序列aas(seq id no:38)；并且
[0631]
vl cdr3包含氨基酸序列qqsystph(seq id no:39)；
[0632]
(e)在seq id no:70的氨基酸386-399和470-489内的表位处结合至人cd73的抗体；
[0633]
(f)结合至人cd73并与具有包含seq id no:30的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；
[0634]
(g)结合至人cd73并与具有包含seq id no:33的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；
[0635]
(h)选自由11e1、medi9447、cpi-006和bms-986179组成的组的抗体；或
[0636]
(i)选自由cb-708和ab680组成的组的抑制剂。
[0637]
在一些实施方案中，a2a腺苷受体和/或a2b腺苷受体(a2a/a2b)的抑制剂包含以下化合物：
[0638]
(a)式(i)：
[0639][0640]
或其药学上可接受的盐，其中
[0641]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0642]
cy2是5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基，其中cy2的5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个各自独立地选自c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、nh2、nh(c
1-3
烷基)和n(c
1-3
烷基)2的基团取代；
[0643]
r2选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-和or
a2
，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的rc取
代基取代；
[0644]ra2
是任选地被1或2个独立地选择的rc取代基取代的(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-；
[0645]
每个rc独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c6芳基、5-7元杂芳基、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-、or
a4
和nr
c4rd4
；并且
[0646]
每个r
a4
、r
c4
和r
d4
独立地选自h和c
1-6
烷基；
[0647]
(b)式(ii)：
[0648][0649]
或其药学上可接受的盐，其中
[0650]
r2选自h和cn；
[0651]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0652]
l是c
1-3
亚烷基，其中所述亚烷基任选地被1、2或3个独立地选择的r
8d
取代基取代；
[0653]
cy4选自苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基，其中所述苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基各自任选地被1、2或3个独立选自r
8d
和r8的取代基取代；
[0654]
每个r8独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r8的所述c
1-6
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8a
取代基取代；
[0655]
每个r
8a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、cn、or
a81
和nr
c81rd81
，其中r
8a
的所述c
1-3
烷基、5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0656]
每个r
a81
、r
c81
和r
d81
独立地选自h、c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基，其中r
a81
、r
c81
和r
d81
的所述c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0657]
每个r
8b
独立地选自卤基和c
1-3
烷基；并且
[0658]
每个r
8d
独立地选自oh、cn、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0659]
(c)式(iii)：
[0660][0661]
或其药学上可接受的盐，其中
[0662]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0663]
r2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中r2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；
[0664]
每个r
2a
独立地选自d、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0665]
r4选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r4的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
4a
取代基取代；
[0666]
每个r
4a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、cn、or
a41
和nr
c41rd41
；并且
[0667]
每个r
a41
、r
c41
和r
d41
独立地选自h和c
1-6
烷基；或
[0668]
(d)式(iv)；
[0669][0670]
或其药学上可接受的盐，其中
[0671]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0672]
cy2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中cy2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r6取代基取代；
[0673]
每个r6独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0674]
r2是苯基-c
1-3
烷基-或(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-和(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；并且
[0675]
每个r
2a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基。
[0676]
或其药学上可接受的盐。
[0677]
在一些实施方案中，人cd73的抑制剂包含：
[0678]
(a)抗体，所述抗体包含可变重(vh)结构域，所述可变重(vh)结构域包含vh互补决
定区(cdr)1、vh cdr2和vh cdr3，其中：
[0679]
vh cdr1包含氨基酸序列gytftsyg(seq id no:1)；
[0680]
vh cdr2包含氨基酸序列iypgsgnt(seq id no:2)；且
[0681]
vh cdr3包含氨基酸序列arydylgssygfdy(seq id no:3)；并且
[0682]
包含可变轻(vl)域，所述可变轻(vl)域包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其中：
[0683]
vl cdr1包含氨基酸序列qdvsta(seq id no:4)；
[0684]
vl cdr2包含氨基酸序列sas(seq id no:5)；且
[0685]
vl cdr3包含氨基酸序列qqhyntpyt(seq id no:6)；
[0686]
(b)在seq id no:70的氨基酸40-53内的表位处结合至人cd73的抗体；
[0687]
(c)结合至人cd73并与具有包含seq id no:24的氨基酸序列的重链和包含seq id no:25的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；或
[0688]
(d)包含vh结构域的抗体，所述vh结构域包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，其中：
[0689]
vh cdr1包含氨基酸序列gftfssyd(seq id no:34)；
[0690]
vh cdr2包含氨基酸序列msydgsnk(seq id no:35)或msyegsnk(seq id no:40)；并且
[0691]
vh cdr3包含氨基酸序列ateiaakgdy(seq id no:36)；和
[0692]
包含vl结构域的抗体，所述vl结构域包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其中：
[0693]
vl cdr1包含氨基酸序列qgisny(seq id no:37)；
[0694]
vl cdr2包含氨基酸序列aas(seq id no:38)；并且
[0695]
vl cdr3包含氨基酸序列qqsystph(seq id no:39)；
[0696]
(e)在seq id no:70的氨基酸386-399和470-489内的表位处结合至人cd73的抗体；
[0697]
(f)结合至人cd73并与具有包含seq id no:30的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；
[0698]
(g)结合至人cd73并与具有包含seq id no:33的氨基酸序列的重链和包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人cd73的抗体；
[0699]
(h)选自由11e1、medi9447、cpi-006和bms-986179组成的组的抗体；或
[0700]
(i)选自由cb-708和ab680组成的组的抑制剂；并且
[0701]
a2a腺苷受体和/或a2b腺苷受体(a2a/a2b)的抑制剂包含以下化合物：
[0702]
(a)式(i)：
[0703][0704]
或其药学上可接受的盐，其中
[0705]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0706]
cy2是5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基，其中cy2的所述5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个各自独立地选自c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、nh2、nh(c
1-3
烷基)和n(c
1-3
烷基)2的基团取代；
[0707]
r2选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-和or
a2
，其中r2的苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的rc取代基取代；
[0708]ra2
是任选地被1或2个独立地选择的rc取代基取代的(5-7元杂芳基)-c
1-3
烷基-；
[0709]
每个rc独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c6芳基、5-7元杂芳基、(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基-、or
a4
和nr
c4rd4
；并且
[0710]
每个r
a4
、r
c4
和r
d4
独立地选自h和c
1-6
烷基；
[0711]
(b)式(ii)：
[0712][0713]
或其药学上可接受的盐，其中
[0714]
r2选自h和cn；
[0715]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0716]
l是c
1-3
亚烷基，其中所述亚烷基任选地被1、2或3个独立地选择的r
8d
取代基取代；
[0717]
cy4选自苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基，其中所述苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基各自任选地被1、2或3个独立选自r
8d
和r8的取代基取代；
[0718]
每个r8独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r8的所述c
1-6
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、苯基、c
3-7
环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-c
1-3
烷基、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8a
取代基取代；
[0719]
每个r
8a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、cn、or
a81
和nr
c81rd81
，其中r
8a
的所述c
1-3
烷基、5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0720]
每个r
a81
、r
c81
和r
d81
独立地选自h、c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基，其中r
a81
、r
c81
和r
d81
的所述c
1-6
烷基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
8b
取代基取代；
[0721]
每个r
8b
独立地选自卤基和c
1-3
烷基；并且
[0722]
每个r
8d
独立地选自oh、cn、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0723]
(c)式(iii)：
[0724][0725]
或其药学上可接受的盐，其中
[0726]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0727]
r2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中r2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；
[0728]
每个r
2a
独立地选自d、卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0729]
r4选自苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基，其中r4的所述苯基-c
1-3
烷基-、c
3-7
环烷基-c
1-3
烷基-、(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-和(4-7元杂环烷基)-c
1-3
烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
4a
取代基取代；
[0730]
每个r
4a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、cn、or
a41
和nr
c41rd41
；并且
[0731]
每个r
a41
、r
c41
和r
d41
独立地选自h和c
1-6
烷基；或
[0732]
(d)式(iv)；
[0733][0734]
或其药学上可接受的盐，其中
[0735]
cy1是被1或2个独立地选自卤基和cn的取代基取代的苯基；
[0736]
cy2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中cy2的所述5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选择的r6取代基取代；
[0737]
每个r6独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基；
[0738]
r2是苯基-c
1-3
烷基-或(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-，其中r2的所述苯基-c
1-3
烷基-和(5-6元杂芳基)-c
1-3
烷基-各自任选地被1、2或3个独立地选择的r
2a
取代基取代；并且
[0739]
每个r
2a
独立地选自卤基、c
1-6
烷基和c
1-6
卤代烷基。
[0740]
或其药学上可接受的盐。
[0741]
在一些实施方案中，cd73抑制剂包含抗体，所述抗体包含含有seq id no:22中列出的氨基酸序列的vh结构域和含有seq id no:23中列出的氨基酸序列的vl结构域，并且
a2a和或a2b腺苷受体抑制剂包含化合物3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0742]
在一些实施方案中，cd73抑制剂包含抗体，所述抗体包含含有seq id no:24中列出的氨基酸序列的重链和含有seq id no:25中列出的氨基酸序列的轻链，并且a2a和或a2b腺苷受体抑制剂包含化合物3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0743]
在一些实施方案中，cd73抑制剂包含抗体，所述抗体包含含有seq id no:62中列出的氨基酸序列的vh结构域和含有seq id no:61中列出的氨基酸序列的vl结构域，并且a2a和或a2b腺苷受体抑制剂包含化合物3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0744]
在一些实施方案中，cd73抑制剂包含抗体，所述抗体包含含有seq id no:30中列出的氨基酸序列的重链和含有seq id no:31中列出的氨基酸序列的轻链，并且a2a和或a2b腺苷受体抑制剂包含化合物3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0745]
在一些实施方案中，cd73抑制剂包含抗体，所述抗体包含含有seq id no:63中列出的氨基酸序列的vh结构域和含有seq id no:61中列出的氨基酸序列的vl结构域，并且a2a和或a2b腺苷受体抑制剂包含化合物3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0746]
在一些实施方案中，cd73抑制剂包含抗体，所述抗体包含含有seq id no:33中列出的氨基酸序列的重链和含有seq id no:31中列出的氨基酸序列的轻链，并且a2a和或a2b腺苷受体抑制剂包含化合物3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈。
[0747]
基于cd73以及a2a和/或a2b腺苷受体在多重免疫抑制机制中的重要作用，组合疗法可增强免疫系统来抑制肿瘤进展。cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂可组合使用，以任选地与其他疗法以进一步组合形式治疗膀胱癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(nsclc)、肺转移)、黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、子宫癌、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)和肾细胞癌。在一些实施方案中，前列腺癌是转移性去势抗性前列腺癌(mcrpc)。在一些实施方案中，结肠直肠癌(colorectal cancer)是结肠直肠癌(colorectal carcinoma)(crc)。
[0748]
在一些实施方案中，疾病或病症是肺癌(例如，非小细胞肺癌)、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、子宫内膜癌、膀胱癌、皮肤癌、子宫癌、肾癌、胃癌或肉瘤。在一些实施方案中，肉瘤是阿斯金氏肿瘤(askin's tumor)、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma)、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤(gist)、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性外周神经鞘膜瘤(mpnst)、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤或未分化多形性肉瘤。
[0749]
在一些实施方案中，疾病或病症是头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、结肠直肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(nsclc))、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌(例如肝细胞癌)或肾细胞癌。
[0750]
在一些实施方案中，疾病或病症是间皮瘤或腺癌。在一些实施方案中，疾病或病症是间皮瘤。在一些实施方案中，疾病或病症是腺癌。
[0751]
mdsc(髓系衍生的抑制细胞)是来自髓样谱系(源自骨髓干细胞的细胞家族)的免疫细胞的异质组。由于造血功能的改变，mdsc在诸如慢性感染和癌症的病理情况下迅速扩增。mdsc与其他髓系细胞类型有所区别，其他类型的髓系细胞具有强大的免疫抑制活性而非免疫刺激特性。与其他髓系细胞类似，mdsc与其他免疫细胞类型(包括t细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞)相互作用，以调控其功能。在一些实施方案中，本文所述的化合物等可用于与具有高mdsc浸润的癌组织(例如肿瘤)相关的方法中，所述癌组织包括具有高基础水平的巨噬细胞和/或mdsc浸润的实体瘤。
[0752]
在一些实施方案中，本公开的cd73抑制剂与a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂可组合用于治疗肺部炎症，包括博来霉素诱导的肺纤维化和与腺苷脱氨酶缺乏相关的损伤。
[0753]
在一些实施方案中，本公开的cd73抑制剂与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂可组合用于治疗炎性疾病，诸如过敏反应(例如cd73和/或a2a和/或a2b腺苷受体依赖性过敏反应)以及其他cd73和/或a2a和/或a2b腺苷受体免疫反应。可通过本公开的cd73抑制剂与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂的组合治疗的另外的炎性疾病包括呼吸系统病症、败血症、再灌注损伤和血栓形成。
[0754]
在一些实施方案中，本公开的cd73抑制剂与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂可组合用于治疗心血管疾病，诸如冠状动脉疾病(心肌梗塞、心绞痛、心脏衰竭)、脑血管疾病(中风、暂时性脑缺血发作)、外周动脉疾病以及主动脉粥样硬化和动脉瘤。动脉粥样硬化是许多类型心血管疾病的潜在病因。动脉粥样硬化始于青春期的脂肪条纹，成年后发展成斑块，并且最终导致血栓形成事件，其引起血管闭塞，导致临床上显著的发病率和死亡率。
[0755]
在一些实施方案中，本公开的cd73抑制剂与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂可组合用于治疗运动活动障碍；由纹状体多巴胺系统退化引起的缺乏症；以及帕金森氏病；抑郁的一些动机症状。
[0756]
在一些实施方案中，本公开的cd73抑制剂与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂可组合用于治疗糖尿病和相关疾病，诸如胰岛素抗性。糖尿病影响腺苷的产生以及刺激il-6和crp产生的a2b腺苷受体(a2br)的表达、胰岛素抗性以及a2br基因单核苷酸多态性(adora2b snp)与炎症标志物之间的关联。糖尿病中增加的a2br信号传导可部分通过升高促炎性介体来增强胰岛素抗性。选择性cd73抑制剂可用于治疗胰岛素抗性。
[0757]
可互换使用的术语“个体”或“患者”或“受试者”是指任何动物，包括哺乳动物，优选小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，并且最优选人(即人受试者)。
[0758]
短语“治疗有效量”是指引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生寻求的在组织、系统、动物、个体或人中的生物学或医学反应的活性抗体或药剂的量。
[0759]
如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”是指以下中的一项或多项：(1)抑制疾病；例如在正经历或展示出疾病、病状或病症的病变或症状的个体中抑制疾病、病状
或病症(即，遏制病变和/或症状的进一步发展)；和(2)改善疾病；例如在正经历或展示出疾病、病状或病症的病变或症状的个体中改善疾病、病状或病症(即，逆转病变和/或症状)，诸如降低疾病的严重程度。
[0760]
在一些实施方案中，本公开的cd73抑制剂与a2a和/或a2b腺苷受体抑制剂可组合用于预防或降低发展出本文所提及的任何疾病的风险；例如，预防或降低可能易患所述疾病、病状或病症但尚未经历或未展示出所述疾病的病理学或症状学的个体发展出疾病、病状或病症的风险。
[0761]
药物组合物
[0762]
本文所述的cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂可配制成药物组合物用于向受试者施用来例如治疗本文所述的病症。在一些情况下，药物组合物包含cd73抑制剂作为单一剂。在一些情况下，药物组合物包含a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂作为单一剂。在一些情况下，药物组合物包含cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂。
[0763]
通常，药物组合物包含药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括生理上可相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。组合物可包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见，例如berge,s.m.等人(1977)j.pharm.sci.66:1-19)。
[0764]
药物制剂是确立已久的技术并且进一步描述于例如gennaro(编),remington:the science and practice of pharmacy,第20版,lippincott,williams&wilkins(2000)(isbn:0683306472)；ansel等人,pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,第7版,lippincott williams&wilkins publishers(1999)(isbn:0683305727)；以及kibbe(编),handbook of pharmaceutical excipients american pharmaceutical association,第3版(2000)(isbn:091733096x)中。
[0765]
药物组合物可呈多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)、分散体或混悬液、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选形式可取决于预期的施用方式和治疗应用。通常，本文所述的剂的组合物呈可注射或可输注溶液的形式。
[0766]
组合物可配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体、或适于在高浓度下稳定储存的其他有序结构。可通过将本文所述的剂以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，接着进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般而言，分散体通过将本文所述的剂掺入无菌媒介物中来制备，所述媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前经无菌过滤的溶液产生本文所述的剂加上任何另外所需成分的粉末。溶液的适当流动性可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂(lecithin))、在分散体的情况下通过保持所需粒度和通过使用表面活性剂加来保持。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。
[0767]
在某些实施方案中，cd73抑制剂和/或a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂可用将防止化合物快速释放的载剂制备，诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊包封的递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已被授予专利或一般
是已知的。参见，例如sustained and controlled release drug delivery systems,j.r.robinson编,marcel dekker,inc.,new york(1978)。
[0768]
施用
[0769]
cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂可通过多种方法向受试者，例如有此需要的受试者，例如人受试者施用。在一些情况下，cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂通过相同途径向受试者施用。在一些情况下，cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂通过不同途径向受试者施用。对于许多应用，施用途径是以下之一：静脉内注射或输注(iv)、皮下注射(sc)、腹膜内(ip)或肌内注射。还可能使用关节内递送。还可使用胃肠外施用的其他方式。此类方式的实例包括：动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、经气管、皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、以及硬膜外和胸骨内注射。在一些情况下，施用可以是经口的。
[0770]
cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂的施用途径和/或方式还可针对个体情况来定制，例如通过例如使用断层扫描成像例如以使肿瘤可视化来监测受试者实现所述定制。
[0771]
cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂各自可以固定剂量或以mg/kg患者重量剂量来施用。还可选择剂量以减少或避免针对cd73抑制剂或a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂的抗体的产生。调整剂量方案以提供所期望的反应，例如治疗反应或组合治疗效果。一般而言，可使用cd73抑制剂以及a2a和/或a2b腺苷受体的抑制剂的剂量，以便向受试者提供生物可利用量的剂。
[0772]
如本文所用的剂量单位形式或“固定剂量”或“平稳剂量”是指对于待治疗的受试者适合作为单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生所期望治疗效果的预定量的活性化合物与所需药物载剂的结合和任选地与其他剂的结合。可给予单剂量或多剂量。或者或另外，抗体和/或抑制剂可经由连续输注施用。
[0773]
以下是本发明的实践的实施例。它们不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。
[0774]
实施例
[0775]
提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明，并且其不应解释为限制本发明的范围。就提及特定材料的程度而言，其仅出于说明目的，并不意图限制本发明。在不行使本发明的能力并且不脱离本发明的范围的情况下，本领域技术人员可开发等效手段或反应物。
[0776]
实施例a：a2a/a2b抑制剂的活性
[0777]
i.a2ahtrf测定
[0778]
在黑色低容量384孔聚苯乙烯板(greiner 784076-25)中进行测定，最终体积为10μl。测试化合物首先在dmso中连续稀释并且将100nl添加至板孔中，然后添加其他反应组分。dmso的最终浓度为1％。将腺苷a2a标记的细胞(cisbio c1tt1a2a)1:5稀释至tag-lite缓冲剂(cisbio labmed)中并以1200g旋转5分钟。将丸状沉淀以体积10.4x初始细胞悬浮液体积重悬于tag-lite缓冲剂中，并以12.5nm最终浓度添加腺苷a2a受体红色拮抗剂荧光配体(cisbio l0058red)。将10ul细胞与配体混合物添加至测定孔中并在室温下孵
育45分钟，然后在带有htrf 337/620/665光学模块的pherastar fs读板器(bmg labtech)上读数。计算荧光配体的结合百分比；其中100nm的a2a拮抗剂对照zm 241385(tocris 1036)置换配体100％并且1％dmso具有0％置换。将％结合数据相对于抑制剂浓度的对数拟合至单点竞争性结合模型(graphpad prism版本7.02)，其中配体常数＝12.5nm，配体kd＝1.85nm。经由此方法获得的ki数据示于表7中。
[0779]
ii.腺苷a2b受体环状amp gs测定
[0780]
将表达人腺苷a2b受体的稳定转染的hek-293细胞(perkin elmer)保持在含有10％fbs和100μg/ml遗传霉素的mem培养基(life technologies)中。测定之前18至24小时，从培养物中去除遗传霉素。将利用fret(fluorescence resonance energy transfer)技术的cisbio camp-gs dynamic试剂盒用于测量细胞中的camp累积。将本公开的化合物以适当浓度与10000个细胞/孔在白色96孔半面积板(perkin elmer)中在室温下伴随轻微摇动混合30min。将激动剂neca(r&d technologies)以12nm在室温下伴随轻微摇动添加至每个孔中持续60min。将检测试剂、d2标记的camp(接受体)和抗camp穴状化合物(供体)在室温下伴随轻微摇动添加至每个孔中持续60min。在pherastar(bmg labtech)上读取板，计算荧光比665/620，并通过使用graphpad prism拟合对照百分比与化合物浓度的对数的曲线来进行ec
50
测定。经由此方法获得的ec
50
数据示于表7中。
[0781]
表7.a
2a
_ki数据(实施例a(i))和a
2b
_camp_ec
50
数据(实施例a(ii))在下文中提供。
[0782][0783][0784]
表示a
2a
_ki或a
2b
_camp_ec
50
≤10nm，
[0785]
表示a
2a
_ki或a
2b
_camp_ec
50
》10nm，但≤100nm，
[0786]
表示a
2a
_ki或a
2b
_camp_ec
50
》100nm，但≤1μm，
[0787]
表示a
2a
_ki或a
2b
_camp_ec
50
大于1μm。
[0788]
实施例a1：3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物1)的合成
[0789][0790]
步骤1：3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈
[0791][0792]
将4,6-二氯嘧啶-2-胺(2.5g，15.2mmol)、(3-氰基苯基)硼酸(2.02g，13.7mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(1.06g，0.92mmol)和碳酸钠(3.23g，30.5mmol)在1,4-二噁烷(60ml)和水(5ml)中的混合物用氮气脱气，然后将所得混合物加热并在60℃下搅拌两天。在冷却至室温(r.t.)后，将混合物浓缩，用水稀释并且用dcm(30ml x 3)萃取。将合并的有机层经mgso4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱快速色谱(用含8％etoac的二氯甲烷洗脱)纯化所得残余物以得到所期望的产物。c
11
h8cln4的lcms计算值(m+h)
+
：231.0。实测值：231.0。
[0793]
步骤2：2-(吡啶-2-基)乙酰肼
[0794][0795]
将肼(4.15ml，132mmol)在室温下添加至2-(吡啶-2-基)乙酸甲酯(10g，66.2mmol)的乙醇(66ml)溶液中。将混合物在85℃下加热并搅拌4h，然后冷却至室温。静置时形成白色固体，将其经由过滤收集，并且不经进一步纯化即用于下一步骤。c7h
10
n3o的lcms计算值(m+h)
+
：152.1。实测值：152.0。
[0796]
步骤3：3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0797][0798]
将2-(吡啶-2-基)乙酰肼(2.62g，17.34mmol)在室温下添加至3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈(4.00g，17.34mmol)的乙醇(35ml)溶液中。在回流下加热并搅拌2h后，将反应混合物冷却至室温，并浓缩。将所得残余物加入n,o-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(20ml)中，并在120℃下搅拌7h。然后将混合物冷却至室温，倒在冰上，并在室温下搅拌1h。通过过滤收集所得固体，并将其加入20ml的1n hcl溶液中。将所得混合物在室温下搅拌1h，过滤，
并通过添加饱和nahco3溶液中和水层。将所得沉淀物通过过滤收集并干燥以获得呈棕色固体状的期望产物。c
18h14
n7的lcms计算值(m+h)
+
：328.1；实测值：328.1。
[0799]
步骤4：3-(5-氨基-8-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0800][0801]
向3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(2g，6.11mmol)在dmf(12ml)中的混合物中在-30℃下逐份添加nbs(1.09g，6.11mmol)。使反应混合物缓慢升温至0℃，得到均质溶液。在0℃下搅拌1h之后，将反应混合物用饱和nahco3溶液稀释，并通过过滤收集所得固体。通过硅胶柱快速色谱(用含0％至10％meoh的dcm洗脱)纯化固体以得到期望产物。c
18h13
brn7的lcms计算值(m+h)
+
：406.0；实测值：406.0。
[0802]
步骤5：3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0803]
将pd(ph3p)4(284mg，0.246mmol)添加至4-(三丁基锡烷基)嘧啶(1090mg，2.95mmol)、3-(5-氨基-8-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(1000mg，2.46mmol)和氯化铜(i)(244mg，2.46mmol)在1,4-二噁烷(12ml)中的混合物中。将反应混合物用n2吹扫并在80℃下搅拌7h。将所得混合物冷却至室温，浓缩，用dcm(50ml)稀释，并用饱和nh4oh溶液洗涤。将有机层经na2so4干燥，浓缩并通过制备型lc-ms(ph 2，乙腈/水，含tfa)纯化以得到呈tfa盐形式的产物。c
22h16
n9的lcms计算值(m+h)
+
：406.2；实测值：406.2。1h nmr(500mhz,dmso)δ8.95(s,1h),8.83(d,j＝5.3hz,1h),8.59(d,j＝5.1hz,1h),7.96(m,1h),7.88(d,j＝5.1hz,1h),7.82(d,j＝7.6hz,1h),7.76(s,1h),7.60
–
7.53(m,2h),7.53
–
7.48(m,1h),7.48
–
7.42(m,1h),4.49(s,2h)。
[0804]
实施例a2：3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物2)的合成
[0805][0806]
步骤1：2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯
[0807][0808]
将浓硫酸(1.42ml，27mmol)在0℃下添加至2,6-二氟扁桃酸(5g，27mmol)的甲醇(45ml)溶液中。在室温下搅拌混合物4h，然后浓缩。向所得浆料中添加饱和nahco3溶液(30ml)。用dcm(3x20 ml)萃取所得混合物。将合并的有机层用水洗涤，经mg2so4干燥，过滤并浓缩以得到粗产物，其不经进一步纯化即用于下一步骤。c
11h12
f2no3的lc-ms计算值(m+h+
mecn)
+
：m/z＝244.1；实测值244.2。
[0809]
步骤2：3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0810]
使用如实施例a1所描述的类似程序，在步骤2中用2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯替换2-(吡啶-2-基)乙酸甲酯来制备此化合物。使用phenomenex lux cellulose-1柱(21.2x 250mm，5μm粒度)，用等度流动相含25％meoh的co2洗脱(流速为80ml/分钟)，通过手性sfc分离两种对映体。分离峰1，并通过制备型lcms(ph＝2，mecn/水，含tfa)进一步纯化以得到呈tfa盐形式的期望产物。c
23h15
f2n8o的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝457.1；实测值457.1。1h nmr(500mhz,dmso)δ8.94(d,j＝1.3hz,1h),8.81(d,j＝5.2hz,1h),7.85(dd,j＝5.3,1.4hz,1h),7.81(dt,j＝7.4,1.5hz,1h),7.76(t,j＝1.7hz,1h),7.55(dt,j＝7.8,1.5hz,1h),7.49(t,j＝7.8hz,1h),7.44(tt,j＝8.4,6.4hz,1h),7.09(t,j＝8.3hz,2h),6.27(s,1h)。
[0811]
实施例a3：3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2h-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物3a)和3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物3b)的合成
[0812][0813]
步骤1：3-(5-氨基-2-(羟甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0814]
将2-羟基乙酰肼(2.34g，26.01mmol)在室温下添加至3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈(4.00g，17.34mmol)的乙醇(35ml)溶液(实施例a1，步骤1)中。在回流下加热并搅拌2h后，将反应混合物冷却至室温，并浓缩。将所得残余物加入n,o-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(20ml)中，并在120℃下搅拌7h。然后将混合物冷却至室温，倒在冰上，并在室温下搅拌1h。通过过滤收集所得固体，并将其加入20ml的1n hcl溶液中。将所得混合物在室温下搅拌1h，过滤，并通过添加饱和nahco3溶液中和水层。将所得沉淀物通过过滤收集并干燥以获得呈棕色固体状的期望产物。c13h11n6o的lcms计算值：(m+h)+：267.1；实测值：267.1。
[0815]
步骤2：3-(5-氨基-8-溴-2-(羟甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0816]
在-30℃下向3-(5-氨基-2-(羟甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(1.0g，3.76mmol)在dmf(12ml)中的混合物中逐份添加nbs(0.67g，3.76mmol)。使反应混合物缓慢升温至0℃，得到均质溶液。在0℃下搅拌1h之后，将反应混合物用饱和nahco3溶液稀释并通过过滤收集期望产物并干燥。c13h10brn6o的lcms计算值(m+h)+：345.0；实测值：345.0。
[0817]
步骤3：3-(5-氨基-2-(羟甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0818]
将四(三苯基膦)钯(0)(0.067g，0.058mmol)添加至4-(三丁基锡烷基)嘧啶
(0.321g，0.869mmol)、3-(5-氨基-8-溴-2-(羟甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(0.20g，0.579mmol)、csf(0.176g，1.159mmol)和碘化铜(i)(0.022g，0.116mmol)在1,4-二噁烷(5.0ml)中的混合物中。将反应混合物用n2吹扫并在80℃下搅拌7h。将所得混合物冷却至室温，浓缩并通过快速柱色谱(用含0％至10％甲醇的dcm洗脱)纯化以得到产物。c17h13n8o的lc-ms计算值(m+h)+：345.1；实测值：345.1。
[0819]
步骤4：3-(5-氨基-2-(氯甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0820][0821]
在室温下向3-(5-氨基-2-(羟甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(0.1g，0.290mmol)在乙腈(10ml)中的混合物中添加亚硫酰氯(0.212ml，2.90mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5h，浓缩并通过快速色谱(用含0％至5％甲醇的dcm洗脱)纯化以得到产物。c
17h12
cln8的lc-ms计算值(m+h)
+
：363.1；实测值：363.1。
[0822]
步骤5：3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2h-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物3a)与3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物3b)的混合物
[0823]
将3-(5-氨基-2-(氯甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(10mg，0.028mmol)、2-(1h-四唑-5-基)吡啶(8.1mg，0.055mmol)和cs2co3(20.7mg，0.064mmol)在dmf(1ml)中的混合物在100℃下搅拌10min。然后将反应混合物冷却至室温，用甲醇(4ml)稀释，并通过制备型lc-ms(ph 2，乙腈/水，含tfa)纯化以得到呈tfa盐形式的产物。c
23h16n13
的lcms计算值(m+h)
+
：474.2；实测值：474.2。
[0824]
化合物3a：1h nmr(500mhz,dmso)δ8.99(d,j＝1.4hz,1h),8.85(d,j＝5.3hz,1h),8.80
–
8.71(m,1h),8.71
–
8.39(b,2h),8.18(d,j＝7.7,1.1hz,1h),8.04(t,j＝7.8,1.8hz,1h),7.85(m,2h),7.80
–
7.76(m,1h),7.62
–
7.55(m,2h),7.53(t,j＝7.8hz,1h),6.39(s,2h)。
[0825]
实施例a4：3-(5-氨基-2-((3-甲基吡啶-2-基)甲氧基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物4)的合成
[0826][0827]
步骤1：6-氯-n2,n
2-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2,4-二胺
[0828][0829]
向2,6-二氯嘧啶-4-胺(5.0g，31mmol)在2-丙醇(31ml)中的溶液中添加n,n-二异丙基乙胺(6.4ml，37mmol)和双(4-甲氧基苄基)胺(7.9g，31mmol)。将所得溶液在100℃下搅拌16h，冷却至室温，用水(100ml)稀释并用etoac(100ml)萃取。将有机层用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，并浓缩以得到粗产物，其不经进一步纯化即用于下一步骤。c
20h22
cln4o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：385.1；实测值：385.1。
[0830]
步骤2：7-氯-n5,n
5-双(4-甲氧基苄基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-2,5-二胺
[0831][0832]
在室温下将异硫氰酰甲酸乙酯(o-ethyl carbonisothiocyanatidate)(3.1ml，26mmol)添加至6-氯-n2,n
2-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2,4-二胺(1.0g，2.6mmol)的1,4-二噁烷(5.0ml)溶液中。然后在90℃下搅拌反应混合物过夜，冷却至室温并浓缩。将所得物质溶解在甲醇(12ml)和乙醇(12ml)中，并添加n,n-二异丙基乙胺(0.91ml，5.2mmol)，接着添加盐酸羟胺(0.54g，7.8mmol)。在45℃下搅拌反应混合物2h，冷却至室温并浓缩。将所得物质加入etoac中，用水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。将粗物质通过硅胶色谱(用含0％至50％etoac的己烷洗脱)纯化以得到产物。c
21h22
cln6o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：425.1；实测值：425.2。
[0833]
步骤3：3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0834][0835]
将氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(ii)(330mg，0.42mmol)添加至(3-氰基苯基)硼酸(460mg，3.2mmol)、7-氯-n5,n
5-双(4-甲氧基苄基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-2,5-二胺(890mg，2.1mmol)和碳酸钠(890mg，8.4mmol)在1,4-二噁烷(8.8ml)和水(1.8ml)中的混合物中。将混合物用n2吹扫并
在95℃下搅拌过夜。然后将反应混合物冷却至室温，浓缩并通过硅胶色谱(用含0至50％etoac的dcm洗脱)纯化以得到期望产物。c
28h26
n7o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：492.2；实测值：492.2。
[0836]
步骤4：3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-8-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0837][0838]
在0℃下向3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(330mg，0.66mmol)在dmf(1.4ml)中的溶液中缓慢添加nbs(120mg，0.66mmol)。然后在室温下搅拌反应混合物30min，然后添加水(10ml)。将所得固体通过过滤收集并干燥以获得期望产物。c
28h25
brn7o2的lc-ms计算值：(m+h)+:m/z＝570.1；实测值：570.2。
[0839]
步骤5：3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0840][0841]
将3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-8-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(350mg，0.61mmol)、4-(三丁基锡烷基)嘧啶(210μl，0.67mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(70mg，0.060mmol)、碘化铜(i)(23mg，0.12mmol)和氟化铯(180mg，1.2mmol)在二噁烷(4.7ml)中的混合物在140℃下在微波反应器中加热并搅拌30min。然后将反应混合物冷却至室温，通过硅藻土塞过滤(用dcm洗涤)并浓缩。将所得物质通过硅胶柱色谱(用0-20％meoh/dcm洗脱)纯化以得到期望产物。c
32h28
n9o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝570.2；实测值570.3。
[0842]
步骤6：3-(5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0843][0844]
在50℃下，在氮气下向溴化铜(ii)(91mg，0.407mmol)与亚硝酸叔丁酯(0.054ml，0.407mmol)在乙腈(3ml)中的混合物中逐滴添加在乙腈(3ml)中的3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(100mg，0.203mmol)。在50℃下将混合物搅拌2小时。冷却至室温后，添加1n nh4oh水溶液(20ml)，并将混合物用ch2cl2(20ml)萃取三次。将合并的有机层经硫酸钠干燥、过滤并浓缩。将粗物质通过硅胶柱色谱(用50-100％乙酸乙酯/己烷洗脱)纯化以得到期望产物。c
32h26
brn8o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝633.1；实测值633.2。
[0845]
步骤7：3-(5-氨基-2-((3-甲基吡啶-2-基)甲氧基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0846]
将氢化钠(在矿物油中60％，3.8mg，0.095mmol)、3-(5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(20mg，0.032mmol)和(3-甲基吡啶-2-基)甲醇(9.1μl，0.095mmol)在1,4-二噁烷(1ml)中的悬浮液在110℃下在氮气下加热并搅拌过夜。然后将反应混合物冷却至室温，浓缩并添加tfa(1.0ml)。然后将所得混合物在110℃下搅拌30min，冷却至室温，用乙腈稀释，过滤，并通过制备型lc-ms(ph 2，乙腈/水，含tfa)纯化以得到呈tfa盐形式的期望产物。c
23h18
n9o的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝436.2；实测值436.2。1h nmr(600mhz,dmso)δ8.97(d,j＝1.4hz,1h),8.88(d,j＝5.2hz,1h),8.58
–
8.52(m,1h),7.97(d,j＝7.8hz,1h),7.88(dd,j＝5.4,1.4hz,1h),7.85(dt,j＝7.5,1.5hz,1h),7.78(t,j＝1.8hz,1h),7.60
–
7.54(m,2h),7.53(t,j＝7.8hz,1h),5.69(s,2h),2.48(s,3h)。
[0847]
实施例a5：3-(5-氨基-2-(羟基(苯基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物5)的合成
[0848][0849]
步骤1：3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈
[0850][0851]
将4,6-二氯嘧啶-2-胺(2.5g，15.24mmol)、(3-氰基苯基)硼酸(2.016g，13.72mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(1.057g，0.915mmol)和碳酸钠(3.23g，30.5mmol)在1,4-二噁烷(60ml)和水(5ml)中的混合物用氮气脱气，随后将所得混合物在60℃下加热两天。在冷却至室温(rt)之后，将混合物浓缩，然后用水稀释，并用二氯甲烷(dcm，3x 30ml)萃取。将合并的有机层经mgso4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶柱快速色谱(用含8％乙酸乙酯(etoac)的二氯甲烷洗脱)纯化以得到期望产物。c
11
h8cln4的lcms计算值(m+h)
+
：231.0。实测值：231.0。
[0852]
步骤2：3-(5-氨基-2-(羟基(苯基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
[0853]
将3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈(100mg，0.434mmol)和2-羟基-2-苯基乙酰肼(108mg，0.650mmol)在乙醇(2ml)中的溶液在95℃下加热并搅拌3h。冷却至室温之后，将反应混合物浓缩至干燥，加入n,o-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(1ml)中并在120℃下搅拌7h。将所得混合物冷却至室温，倒在冰上并搅拌1h。将所得悬浮液用dcm萃取三次。将合并的有机层经mgso4干燥，过滤并浓缩。将残余物溶解在甲醇(meoh)中，并通过制备型lc-ms(ph 2，乙腈/水，含tfa)纯化以得到呈tfa盐形式的产物。c
19h15
n6o的lcms计算值(m+h)
+
：343.1；实测值：343.1。
[0854]
实施例a6：3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(化合物6)的合成
[0855][0856]
步骤1：3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)-2-氟苯甲腈
[0857][0858]
经20min向冷却至0℃的3-溴-2-氟苯甲腈(18.3g，91mmol)在thf(60ml)中的溶液中添加thf(1.3m)中的i-prmgcl licl复合物(70.4ml，91mmol)。在0℃下搅拌混合物50min，然后在0℃下添加2-methf(1.9m)中的氯化锌(48.1ml，91mmol)。在室温下搅拌反应25min，此时一次性添加4,6-二氯嘧啶-2-胺(10g，61.0mmol)。搅拌溶液10min。将四(三苯基膦)钯(1.41g，1.22mmol)添加至混合物中并在室温下搅拌反应16h。完成之后，将2,4,6-三巯基三嗪硅胶(2g)添加至反应溶液中。搅拌混合物1h并过滤。用乙酸乙酯洗涤固体，直至期望产物完全洗脱(通过lcms检测)。将滤液用饱和氯化铵溶液和水洗涤。浓缩有机物以得到粗产物。将水添加至粗物质中，并通过过滤收集所得沉淀物，并在氮气流下干燥。粗物质不经另外的
纯化即可继续使用。c
11
h7clfn4的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝249.0；实测值249.0。
[0859]
步骤2：2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯
[0860][0861]
在0℃下将浓硫酸(1.4ml，27mmol)添加至2,6-二氟扁桃酸(5.0g，27mmol)的甲醇(45ml)溶液中。在室温下搅拌混合物4h，然后浓缩。向所得浆料中添加饱和nahco3溶液。将所得混合物用dcm萃取。将合并的有机层用水洗涤，经mgso4干燥，过滤并浓缩以得到粗产物，其不经进一步纯化即用于下一步骤。c
11h12
f2no3的lc-ms计算值(m+h+mecn)
+
：m/z＝244.1；实测值244.2。
[0862]
步骤3：2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酰肼
[0863][0864]
将肼(3.0ml，96mmol)在室温下添加至2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯(10.8g，53mmol)的乙醇(90ml)溶液中。将反应混合物在100℃下搅拌2h，冷却至室温，浓缩并且不经进一步纯化即用于下一步骤。c8h9f2n2o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：203.1；实测值：203.2。
[0865]
步骤4：3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
[0866]
使用如实施例a5步骤2所描述的类似程序，用3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)-2-氟苯甲腈替换3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈并用2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酰肼替换2-羟基-2-苯基乙酰肼来制备标题化合物。使用phenomenex(r,r)-whelk-o1柱(21.2x 250mm，5μm粒度)，用等度流动相含15％meoh的co2洗脱(流速为85ml/分钟)，通过手性sfc分离两种对映体。峰一和峰二的保留时间分别为3.8min和5.3min。浓缩之后，通过制备型lcms(ph＝2，mecn/水，含tfa)纯化峰二以得到呈tfa盐形式的期望产物。c
19h12
f3n6o的lc-ms计算值：(m+h)
+
：397.1；实测值：397.1。
[0867]
实施例a7：5-氨基-7-(3-氰基-2-氟苯基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-8-甲腈(化合物7)的合成
[0868][0869]
步骤1：3-(5-氨基-8-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
[0870]
[0871]
使用如实施例a1步骤4所描述的类似程序，用3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(来自实施例a6)替换3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈来制备此化合物。c
19h11
brf3n6o的lcms计算值(m+h)
+
：475.0；实测值：475.0。
[0872]
步骤2：5-氨基-7-(3-氰基-2-氟苯基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-8-甲腈
[0873]
将3-(5-氨基-8-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(0.12g，0.25mmol)、zncn2(0.060g，0.51mmol)和tbuxphos pd g3(0.020g，0.025mmol)在1,4-二噁烷(0.63ml)和水(0.63ml)中的混合物用n2吹扫并在100℃下搅拌1h。冷却至室温后，将反应用饱和nahco3稀释，并将有机物用etoac(3x)萃取。将合并的有机物经mgso4干燥并浓缩。使用phenomenex lux celluose-4柱(21.2x 250mm，5μm粒度)，用等度流动相含60％etoh的己烷洗脱(流速为20ml/分钟)，通过手性hplc分离两种对映体。峰一和峰二的保留时间分别为4.9min和7.2min。浓缩后，通过制备型lc-ms(ph 2，乙腈/水，含tfa)纯化峰一以得到呈tfa盐形式的期望产物。c
20h11
f3n7o的lc-ms计算值(m+h)
+
：422.1；实测值：422.1。
[0874]
实施例a8：3-(5-氨基-2-((2-氟-6-(((1-甲基-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基)甲基)苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(化合物8)的合成
[0875][0876]
步骤1：2-(2-氟-6-乙烯基苯基)乙酸甲酯
[0877][0878]
将2-(2-溴-6-氟苯基)乙酸甲酯(6.0g，24mmol)、磷酸三钾(15.5g，73mmol)、乙酸钯(ii)(0.55g，2.4mmol)和sphos(1.0g，2.4mmol)的混合物添加至500ml压力容器中。接下来，添加在二噁烷(150ml)和水(15ml)中的4,4,5,5-四甲基-2-乙烯基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(6.4ml，36mmol)，将反应混合物用n2吹扫，并在80℃下搅拌16h。然后将反应混合物冷却至室温，浓缩并用etoac(x3)萃取。将合并的有机层经mgso4干燥，浓缩，并通过柱色谱(含0至50％etoac的dcm)纯化。c11h12fo2的lc-ms计算值(m+h)+：195.1；实测值：195.1。
[0879]
步骤2：2-(2-氟-6-乙烯基苯基)-2-羟基乙酸甲酯
[0880][0881]
将2-(2-氟-6-乙烯基苯基)乙酸甲酯(2.5g，12.9mmol)溶解在thf(130ml)中并冷却至-78℃。逐滴添加在thf(1.0m)中的lda(16.7ml，16.7mmol)，并且在-78℃下搅拌所得溶液30min。然后逐滴添加在thf(0.5m)中的9,9-二甲基四氢-4h-4a,7-甲桥苯并[c][1,2]氧杂氮杂环丙烯并[2,3-b]异噻唑3,3-二氧化物(4.7g，20.6mmol)。在-78℃下30min之后，将反应混合物升温至0℃并搅拌1h。将反应用饱和nh4cl淬灭。将水层用dcm(3x)萃取。将合并
的有机物经无水na2so4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗产物通过柱色谱(用含0至50％乙酸乙酯的己烷洗脱)纯化以得到期望产物。c
11h11
fo3na的lcms计算值(m+na)
+
：233.1；实测值：233.1。
[0882]
步骤3：2-(2-氟-6-乙烯基苯基)-2-羟基乙酰肼
[0883][0884]
使用如实施例a6步骤3所描述的类似程序，用2-(2-氟-6-乙烯基苯基)-2-羟基乙酸甲酯替换2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯来制备此化合物。c
10h12
fn2o2的lcms计算值(m+h)
+
：211.1；实测值：211.1。
[0885]
步骤4：3-(5-氨基-2-((2-氟-6-乙烯基苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
[0886][0887]
使用如实施例a6步骤4所描述的类似程序，用2-(2-氟-6-乙烯基苯基)-2-羟基乙酰肼代替2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酰肼来制备此化合物。c21h15f2n6o的lcms计算值(m+h)+：405.1；实测值：405.1。
[0888]
步骤5：3-(5-氨基-2-((2-氟-6-甲酰基苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
[0889][0890]
将在水中的四氧化锇(4％w/w，0.36ml，0.12mmol)添加至3-(5-氨基-2-((2-氟-6-乙烯基苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(930mg，2.30mmol)的thf(18ml)和水(4.6ml)溶液中。在室温下搅拌反应混合物5分钟，然后添加过碘酸钠(2.5g，11.5mmol)。搅拌1h之后，将混合物用nahco3饱和水溶液(5％w/w，20ml)中的偏二亚硫酸钠稀释，并用etoac(x3)萃取。将合并的有机层经mgso4干燥并在减压下浓缩。将粗物质通过柱色谱(用含0至100％乙酸乙酯的己烷洗脱)纯化以得到期望产物。c20h13f2n6o2的lcms计算值(m+h)+：407.1；实测值：407.1。
[0891]
步骤6：3-(5-氨基-2-((2-氟-6-(((1-甲基-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基)甲基)苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
[0892]
将3-氨基-1-甲基吡咯烷-2-酮(63mg，0.55mmol)和3-(5-氨基-2-((2-氟-6-甲酰基苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(150mg，0.37mmol)在1,2-二氯乙烷(1.9ml)中的溶液在40℃下搅拌2h。然后添加三乙酰氧基硼氢化钠(160mg，0.74mmol)并将反应混合物在室温下搅拌16h。将反应物用饱和nahco3稀释，并将有机物用etoac萃取(3x)。将合并的有机物经mgso4干燥并浓缩。使用phenomenex lux celluose-4柱(21.2x 250mm，5μm粒度)，用等度流动相含45％etoh的己烷洗脱(流速为20ml/分钟)，通过
手性hplc分离非对映体。峰一和峰二的保留时间分别为14.9min和17.5min。浓缩之后，使用phenomenex lux celluose-1柱(21.2x 250mm，5μm粒度)，用等度流动相含30％etoh的己烷洗脱(流速为20ml/分钟)，通过手性hplc进一步分离峰二。峰一和峰二的保留时间分别为11.0min和15.5min。浓缩后，将峰一通过制备型lc-ms(ph＝2,mecn/水，含tfa)纯化以得到呈tfa盐形式的期望产物。c
25h23
f2n8o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：505.2；实测值：505.2。
[0893]
实施例a9：3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(化合物9)的合成
[0894][0895]
步骤1：3-溴-1-(2-(3-氰基苯基)-2-氧代乙基)-1h-1,2,4-三唑-5-羧酸甲酯
[0896][0897]
向3-溴-1h-1,2,4-三唑-5-羧酸甲酯(5.0g，24.3mmol)、3-(2-溴乙酰基)苯甲腈(5.44g，24.3mmol)在dmf(100ml)中的溶液中添加碳酸钾(3.35g，24.3mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物2h。然后用水和dcm稀释反应混合物。将有机层分离，用盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将所得残余物经由快速色谱纯化以得到呈白色固体状的期望产物(5.2g，61％)。c
13h10
brn4o3的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝349.0；实测值349.0。
[0898]
步骤2：3-(2-溴-8-氧代-7,8-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0899][0900]
将3-溴-1-(2-(3-氰基苯基)-2-氧代乙基)-1h-1,2,4-三唑-5-羧酸甲酯(10.5g，30.1mmol)溶解在乙酸(100ml)中，并添加乙酸铵(23.18g，301mmol)。在110℃下搅拌混合物12h。冷却至室温之后，将反应混合物用水稀释。将所得沉淀物经由过滤收集，用水洗涤，并在真空下干燥以得到产物(8.4g，88％)。c
12
h7brn5o的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝316.0；实测值316.0。
[0901]
步骤3：3-(2-溴-8-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0902]
[0903]
将3-(2-溴-8-氧代-7,8-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(8.4g，26.6mmol)与pocl3(49.5ml，531mmol)的混合物在110℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将反应混合物缓慢添加至含有冰和碳酸氢钠的烧瓶中。将所得沉淀物收集，用水洗涤，并干燥以得到产物(8.8g，99％)。c
12
h6brcln5的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝333.9；实测值334.0。
[0904]
步骤4.3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0905][0906]
将3-(2-溴-8-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(8.99g，26.9mmol)、双(4-甲氧基苄基)胺(10.37g，40.3mmol)和dipea(9.4ml，53.7mmol)在dmf(134ml)中的混合物在85℃下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，并用水稀释。将所得沉淀物经由过滤收集，并干燥以得到产物(14.1g，94％)。c
28h24
brn6o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝555.1；实测值555.1。
[0907]
步骤5：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0908][0909]
在-78℃下向2-甲基吡啶(0.050g，0.540mmol)在thf(0.5ml)中的溶液中添加2.5m正丁基锂(0.216ml，0.540mmol)。在相同温度下搅拌所得溶液1h，然后添加2-甲基四氢呋喃(0.284ml，0.540mmol)中的1.9m氯化锌，并且在室温下搅拌所得混合物10min。
[0910]
将装有3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(0.15g，0.270mmol)、乙酸钯(1.1mg，4.7μmol)和2'-(二环己基膦基)-n,n,n',n'-四甲基联苯-2,6-二胺(4.1mg，9.5μmol)的微波小瓶在高真空下抽真空并用氮气回填。然后将thf(2.0ml)和甲苯(0.5ml)添加至反应小瓶中。将混合物冷却至0℃并经由注射器缓慢添加上一步骤中制备的锌试剂。然后将反应混合物在60℃下搅拌过夜，冷却至室温，并在乙酸乙酯与饱和nh4cl溶液之间分配。分离各层，并将水层用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经mgso4干燥，并浓缩。将所得残余物经由快速色谱纯化以得到产物(0.11g，71％)。c
34h30
n7o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝568.2；实测值568.3。
[0911]
步骤6.3-(8-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲
腈
[0912][0913]
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(110mg，0.194mmol)与tfa(746μl，9.69mmol)的混合物在80℃下搅拌30min，冷却至室温并浓缩。将所得残余物经由制备型lcms(ph 2)纯化以得到呈白色固体状的产物(tfa盐)(57mg，90％)。c
18h14
n7的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝328.1；实测值328.1。
[0914]
步骤7.3-(8-氨基-5-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0915][0916]
向3-(8-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(tfa盐)(35mg，0.079mmol)在dmf(0.5ml)/dcm(0.5ml)中的溶液中添加nbs(14.1mg，0.079mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌1h，并浓缩以得到粗产物，其不经进一步纯化即用于下一步骤。c
18h13
brn7的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝406.0；实测值406.0。
[0917]
步骤8.3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0918]
将6-氯-2-甲基哒嗪-3(2h)-酮(30mg，0.21mmol)、双(频哪醇合)二硼(53mg，0.21mmol)、氯(2-二环己基膦基-2
′
,4
′
,6
′‑
三异丙基-1,1
′‑
联苯)[2-(2
′‑
氨基-1,1
′‑
联苯)]钯(ii)(15.7mg，0.02mmol)(xphos pd g2)和乙酸钾(61.7mg，0.63mmol)在1,4-二噁烷(1ml)中的混合物在100℃下搅拌1h。然后将3-(8-氨基-5-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(10mg，0.025mmol)、碳酸铯(37.6mg，0.116mmol)和水(0.2ml)添加至反应混合物中。在90℃下加热所得混合物1h。将混合物浓缩并通过制备型lcms(ph 2，乙腈/水，含tfa)纯化以得到呈tfa盐形式的期望产物。c
23h18
n9o的lcms计算值(m+h)
+
：436.2；实测值：436.2。
[0919]1h nmr(500mhz,dmso)δ8.66
–
8.62(d,j＝5.1hz,1h),8.09
–
8.02(d,j＝1.8hz,1h),7.88
–
7.85(t,j＝1.8hz,1h),7.85
–
7.81(m,3h),7.78
–
7.72(d,j＝9.6hz,1h),7.66
–
7.51(m,4h),7.10
–
7.06(d,j＝9.6hz,1h),4.59
–
4.48(s,2h),3.53
–
3.43(s,3h)。
[0920]
实施例a10：3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(化合物10)的合成
[0921][0922]
步骤1：3-溴-1-(2-(3-氰基苯基)-2-氧代乙基)-1h-1,2,4-三唑-5-羧酸甲酯
[0923][0924]
向3-溴-1h-1,2,4-三唑-5-羧酸甲酯(5.0g，24.3mmol)、3-(2-溴乙酰基)苯甲腈(5.44g，24.3mmol)在dmf(100ml)中的溶液中添加碳酸钾(3.35g，24.3mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物2h。然后用水和dcm稀释反应混合物。将有机层分离，用盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将所得残余物经由快速色谱纯化以得到呈白色固体状的期望产物(5.2g，61％)。c
13h10
brn4o3的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝349.0；实测值349.0。
[0925]
步骤2：3-(2-溴-8-氧代-7,8-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0926][0927]
将3-溴-1-(2-(3-氰基苯基)-2-氧代乙基)-1h-1,2,4-三唑-5-羧酸甲酯(10.5g，30.1mmol)溶解在乙酸(100ml)中，并添加乙酸铵(23.18g，301mmol)。在110℃下搅拌混合物12h。冷却至室温之后，将反应混合物用水稀释。将所得沉淀物经由过滤收集，用水洗涤，并在真空下干燥以得到产物(8.4g，88％)。c
12
h7brn5o的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝316.0；实测值316.0。
[0928]
步骤3：3-(2-溴-8-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0929][0930]
将3-(2-溴-8-氧代-7,8-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(8.4g，26.6mmol)与pocl3(49.5ml，531mmol)的混合物在110℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将反应混合物缓慢添加至含有冰和碳酸氢钠的烧瓶中。将所得沉淀物经由过滤收集，用水洗涤，并干燥以得到产物(8.8g，99％)。c
12
h6brcln5的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝336.0；实测值336.0。
[0931]
步骤4：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0932][0933]
将3-(2-溴-8-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(8.99g，26.9mmol)、双(4-甲氧基苄基)胺(10.37g，40.3mmol)和dipea(9.4ml，53.7mmol)在dmf(134ml)中的混合物在65℃下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，并用水稀释。将所得沉淀物经由过滤收集，并干燥以得到产物(14.1g，94％)。c
28h24
brn6o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝555.1；实测值555.1。
[0934]
步骤5：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0935][0936]
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(10.0g，18.0mmol)、4,4,5,5-四甲基-2-乙烯基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(3.88g，25.2mmol)、磷酸三钾(9.55g，45.0mmol)和氯(2-二环己基膦基-2
′
,4
′
,6
′‑
三异丙基-1,1
′‑
联苯)[2-(2
′‑
氨基-1,1
′‑
联苯)]钯(ii)(567mg，0.72mmol)在1,4-二噁烷(200ml)和水(50ml)中的混合物在85℃下搅拌2小时。将反应混合物冷却至室温，并去除大部分1,4-二噁烷。将所得沉淀物经由过滤收集，用水洗涤并干燥以得到粗产物(9.1g)，其直接用于下一步骤。c
30h27
n6o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝503.2；实测值503.1。
[0937]
步骤6.3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0938][0939]
在0℃下向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(717mg，1.43mmol)在10ml二氯甲烷中的溶液中添加1-溴吡咯烷-2,5-二酮
(254mg，1.43mmol)。将所得混合物搅拌4小时，并通过硅胶柱直接纯化以得到期望产物(780mg，94％)。c
30h26
brn6o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝581.1；实测值581.2。
[0940]
步骤7：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-(嘧啶-4-基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0941][0942]
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(260mg，0.45mmol)、4-(三丁基锡烷基)嘧啶(215mg，0.58mmol)、氯化锂(28.4mg，0.67mmol)、氯化铜(i)(67mg，0.67mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(52mg，0.045mmol)在thf(5ml)中的混合物在90℃下搅拌45分钟。将反应混合物用水淬灭并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层浓缩，并通过硅胶柱纯化以得到期望产物(176mg，67％)。c
34h29
n8o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝581.2；实测值581.1。
[0943]
步骤8：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-甲酰基-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0944][0945]
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-(嘧啶-4-基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(176mg，0.3mmol)、四氧化锇(viii)(3mg，在0.3ml水中，0.015mmol)和高碘酸钠(292mg，1.36mmol)在thf/水(1:1，6ml)中的混合物在65℃下搅拌1h。将反应混合物冷却至室温，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层浓缩，并通过硅胶柱纯化以得到期望产物(130mg，74％)。c
33h27
n8o3的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝583.2；实测值583.2。
[0946]
步骤9：3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0947]
格氏试剂(grignard reagent)的制备：在-10℃下向1,3-二氟-2-碘苯(142mg，0.6mmol)在四氢呋喃(1ml)中的溶液中添加异丙基氯化镁溶液(296μl，2m)。将所得混合物搅拌1h并且直接用于下一步骤。
[0948]
在-10℃下向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-甲酰基-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]
三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(120mg，0.2mmol)在thf(2ml)中的溶液中添加上一步骤中新鲜制备的格氏试剂。将反应混合物搅拌30min，用氯化铵溶液(4ml)淬灭，并用二氯甲烷萃取。在真空下浓缩合并的有机层。将所得物质溶解在tfa(5ml)中，并在80℃下搅拌20min。然后将反应混合物冷却至室温，浓缩，并通过添加nahco3水溶液来碱化。
[0949]
将粗物质通过硅胶柱直接纯化以得到呈外消旋混合物形式的期望产物(60mg，64％)。然后使用手性柱(phenomenex lux 5um cellulose-4,21.2x250mm)和含75％etoh的己烷(20ml/min)溶剂系统，通过手性hplc分离产物。
[0950]
分离峰2，并且经由制备型lc/ms(ph＝2，乙腈/水，含tfa)进一步纯化以得到呈tfa盐形式的期望产物。c
23h15
f2n8o的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝457.1；实测值457.0。
[0951]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ9.14(d,j＝1.3hz,1h),8.95(d,j＝5.2hz,1h),7.90(dd,j＝5.2,1.4hz,1h),7.88(s,1h),7.78(dt,j＝7.6,1.4hz,1h),7.74(t,j＝1.4hz,1h),7.54(dt,j＝7.9,1.3hz,1h),7.51
–
7.40(m,2h),7.09(t,j＝8.4hz,2h),6.27(s,1h)。
[0952]
实施例a11：3-(8-氨基-2-(氨基(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(化合物11)的合成
[0953][0954]
步骤1：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0955][0956]
向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(实施例a10，步骤5；241mg，0.48mmol)在dcm(5ml)中的溶液中添加nbs(84.6mg，0.48mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌1h，并浓缩以得到粗产物，其不经进一步纯化即用于下一步骤。c
30h26
brn6o2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝581.1；实测值581.1。
[0957]
步骤2：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-甲酰基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0958][0959]
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(174mg，0.3mmol)、四氧化锇(viii)(3mg，在0.3ml水中，0.015mmol)和高碘酸钠(292mg，1.36mmol)在thf/水(1:1，6ml)中的混合物在65℃下搅拌1h。反应混合物冷却至室温，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层浓缩，并通过硅胶柱纯化以得到期望产物。c
29h24
n6o3br的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝583.1；实测值583.1。
[0960]
步骤3：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0961][0962]
格氏试剂的制备：在-10℃下向1,3-二氟-2-碘苯(142mg，0.6mmol)在四氢呋喃(1ml)中的溶液中添加异丙基氯化镁溶液(296μl，2m)。将所得混合物搅拌1h并且直接用于下一步骤。
[0963]
在-10℃下向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-甲酰基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(120mg，0.2mmol)在thf(2ml)中的溶液中添加上一步骤中新鲜制备的格氏试剂。将反应混合物搅拌30min，用氯化铵溶液(4ml)淬灭，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层在真空下浓缩，并通过硅胶柱纯化以得到呈外消旋混合物形式的期望产物。c
35h28
n6o3brf2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝697.1；实测值697.1。
[0964]
步骤4：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0965][0966]
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(382mg，0.55mmol)、4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)噁唑(137mg，0.65mmol)、二环己基(2',4',6'-三异丙基联苯-2-基)膦-(2'-氨基联苯-2-基)(氯)钯(1:1)(17mg，21.6μmol)和cs2co3(356mg，1.09mmol)在1,4-二噁烷(2ml)和水(200μl)中的混合物用n2吹扫并在95℃下加热7h。浓缩混合物，并经由快速色谱纯化以得到呈无色油状的期望产物。c
39h32
n7o4f2的lcms计算值(m+h)
+
：700.2；实测
值：700.2。
[0967]
步骤5：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-(氯(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0968][0969]
在室温下向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(201mg，0.29mmol)在2ml二氯甲烷中的溶液中添加亚硫酰氯(105μl，1.435mmol)。将所得混合物搅拌4h，浓缩并且不经任何进一步纯化即用于下一步骤。c
39h31
n7o3clf2的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝718.2；实测值718.2。
[0970]
步骤6：3-(8-氨基-2-(氨基(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
[0971]
向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-(氯(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(40mg，0.084mmol)在1ml dmso中的溶液中添加氨溶液(1ml)。在100℃下以微波条件加热混合物10h，然后用水稀释并用etoac萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经mgso4干燥，并浓缩。将所得残余物溶解在tfa(1ml)中，并在80℃下搅拌20min。然后将反应混合物冷却至室温，浓缩并通过添加nahco3水溶液来碱化。将粗物质通过硅胶柱直接纯化以得到呈外消旋混合物形式的期望产物。然后使用手性柱(am-1)和含45％etoh的己烷(20ml/min)溶剂系统，通过手性hplc分离产物。分离峰1，并且经由制备型lc/ms(ph＝2，乙腈/水，含tfa)进一步纯化以得到呈tfa盐形式的期望产物。c
23h17
f2n8o的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝459.1；实测值459.0。
[0972]
实施例a12：3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(2,6-二甲基吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(化合物12)的合成
[0973][0974]
向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(实施例a11，步骤3；0.518g，0.638mmol)、2,6-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶(0.346g，1.48mmol)和二环己基(2',4',6'-三异丙基联苯-2-基)膦-(2'-氨基联苯-2-基)(氯)钯(1:1)(0.058g，0.074mmol)在二噁烷(3.0ml)和水(0.60ml)中的溶液中添加磷酸三钾(0.472g，2.23mmol)。将反应混合物在90℃下搅拌1h。然后将反应混合物用水和dcm稀释。分离各层，将水层用dcm
萃取，并将合并的有机级分经mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗物质溶解在tfa(5ml)中并加热至80℃持续20分钟。然后将反应混合物冷却至室温，浓缩并通过添加nahco3水溶液来碱化。将粗物质通过硅胶柱直接纯化以得到呈外消旋混合物形式的期望产物(257mg，72％)。
[0975]
然后使用手性柱(phenomenex lux 5um cellulose-2,21.1x250mm)和含35％etoh的己烷(20ml/min)溶剂系统，通过手性hplc分离产物。分离峰2，并且使用制备型lc/ms(ph＝2，乙腈/水，含tfa)进一步纯化以得到呈tfa盐形式的期望产物。c
26h20
f2n7o的lc-ms计算值(m+h)
+
：m/z＝484.2；实测值484.2。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ7.92(s,2h),7.85(s,1h),7.83(d,j＝7.6hz,1h),7.56(d,j＝8.0hz,1h),7.53
–
7.40(m,4h),7.10(t,j＝8.4hz,2h),6.27(s,1h),2.51(s,6h)。
[0976]
实施例a13：3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(化合物13)的合成
[0977][0978]
步骤1.4,6-二氯-3h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶
[0979][0980]
在0℃下将nano2(3.88g，56.2mmol)在水(3ml)中的溶液添加至2,6-二氯吡啶-3,4-二胺(10g，56mmol)在盐酸37％(5ml)的溶液中。搅拌溶液30min。添加水(20ml)并且将白色沉淀物过滤，用水洗涤，并干燥以得到期望产物。c5h3cl2n4的lc-ms计算值：189.0(m+h)
+
；实测值：189.0(m+h)
+
。
[0981]
步骤2.6-氯-n-(2,4-二甲氧基苄基)-3h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺
[0982][0983]
将4,6-二氯-3h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶(600mg，3.17mmol)、(2,4-二甲氧苯基)甲胺(0.53ml，3.49mmol)和三乙胺(0.53ml，3.81mmol)在1,4-二噁烷(10ml)中的混合物在110℃下搅拌3天。在硅胶柱上直接纯化以得到期望产物(875mg，86％)。c
14h15
cln5o2的lc-ms计算值：320.1(m+h)
+
；实测值：320.3(m+h)
+
。
[0984]
步骤3.6-氯-n-(2,4-二甲氧基苄基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺
[0985][0986]
将6-氯-n-(2,4-二甲氧基苄基)-3h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺(875mg，2.74mmol)、吡啶-2-基甲醇(0.317ml，3.28mmol)和三苯基膦(1436mg，5.47mmol)在dcm(20ml)中的混合物在0℃下添加至偶氮二羧酸二异丙酯(0.647ml，3.28mmol)中。将所得混合物在0℃下搅拌1h。在硅胶柱上直接纯化以得到期望产物(375mg，33.4％产率)。c
20h20
cln6o2的lc-ms计算值：411.1(m+h)
+
；实测值：411.2(m+h)
+
。
[0987]
步骤4.3-(4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
[0988][0989]
向6-氯-n-(2,4-二甲氧基苄基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺(375mg，0.913mmol)和(3-氰基苯基)硼酸(268mg，1.825mmol)在1,4-二噁烷(10ml)和水(1.00ml)中的混合物中添加碳酸铯(595mg，1.825mmol)。将所得混合物用n2吹扫，然后添加氯(2-二环己基膦基-2
′
,4
′
,6
′‑
三异丙基-1,1
′‑
联苯)[2-(2
′‑
氨基-1,1
′‑
联苯)]钯(ii)(71.8mg，0.091mmol)。在120℃下在微波辐射下搅拌反应混合物90min。将反应用20ml乙酸乙酯和20ml水淬灭。分离有机相，并将水溶液用乙酸乙酯萃取两次。将合并的萃取物经na2so4干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物在硅胶柱上纯化以得到期望产物(300mg，68.9％)。c
27h24
n7o2的lc-ms计算值：478.2(m+h)
+
；实测值：478.3(m+h)
+
。
[0990]
步骤5.3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
[0991]
[0992]
将3-(4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(300.3mg，0.629mmol)在tfa(5ml)中的溶液在100℃下搅拌30min。在减压下蒸发tfa，然后添加20ml饱和nahco3水溶液和20ml乙酸乙酯。分离有机相，并将水溶液用乙酸乙酯萃取两次。将合并的萃取物经na2so4干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物在硅胶柱上纯化以得到期望产物(175mg，85％)。c
18h14
n7的lc-ms计算值：328.1(m+h)
+
；实测值：328.2(m+h)
+
。
[0993]
步骤6.3-(4-氨基-7-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
[0994][0995]
将3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(175mg，0.535mmol)和1-溴吡咯烷-2,5-二酮(100mg，0.561mmol)在thf(10ml)中的混合物在0℃下搅拌30min，然后用饱和nahco3水溶液淬灭。将有机相分离，经na2so4干燥，过滤并在减压下蒸发。将所得残余物在硅胶柱上纯化以得到期望产物(135mg，62.2％)。c
18h13
brn7的lc-ms计算值：406.0(m+h)
+
和408.0(m+h)
+
；实测值：406.1(m+h)
+
和408.2(m+h)
+
。
[0996]
步骤7.3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
[0997][0998]
将3-(4-氨基-7-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(182mg，0.448mmol)、4-(三丁基锡烷基)嘧啶(496mg，1.344mmol)和氯化铜(i)(53.2mg，0.538mmol)、氯化锂(22.79mg，0.538mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(51.8mg，0.045mmol)在thf(1ml)中的混合物首先用n2吹扫，然后在90℃下加热并搅拌2h。将反应物用甲醇稀释，并用制备型lcms(ph＝2)纯化以得到期望产物。c
22h16
n9的lc-ms计算值：406.2(m+h)
+
；实测值：406.2(m+h)
+
。
[0999]
实施例a14：3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(化合物14)的合成
[1000]
[1001]
步骤1.6-氯-n-(2,4-二甲氧基苄基)-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺
[1002][1003]
在0℃下向6-氯-n-(2,4-二甲氧基苄基)-3h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺(实施例a13，步骤2；1000mg，3.13mmol)、(3-氟吡啶-2-基)甲醇(477mg，3.75mmol)和三苯基膦(1641mg，6.25mmol)在dcm(1.7ml)中的混合物中添加偶氮二羧酸二异丙酯(739μl，3.75mmol)。在0℃下搅拌反应混合物1h。在硅胶柱上直接纯化，得到期望产物(433mg，32％)。c
20h19
clfn6o2的lc-ms计算值：429.1(m+h)
+
；实测值：429.3(m+h)
+
。
[1004]
步骤2.3-(4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
[1005][1006]
将碳酸铯(658mg，2.019mmol)添加至6-氯-n-(2,4-二甲氧基苄基)-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺(433mg，1.010mmol)和(3-氰基苯基)硼酸(297mg，2.019mmol)在1,4-二噁烷(10.0ml)和水(1.0ml)中的混合物中。将所得混合物用n2鼓泡2min并添加(sp-4-4)-[2'-氨基[1,1'-联苯]-2-基]氯[二环己基[2',4',6'-三(1-甲基乙基)[1,1'-联苯]-2-基]膦]钯(79mg，0.101mmol)。在微波辐射下，在120℃下搅拌反应混合物1.5h。将反应用20ml乙酸乙酯和20ml水淬灭。分离有机相，并将水溶液用乙酸乙酯萃取两次。将合并的萃取物经na2so4干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物在硅胶柱上纯化以得到期望产物(357mg，71％)。c
27h23
fn7o2的lc-ms计算值：496.2(m+h)
+
；实测值：496.3(m+h)
+
。
[1007]
步骤3.3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
[1008][1009]
将3-(4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(357.3mg，0.721mmol)在tfa(5ml)中的溶液在100℃下搅拌1h。在减压下蒸发tfa，然后添加20ml饱和nahco3水溶液和20ml乙酸乙酯。分离有机相，并将水溶液用乙酸乙酯萃取两次。将合并的萃取物经na2so4干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物在硅胶柱上纯化以得到期望产物(213mg，61％)。c
18h13
fn7的lc-ms m/z计算值：346.1(m+h)
+
；实测值：346.3(m+h)
+
。
[1010]
步骤4.3-(4-氨基-7-溴-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
[1011][1012]
将3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(213mg，0.617mmol)和1-溴吡咯烷-2,5-二酮(220mg，1.234mmol)在thf(5ml)中的混合物在0℃下搅拌1h。在硅胶上直接纯化，得到期望产物(175mg，67％)。c
18h12
brfn7的lc-ms计算值：424.0(m+h)
+
和426.0(m+h)
+
；实测值：424.3(m+h)
+
和426.3(m+h)
+
。
[1013]
步骤5.3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
[1014][1015]
将3-(4-氨基-7-溴-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(220mg，0.519mmol)、4-(三丁基锡烷基)嘧啶(383mg，1.037mmol)和氯化铜(i)(61.6mg，0.622mmol)、氯化锂(26.4mg，0.622mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(59.9mg，0.052mmol)在thf(1ml)中的混合物首先用n2吹扫，然后在90℃下加热并搅拌2h。将反应用甲醇稀释，并用制备型lcms(ph＝2)纯化以得到期望产物。c
22h15
fn9的lc-ms计算值：424.1(m+h)
+
；实测值：424.3(m+h)
+
。1h nmr(500mhz,)ppm 8.98(s,1h),8.77(d,j＝5.02hz,1h),8.38(dd,j1＝4.60hz,j2＝1.32hz,1h),7.90-8.30(bs,2h),7.76-7.89(m,3h),7.66(dd,j1＝5.25hz,j2＝1.25hz,1h),7.45-7.58(m,3h),6.25(s,2h)。
[1016]
实施例a15：3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(吡啶-4-基)-2h-[1,2,3]
三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(化合物15)的合成
[1017][1018]
将碳酸铯(46.1mg，0.141mmol)添加至3-(4-氨基-7-溴-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(30mg，0.071mmol)和吡啶-4-基硼酸(17.38mg，0.141mmol)在1,4-二噁烷(2ml)和水(0.2ml)中的混合物中。将所得混合物用n2鼓泡2min并添加氯(2-二环己基膦基-2
′
,4
′
,6
′‑
三异丙基-1,1
′‑
联苯)[2-(2
′‑
氨基-1,1
′‑
联苯)]钯(ii)(5.56mg，7.07μmol)。在微波辐射下，在120℃下搅拌反应混合物1.5h。将反应混合物用甲醇稀释。在制备型hplc上直接纯化，得到期望产物。c
23h16
fn8的lc-ms计算值：423.1(m+h)
+
；实测值：423.3(m+h)
+
。
[1019]
实施例a16：3-(4-氨基-7-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈(化合物16)的合成
[1020][1021]
步骤1.3-(4-氨基-7-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈
[1022][1023]
按照与实施例a13步骤1至步骤6类似的程序，在步骤4中用(3-氰基-2-氟苯基)硼酸替换(3-氰基苯基)硼酸来制备此化合物。c
18h12
brfn7的lc-ms计算值：424.0(m+h)
+
和426.0(m+h)
+
；实测值：424.3(m+h)
+
和426.3(m+h)
+
。
[1024]
步骤2.3-(4-氨基-7-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈
[1025]
[1026]
按照与实施例a15类似的程序，用(1-甲基-1h-吡唑-5-基)硼酸替换吡啶-4-基硼酸并用3-(4-氨基-7-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈替换3-(4-氨基-7-溴-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2h-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈来制备此化合物。c
22h17
fn9的lc-ms计算值：426.2(m+h)
+
；实测值：426.3(m+h)
+
。
[1027]
实施例a17：7-(1-((5-氯吡啶-3-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(化合物17)的合成
[1028][1029]
步骤1：3-(戊基氨基)-1h-吡咯-2-羧酸乙酯
[1030][1031]
将3-氨基-1h-吡咯-2-羧酸乙酯(5g，32.4mmol)、戊醛(3.79ml，35.7mmol)和氰基硼氢化钠(2.038g，32.4mmol)在室温下在甲醇(64.9ml)中混合过夜。在减压下浓缩反应混合物。将粗残余物通过快速色谱(含0至100％etoac的己烷)纯化以得到期望产物(4.4g，61％)。c
12h21
n2o2的lc-ms计算值(m+h)：225.2。实测值：225.1。
[1032]
步骤2：3-(3-(乙氧基羰基)-1-戊基硫脲基)-1h-吡咯-2-羧酸乙酯
[1033][1034]
向小瓶中装入3-(戊基氨基)-1h-吡咯-2-羧酸乙酯(4.4g，19.62mmol)、二氯甲烷(39.2ml)和异硫氰酸乙氧羰酯(2.78ml，23.54mmol)。在室温下将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物用水(40ml)淬灭，并且分离各层。用二氯甲烷(3x 40ml)萃取水层，并且将合并的有机级分经mgso4干燥，过滤并浓缩。粗物质不经进一步纯化即用于下一步骤(7.3g，定量)。c
16h26
n3o4s的lcms计算值(m+h)：356.2。实测值：356.1。
[1035]
步骤3：1-戊基-2-硫酮基-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5h)-酮
[1036][1037]
向微波小瓶中装入3-(3-(乙氧基羰基)-1-戊基硫脲基)-1h-吡咯-2-羧酸乙酯(7.31g，20.57mmol)和乙氧化钠(21％w/w，8.45ml，22.62mmol)溶液。为小瓶加盖，并在微波反应器中在120摄氏度下加热10分钟。通过添加1m hcl溶液使反应混合物达到中性ph，并且将固体产物过滤并干燥(3.1g，64％)。c
11h16
n3os的lcms计算值(m+h)：238.1。实测值：238.1。
[1038]
步骤4：2-亚肼基-1-戊基-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5h)-酮
[1039][1040]
向小瓶中装入1-戊基-2-硫酮基-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5h)-酮(3.13g，13.19mmol)和水合肼(20ml)。在100摄氏度下搅拌反应混合物过夜。将所形成的固体过滤并用水洗涤以得到期望产物(2.2g，70％)。c
11h18
n5o的lcms计算值(m+h)：236.1。实测值：236.1。
[1041]
步骤5：3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
[1042][1043]
向小瓶中装入(e)-2-亚肼基-1-戊基-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5h)-酮(4.8g，20.40mmol)、一滴三氟乙酸和原乙酸三乙酯(20ml)。将反应混合物加热至110摄氏度，持续三小时。将悬浮液过滤，用己烷洗涤并干燥(4.0g，76％)。c
13h18
n5o的lcms计算值(m+h)：260.1。实测值：260.2。
[1044]
步骤6：3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
[1045][1046]
向小瓶中装入3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(来自步骤1)(4g，15.43mmol)、二氯甲烷(40ml)、二甲基氨基吡啶(0.188g，1.543mmol)、三乙胺(3.23ml，23.14mmol)和苯磺酰氯(2.187ml，16.97mmol)。将反应混合物在室温下搅拌一小时。将反应混合物用水淬灭，并且分离各层。用二氯甲烷(3x 40ml)萃取水层，并且将合并的有机级分经mgso4干燥，过滤并浓缩。粗物质不经进一步纯化即用于下一步骤(6.1g，定量)。c
19h22
n5o3s的lcms计算值(m+h)：400.1。实测值：400.1。
[1047]
步骤7：7-溴-3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
[1048][1049]
向小瓶中装入3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(1g，2.503mmol)、干燥thf(30ml)，并将混合物冷却至-78摄氏度。逐滴添加二异丙基氨基锂溶液(1m，在己烷/thf中，3.13ml，3.13mmol)。将反应混合物在-78℃下保持1.5小时。将1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷(1.223g，3.75mmol)在干燥thf(3ml)中的溶液逐滴添加至反应混合物中并将反应混合物在-78℃下保持1.5小时。将反应混合物用饱和nh4cl水溶液(30ml)淬灭并用二氯甲烷(30ml)稀释。分离各层，并用dcm(3x 30ml)萃取水层。将合并的有机级分经mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗残余物通过自动快速色谱(含0至100％etoac的dcm)纯化以得到期望产物(0.84g，70％)。c
19h21
brn5o3s的lcms计算值(m+h)：478.1。实测值：478.1。
[1050]
步骤8：3-氯-5-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1h-吡唑-1-基)甲基)吡啶
[1051][1052]
向小瓶中装入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1h-吡唑(0.5g，2.58mmol)、3-(溴甲基)-5-氯吡啶氢溴酸盐(0.741g，2.58mmol)、碳酸铯(2.52g，7.73mmol)和dmf(6.44ml)。将反应混合物在60摄氏度下搅拌一小时。将反应混合物用水(10ml)淬灭并用二氯甲烷(10ml)稀释。分离各层，并用二氯甲烷(3x 10ml)萃取水层。将合并的二氯甲烷萃取物经mgso4干燥，过滤并浓缩。通过自动快速色谱(含0至100％etoac的
dcm)纯化，得到产物(0.548g，67％)。c
15h20
bcln3o2的lcms计算值(m+h)：320.1，322.1。实测值：320.1，322.1。
[1053]
步骤9：7-(1-((5-氯吡啶-3-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
[1054]
向小瓶中装入7-溴-3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(0.01g，0.021mmol)、3-氯-5-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1h-吡唑-1-基)甲基)吡啶(0.013g，0.042mmol)、氯(2-二环己基膦基-2
′
,4
′
,6
′‑
三异丙基-1,1
′‑
联苯)[2-(2
′‑
氨基-1,1
′‑
联苯)]钯(ii)(5.00mg，0.006mmol)和磷酸三钾(0.016g，0.074mmol)。添加1,4-二噁烷(0.35ml)和水(0.07ml)并将反应混合物用氮气鼓泡5分钟，然后在90℃下搅拌两小时。将反应混合物冷却至室温，并添加氢氧化钠(10mg)。在40摄氏度下将反应混合物搅拌60分钟。将反应混合物冷却至室温，并用dmf(5ml)稀释。通过制备型hplc(ph 2，乙腈/水，含tfa)纯化，得到呈tfa盐形式的产物(2mg，21％)。c
22h24
cln8o的lcms计算值(m+h)：451.2，453.2。实测值：451.2，453.2。
[1055]
实施例a18：3-甲基-7-(1-((5-甲基吡啶-3-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(化合物18)的合成
[1056][1057]
使用如实施例a17所描述的类似程序，在步骤8中使用3-(溴甲基)-5-甲基吡啶代替3-(溴甲基)-5-氯吡啶氢溴酸盐来制备此化合物。c
23h27
n8o的lcms计算值(m+h)：431.2。实测值：431.3。
[1058]
实施例a19：3-甲基-9-戊基-7-(1-(噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基甲基)-1h-吡唑-4-基)-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(化合物19)的合成
[1059][1060]
使用如实施例a17所描述的类似程序，在步骤8中使用6-(溴甲基)噻吩并[3,2-b]吡啶代替3-(溴甲基)-5-氯吡啶氢溴酸盐来制备此化合物。c
24h25
n8os的lcms计算值(m+h)：473.2。实测值：473.3。
[1061]
实施例a20：7-(1-((2-(2-(二甲基氨基)乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(化合物20)
[1062][1063]
步骤1：6-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-羧酸叔丁酯
[1064][1065]
向烧瓶中装入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1h-吡唑(.5g，2.58mmol)、6-(羟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-羧酸叔丁酯(0.339g，1.288mmol)、三苯基膦(0.743g，2.83mmol)和thf(12ml)。将溶液冷却至0℃并逐滴添加diad(0.601ml，3.09mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤，干燥并浓缩。将产物通过柱色谱用己烷/etoac(最大etoac 60％)洗脱来纯化以得到产物。c
24h35
bn3o4的lcms计算值(m+h)
+
：m/z＝440.3；实测值440.3。
[1066]
步骤2：7-溴-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
[1067][1068]
将tbaf(1.0m，在thf中)(2.0ml，2.0mmol)添加至7-溴-3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(0.360g，0.753mmol)在thf(4.0ml)中的溶液中，然后在50℃下搅拌反应1h。去除溶剂并将产物通过柱色谱用ch2cl2/meoh(最大meoh 10％)洗脱来纯化。c
13h17
brn5o的lcms计算值(m+h)
+
：m/z＝338.1；实测值338.1。
[1069]
步骤3：6-((4-(3-甲基-5-氧代-9-戊基-6,9-二氢-5h-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-7-基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-羧酸叔丁酯
基)-1h-四唑-1-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物21b)
[1078][1079]
使用如实施例a3所描述的类似程序，用5-(1h-吡唑-1-基)-1h-四唑替换2-(1h-四唑-5-基)吡啶来制备标题化合物的混合物。通过制备型lc-ms(ph 2，乙腈/水，含tfa)纯化化合物21a以得到呈tfa盐形式的产物。c
21h15n14
的lcms计算值(m+h)
+
：463.2；实测值：463.2。
[1080]
实施例1：抗人cd73单克隆抗体的产生
[1081]
为了产生抗人cd73单克隆抗体，用包含c末端his标签的重组人cd73(seq id no:70)蛋白对小鼠进行免疫，并从小鼠脾和淋巴结中分离b细胞。使用10x genomics vh/vl配对的b细胞测序确定b细胞的抗体序列。鼠vh/vl对被表达为具有huigg1 fc(seq id no:73和74)的嵌合体并测试了结合和功能性。通过此方法产生命名为cl25的抗体。上表1示出了根据imgt、chothia、abm、kabat和contact编号的cl25 cdr以及成熟vh、vl、重链和轻链的氨基酸序列。
[1082]
将嵌合抗体cl25(包含seq id no:26的鼠vh和seq id no:27的鼠vl)人源化以使抗体框架的免疫原性最小化，同时保持特异性活性。通过将vh和vl序列与人vh和vk基因的数据库进行比对来进行人源化。将来自鼠cl25抗体的cdr(表1)嫁接至若干顶级人vh和vk基因中。示例性人源化cl25抗体的vh和vl序列描绘于图1a-图1c中。cl25的vh和vl与示例性人源化cl25抗体的比对分别描绘于图1d和图1e中。还对鼠cl25中存在的若干种框架突变以及鼠cdr进行了测试(图1a-图1e)。选择具有seq id no:22的vh和seq id no:23的vl的cl25的人源化型式，在本文中称为“hzcl25”，用于进一步研究。上表2示出了根据imgt、chothia、abm、kabat和contact编号的hzcl25 cdr以及成熟vh、vl、重链和轻链的氨基酸序列。
[1083]
实施例2：抗人cd73单克隆抗体与细胞表面cd73的结合
[1084]
为了测试人源化和非人源化cl25克隆与细胞表面cd73的结合，洗涤mda-mb-231或a375细胞，并以5x104个细胞/孔添加至96孔板中。在冰上用指示浓度的抗体将细胞染色30分钟(图2a和图2b)。接下来，洗涤细胞，并在冰上使用缀合至藻红蛋白(pe)的山羊抗小鼠二级抗体染色30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术进行分析。绘制cd73染色的几何平均荧光强度(gmfi)(图2a和图2b)。cl25和hzcl25均展示出与具有高水平表面cd73(mda-mb-231细胞)和中等水平表面cd73(如在a375细胞中测试)的细胞的高效力结合。
[1085]
实施例3：抗人cd73单克隆抗体介导的细胞cd73抑制
[1086]
为了测量抗cd73抗体抑制细胞上cd73活性的能力，将a375和mda-mb-231细胞用无血清rpmi培养基(thermofisher)洗涤，并且针对a375以8x104个细胞/孔的浓度或针对mda-mb-231以1x104个细胞/孔的浓度铺种于96孔板中。将细胞与指示浓度的抗体或apcp在37℃5％co2下孵育30分钟(图3a、图3b和图3c)。接下来，添加一磷酸腺苷(amp)至最终浓度为100
μm，并将细胞在37℃5％co2下再孵育3小时。将板以300g离心1-2分钟，并将25μl上清液转移至新的96孔板中。根据制造商说明书(promega)使用amp-glo测定。在此测定中，相对发光单位(rlu)与amp浓度直接相关。结果描绘于图3a、图3b和图3c中。
[1087]
在两种测试的细胞类型中，cl25和hzcl25均具有良好的抑制细胞cd73的效力(图3a、图3b和图3c)。hzcl25具有与cl25类似的抑制细胞cd73的能力(图3a、图3b和图3c)。
[1088]
实施例4：抗人cd73单克隆抗体介导的可溶性cd73抑制
[1089]
为了测量cd73抗体抑制重组蛋白的cd73活性的能力，将重组人cd73(rhucd73)(seq id no:70)以0.008μg/ml的最终浓度与指示浓度的抗体(图4)或5
’‑
[α,β-亚甲基]二磷酸腺苷(apcp)一起添加至96孔板中，并在37℃5％co2下孵育30分钟。孵育30分钟后，添加amp至最终浓度为100μm，并将反应在37℃5％co2下孵育3小时。将25μl上清液转移至新的96孔板中。根据制造商说明书使用amp-glo测定。在此测定中，rlu与amp浓度直接相关。结果描绘于图4中。cl25和hzcl25均显示出高效力和无钩状效应(图4)。hzcl25具有与cl25类似的抑制细胞cd73的能力(图4)。
[1090]
实施例5：结合亲和力
[1091]
cd73的酶促活性要求底物以开放构象结合。底物结合后，cd73必须经历从开放构象至封闭构象的大构象变化，以将amp转化为腺苷。抑制或调节这种构象变化的抗体结合将潜在地降低amp向腺苷转化的速率。
[1092]
为了评估hzcl25的结合亲和力，使用biacore 8k仪器(ge healthcare)在25℃下进行表面等离子共振(spr)。由10x hbs-ep缓冲液(ge healthcare)制备spr运行缓冲液(10mm hepes、150mm nacl、3mm edta和0.05％v/v表面活性剂p20，ph 7.4)。经由胺偶联将抗人fc抗体(ge healthcare)固定在s系列传感器芯片cm5(ge healthcare)的所有十六个流通池上。所有流通池的固定水平为～9000ru。通过使适当浓度的抗cd73抗体流经每个通道的活性流通池来实现抗cd73抗体的所期望的捕获水平。存在zn
2+
的不可裂解adp类似物apcp(5
’‑
(α,β-亚甲基)二磷酸腺苷)可用于使cd73构象平衡从开放变为封闭。因此，将重组cd73与spr运行缓冲液在100μm apcp和10μm zncl2(封闭spr运行缓冲液)存在下孵育，以研究抗cd73抗体与cd73在封闭构象下的结合。为此，使用了biacore 8k中的aba注入特征。对于开放构象，aba注入顺序从运行缓冲液注入60秒开始。然后，立即注入由cd73原液(bps bioscience)制备的cd73 3倍系列稀释浓度系列和运行缓冲液180秒，随后注入运行缓冲液240秒。对于封闭构象，正常spr运行缓冲液被封闭spr运行缓冲液替换。通过30秒注入3m mgcl2使表面再生。结合动力学和亲和力参数是从数据对1:1结合模型的全局拟合获得的。与处于开放或封闭构象的人、食蟹猴和小鼠cd73的结合亲和力和动力学缔合和解离速率常数示于下表8中。表8中的结果确保食蟹猴的药代动力学数据将反映人药代动力学数据。
[1093]
表8：指示抗体(ab)与处于开放或封闭构象的人(seq id no:70)、食蟹猴(seq id no:72)和小鼠(seq id no:71)cd73的结合亲和力和动力学缔合和解离速率常数。
[1094][1095][1096]
实施例6：表位作图
[1097]
为了对cl25的表位作图，进行氢-氘交换质谱(hdx)。将cd73单独或与cl25 fab复合在氧化氘中孵育。氘交换在20℃下进行0秒、60秒、600秒或3600秒。交换反应通过低ph淬
灭，并将蛋白质用胃蛋白酶/蛋白酶viii消化。由lc-ms上的质量偏移监测已鉴定的肽的氘水平。绘制所有肽在交换时间内的氘积累曲线与时间的关系。将与fab结合后氘摄取显著降低的肽指定为每种抗体的表位。将通过hdx-ms针对cl25确定的表位作图至人cd73的晶体结构(4h2f.pdb)上(图5)，并且是tkvqqirraepnvl(seq id no:76)(即seq id no:70的氨基酸40-53)。
[1098]
实施例7：cd73细胞表面水平
[1099]
为了测量抗体处理后细胞表面上cd73的量，将mda-mb-231细胞重悬于培养基(10％fbs rpmi-1640)中，并以1x105个细胞/孔铺种于96孔板中。以10μg/ml的最终浓度添加指示抗体，并将板在37℃5％co2下孵育24小时。使用versene回收细胞，并转移至新的96孔板中。洗涤细胞，并在冰上用10μg/ml直接缀合至dy650的非竞争性抗体染色30分钟。洗涤细胞并通过流式细胞术进行分析。cd73细胞表面受体密度使用quantum simply cellular珠子通过抗体结合能力(abc)测定。用cl25处理细胞24小时降低了细胞表面cd73的水平(图6)。
[1100]
实施例8：抗人cd73单克隆抗体3-f03的产生
[1101]
为了产生另外的抗人cd73单克隆抗体，对单个供体文库进行多轮选择。使用200nm生物素化的人cd73(seq id no:70)在三轮淘选中富集了大约1.5e12噬菌体颗粒的文库。然后将来自这个池的scfv盒重组为酵母展示载体，并创建大约5.4e7的文库。通过facs，使用100nm生物素化的鼠cd73(seq id no:71)将此文库选择三轮。通过酵母菌落的sanger测序，从最终的分选输出中获得独特序列。从这个池中鉴定酵母3-f03 scfv序列，并且其含有seq id no:77中列出的氨基酸序列的vh和seq id no:65中列出的氨基酸序列的vl。
[1102]
为了构建全长人3-f03抗体，在将酵母3-f03 scfv序列进行修饰之后，将其克隆至包含seq id no:75中列出的人igg1恒定区和seq id no:74中列出的人κ轻链恒定区的人igg1支架中。对于vh，去除seq id no:77的n末端谷氨酸(e)，并用丙氨酸(a)取代seq id no:77的kabat位置h77(即seq id no:77的位置78)处的苏氨酸(t)。对于vl，去除seq id no:65的n末端丙氨酸(a)。所得全长人3-f03抗体含有分别在seq id no:60和61的氨基酸序列中列出的vh和vl。所得全长人3-f03抗体含有分别在seq id no:66和31的氨基酸序列中列出的重链和轻链。这种抗体在本文中称为“3-f03”。上表3示出了根据imgt、chothia、abm、kabat和contact编号的3-f03 cdr以及成熟vh、vl、重链和轻链的氨基酸序列。
[1103]
实施例9：3-f03与细胞表面cd73的结合
[1104]
如上文实施例2中所述进行3-f03与细胞表面cd73的结合。3-f03展示出与具有高水平的表面cd73(mda-mb-231)和中等水平的cd73(a375细胞)的细胞的高效力结合(图7a和图7b)。
[1105]
实施例10：3-f03介导的细胞cd73抑制
[1106]
如上文实施例3中所描述评价3-f03抑制细胞上cd73活性的能力。结果描绘于图8a和图8b中。
[1107]
与cd73小分子抑制剂apcp相比，克隆3-f03在两种测试的细胞类型中均显示出对细胞cd73的最大抑制(图8a和图8b)。
[1108]
实施例11：3-f03介导的可溶性cd73抑制
[1109]
如上文实施例4中所描述评价3-f03抑制重组蛋白的cd73活性的能力，不同之处在
于，使用0.025ug/ml的rhucd73。结果描绘于图9中。抗体3-f03具有良好的效力(图9)。抗体3-f03未表现出任何钩状效应。
[1110]
实施例12：抗cd73抗体的结合亲和力
[1111]
如以上实施例5中所描述评价3-f03的结合亲和力。与处于开放或封闭构象的人、食蟹猴和小鼠cd73的结合亲和力和动力学缔合和解离速率常数示于下表9中。
[1112]
表9：与处于开放或封闭构象的人、食蟹猴和小鼠cd73的结合亲和力和动力学缔合和解离速率常数。
[1113][1114]
实施例13：3-f03的表位作图
[1115]
如上文实施例6中所描述对3-f03的表位作图。将通过hdx-ms针对3-f03确定的表位作图至人cd73的晶体结构(4h2f.pdb)上(图10)，并且是aavlpfggtfdlvq(seq id no:78)(即seq id no:70的氨基酸386-399)和ilpnflanggdgfqmikdel(seq id no:79)(即seq id no:70的氨基酸470-489)。
[1116]
实施例14：3-f03对cd73细胞表面水平的作用
[1117]
如上文实施例7中所描述，评价用3-f03处理后细胞表面上cd73的量。与同种型对照抗体或未经处理的细胞相比，3-f03显著降低细胞表面上可检测cd73的水平(图11)。
[1118]
实施例15：3-f03变体
[1119]
3-f03轻链(lc，seq id no:66)和重链(hc，seq id no:31)的序列用于构建同源性模型。图12a-图12j提供了示例性3-f03变体的vh和vl的氨基酸序列。包含这些vh和vl序列的抗体含有seq id no:73中列出的重链恒定区和seq id no:74中列出的轻链恒定区。表10提供了示例性3-f03变体的结合亲和力和动力学。通过biacore确定，所测试的任何突变均不会显著影响与cd73的结合。所有测试的突变的亲和力均在3-f03抗体的十倍内，大部分在3-f03的两倍内。
[1120]
表10：3-f03变体的biacore结合亲和力和动力学。-＝不存在
[1121]
[1122][1123]
为了测试工程化3-f03变体与细胞表面cd73的结合，将mda-mb-231细胞洗涤并以5x104个细胞/孔添加至96孔板中。在冰上用指示浓度的抗体将细胞染色1小时。然后洗涤细胞，并在冰上用缀合至pe的山羊抗小鼠二级抗体染色30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术进行分析。绘制cd73染色的gmfi(图13)。除3-f03_417显示出略高的ymax外，3-f03变体中的每一个都具有类似的结合概况(图13)。这些数据证实了biacore研究(表10)：对于这些变体克隆，这些突变并未显著改变人cd73结合。
[1124]
为了测试3-f03变体抑制细胞上cd73活性的能力，用无血清rpmi培养基洗涤mda-mb-231细胞，并以1x104个细胞/孔铺种于96孔板中。将细胞与指示浓度的抗体或apcp在37℃5％co2下孵育30分钟。接下来，添加amp至100μm的最终浓度，并将细胞在37℃5％co2下孵育另外的3小时。将板以300g离心1-2分钟，并将25μl上清液转移至新的96孔板中。根据制造商说明书使用amp-glo测定。在此测定中，rlu与amp浓度直接相关。在3-f03变体中，3-f03显示出最大抑制(图14)。与3-f03相比，变体3-f03_417、3-f03_411和3-f03_413展示出略低的效力(图14)。变体3-f03_412不抑制mda-mb-231细胞上的膜结合cd73(图14)。
[1125]
实施例16：抗cd73抗体与a2a抑制剂协同作用
[1126]
为了测量抗cd73抗体和a2a抑制剂逆转amp介导的t细胞增殖抑制的能力，使用人cd4
+
t细胞分离试剂盒(miltenyi biotec)从外周血单核细胞(pbmc)中纯化原代人cd4
+
t细胞。根据制造商方案，用1μm羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)(bd biosciences)标记分离的cd4
+
t细胞。将cfse标记的细胞重悬于含有10％胎牛血清的rpmi中。将大约50,000个细胞/孔加入圆底96孔板中。将dynabeads人t激活剂cd3/cd28珠子以珠子:细胞比1:1添加至细胞悬浮液中，并在37℃下孵育1小时。在存在或不存在0.5μm的a2a抑制剂(化合物9)的情况下，将抗cd73抗体(hzcl25、抗体a或抗体b)的系列稀释液添加至指定孔中，并在37℃下孵育30分钟；将a2a抑制剂的系列稀释液添加至指定孔中作为对照(图16a-图16c和图18a-图18c)。或者，在存在或不存在1μg/ml抗cd73抗体(hzcl25)的情况下，将a2a抑制剂(化合物9、化合物a或化合物b)的系列稀释液添加至指定孔中，并在37℃下孵育30分钟；将cd73抗体的系列稀释液添加至指定孔中作为对照(图17a-图17c)。最后以600μm的最终浓度添加amp，并将整个培养物在孵育箱中于37℃下孵育4天。4天后，测量ifnγ产生(图16a-图16c和图17a-图17c)，并使用lsrfortessa x-20分析仪(bd biosciences)，通过基于cfse的流式细胞术分析测定cd4+t细胞增殖(图18a-图18c)。
[1127]
抗体a重链(vh加斜体)：
[1128][1129]
抗体a轻链(vl加斜体)：
[1130][1131]
抗体b重链(vh加斜体)：
[1132][1133][1134]
抗体b轻链(vl加斜体)：
[1135][1136]
化合物a：
[1137][1138]
(3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2h-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈)。
[1139]
化合物b：
[1140][1141]
(7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-[[6-[[(3s)-氧杂环戊烷-3-基]氧基甲基]吡啶-2-基]甲基]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺)
[1142]
当与抗cd73抗体组合时，a2a抑制剂显著增加ifnγ产生(图16a-图16c和图17a-图17c)。
[1143]
当与抗cd73抗体组合时，a2a/a2b抑制剂在多个不同人供体中以浓度依赖性方式逆转amp介导的cd4+t细胞增殖的抑制(图18a-图18c)。
[1144]
实施例17：抗cd73抗体与a2a抑制剂的体内组合减小肿瘤体积
[1145]
测试抗cd73抗体与a2a抑制剂组合的体内功效。将抗cd73抗体hzcl25或3-f03_413悬浮于1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)(life technologies)中，用于hu-cd34 nsg小鼠(jackson laboratories)的腹膜内给药。1x pbs和悬浮于1x pbs中的fc失能的人igg1包括在这项研究中作为对照。具有人源化免疫系统的小鼠购自jackson labs(bar harbor,maine)。简单地说，3周龄的雌性nsg/nod scid小鼠接受单剂量的对免疫细胞前体有毒的辐射，然后通过注射人脐带血、cd34
+
选定的细胞来“拯救”。小鼠包含三个不同的人免疫供体的受者，以更好地代表免疫反应的个体差异。
[1146]
在接种悬浮于基质胶(corning life sciences,tewksbury,mass)中的人乳腺癌细胞系mda-mb-231(atcc,manassas virginia)的5x106个细胞前一天，将小鼠的左侧腹剃毛。在第7天，通过游标卡尺测量肿瘤尺寸，并通过公式体积＝[l(长尺寸)x w2(短尺寸)]/2估算体积。将小鼠随机分为4组，每组5只或6只具有近似肿瘤平均体积(～200mm3)和供体代表性的小鼠。在研究期间每5天测量一次肿瘤。
[1147]
从第8天起，每五天对小鼠腹膜内给药(i)10mg/kg的人igg1和10mg/kg媒介物；(ii)10mg/kg的hzcl25；或(iii)10mg/kg的3-f03_413。对于治疗组(ii)和(iii)，每天两次(bid)向小鼠给药化合物9。总共给予8个剂量的抗体(即从第8天开始至最后一天，抗体在第8、13、18、23、29、34、39和44天给药，并且化合物9每天给药两次，间隔为8和16小时)。
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施用抗cd73抗体与a2a抑制剂组合的小鼠表现出统计学上显著减慢的肿瘤生长(图19a和图19b)。
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其他实施方案
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虽然本发明已经结合其具体实施方式进行描述，但是前述具体实施方式意图说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附加权利要求书的范围来限定。其他方面、优点
和修改在以下权利要求的范围内。