PPDPF在制备防治非酒精性脂肪肝病及肝癌的药物中的应用

ppdpf在制备防治非酒精性脂肪肝病及肝癌的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术和药物学领域，更具体地，本发明涉及ppdpf作为药学靶点在制备防治非酒精性脂肪肝病及肝癌的药物中的应用。


背景技术：

2.肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是目前全球第六大肿瘤，以及第四大致死肿瘤，全球超过一半的肝癌发生在中国。非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，nafld)已成为肝癌的一大诱因。
3.在过去的数年中，nafld是西方国家慢性肝病最常见的病因，并且成为原发性肝癌的风险因素。据资料分析，从非酒精性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，nash)和cirrhosis人群患肝癌的风险，由7年中的2.4％，发展为3年中的12.8％。美国seer
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medicare数据库显示代谢因素(肥胖、糖尿病、代谢综合征)相关的肝癌(32％)已经超过了hcv感染(20.5％)所致的肝癌，揭示了nafld对肝癌发病率的影响。在一项meta分析研究中，younossi等报道在nafld患者中，肝癌的年发生率为0.44/1000患者/年，而对nash而言，肝癌的年发生率为5.29/1000患者/年。nafld的全球患病率为25.24％，这意味着非酒精性脂肪肝病相关肝癌(nonalcoholic fatty liver disease
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related hepatocellular carcinoma，nafld
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related hcc)是一个相当大的健康负担。
4.在过去的几十年中，生活方式和饮食习惯的改变促进了肥胖及nafld在中国的流行。目前，nafld在中国的增长速度非常惊人。nafld的发生率从2000
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2006年间的18.2％，2007
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2009年间的20.0％发展为2010
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2013年间的20.9％，而慢性hbv感染患者中脂肪肝的发生率从2002年的8.2％发展为2011年的31.8％。
5.综上所述，nafld和nafld
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related hcc的比例不断升高，已成为中国社会面临的重大健康问题，但是目前尚未有有效的药物干预方式。因此，揭示nafld和nafld
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related hcc发生发展的机制，发现潜在的治疗靶点，是当务之急。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种防治非酒精性脂肪肝病及肝癌的新型靶点，即ppdpf；本发明的目的还在于提供其应用。
7.在本发明的第一方面，提供一种胰腺祖细胞分化与增殖因子(ppdpf)或其上调剂在制备药物或组合物中的应用，所述药物或组合物具有选自下组的一种或多种功能：(1)防治肝脏脂质过度合成相关疾病；(2)降低肝脏脂肪合成，降低肝脏脂肪量，降低肝脂肪变性；(3)抑制脂质合成基因的表达；(4)抑制mtor激活，抑制转录因子srebp1的表达及活化。
8.在一种优选方式中，所述ppdpf的上调剂包括选自下组：(a)增强ppdpf活性的物质；(b)增强ppdpf的表达、稳定性或有效作用时间的物质。
9.在另一优选方式中，所述ppdpf的上调剂包括选自：重组表达ppdpf的表达构建物(包括表达载体)，增强ppdpf对mtor信号通路抑制作用的多肽或化合物，ppdpf的化学上调
剂，促进ppdpf基因启动子驱动能力的上调剂，ppdpf基因特异性microrna的下调剂，ppdpf基因特异性lncrna(long non
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coding rna)的调节剂或其组合。
10.在另一优选方式中，所述的ppdpf选自下组：(a)氨基酸序列如seq id no:1所示的多肽；(b)将(a)所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1～20个，1
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10个，1
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5个，1
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3个或1
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2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有(a)或(b)多肽功能的ppdpf衍生物，或其活性片段；(c)序列与seq id no:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％(如同源性≥92％，≥94％，≥96％，≥98％或≥99％)的ppdpf衍生物，或其活性片段。
11.在另一优选方式中，所述的表达构建物(表达载体)包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体。
12.在另一优选方式中，所述肝脏脂质过度合成相关疾病包括选自下组的疾病：脂肪肝，肝炎，肝癌，高胆固醇血症，高甘油三酯血症，动脉粥样硬化症，高血脂症，肥胖症。
13.在另一优选方式中，所述的脂肪肝为非酒精性脂肪肝病；较佳地所述非酒精性脂肪肝病包括：脂肪肝，肝硬化，非酒精性脂肪性肝炎；或，所述的肝癌更佳地为非酒精性脂肪肝病相关的肝癌。
14.在另一优选方式中，激活mtor信号通路的外界信号增强raptor的泛素化，ppdpf通过干扰raptor与ddb1的相互作用而抑制raptor的泛素化，从而抑制raptor与mtor的相互作用，抑制激活mtor信号通路的外界信号对mtor信号通路的激活；较佳地，所述激活mtor信号通路的外界信号包括脂质信号。
15.在另一优选方式中，所述的脂质合成基因包括选自下组的基因：srebp1，fasn，acly，me，pparg。
16.在本发明的另一方面，提供ppdpf的应用，用于筛选药物或化合物(即作为筛药靶点)，所述药物或化合物具有选自下组的一种或多种功能：(1)防治肝脏脂质合成增加相关疾病；(2)降低肝脏脂肪合成，降低肝脏脂肪量，降低肝脂肪变性；(3)抑制脂质合成基因的表达；(4)抑制mtor激活，抑制转录因子srebp1的表达及活化。
17.在本发明的另一方面，提供一种筛选防治肝脏脂质过度合成相关疾病、降低肝脏脂肪合成、降低肝脏脂肪量、降低肝脂肪变性和/或抑制脂质合成基因的表达的药物或化合物(或潜在的药物或化合物)的方法，包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达ppdpf；和，(2)检测所述体系中ppdpf的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高ppdpf的表达或活性，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。
18.在一个优选方式中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或，步骤(2)包括：检测所述体系中ppdpf的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上提高(如提高20％以上，较佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)ppdpf的表达或活性，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。
19.在另一优选方式中，所述体系中，步骤(1)所述的体系中，还包括mtor信号通路；以及，步骤(2)还包括：检测所述体系中ppdpf与所述mtor信号通路的相互作用情况，若ppdpf抑制(如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)所述mtor信号通路的激活，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。
20.在另一优选方式中，所述体系中，步骤(1)所述的体系中，还包括转录因子srebp1；
以及，步骤(2)还包括：检测所述体系中转录因子srebp1的表达或活性，srebp1的表达或活性被抑制(如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。
21.在另一优选方式中，所述体系中，步骤(1)所述的体系中，还包括：raptor与ddb1；以及，步骤(2)还包括：检测所述体系中胰腺祖细胞分化与增殖因子与所述raptor、ddb1及mtor的相互作用；若ppdpf干扰raptor与ddb1的相互作用能力增强(如增强20％以上，较佳的增强50％以上；更佳的增强80％以上)、raptor的泛素化被抑制(如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)、raptor与mtor的相互作用被抑制(如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。
22.在另一优选方式中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系(或亚细胞培养物体系)、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
23.在另一优选方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对ppdpf、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的过表达分子如构建体，活性促进分子，化学小分子，相互作用分子等。
24.在另一优选方式中，所述方法还包括：对获得的药物或化合物(潜在药物或化合物)进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于防治肝脏脂质过度合成相关疾病等有用的组合物。
25.在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增ppdpf的试剂的用途，用于制备诊断或预后肝脏脂质过度合成相关疾病的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述肝脏脂质过度合成相关疾病包括脂肪肝或肝癌。
26.在一种优选方式中，若所述ppdpf低表达(即：表达低于该物种群体的平均值或常规值)，表明受试者罹患肝脏脂质过度合成相关疾病，或肝脏脂质过度合成相关疾病的易感性高；若所述ppdpf正常表达或高表达(即：表达等于、相当于或高于该物种群体的平均值或常规值)，表明受试者肝脏脂质过度合成相关疾病的易感性低。
27.在另一优选方式中，所述的诊断试剂包括：特异性结合ppdpf的结合分子；特异性扩增ppdpf基因的引物；特异性识别ppdpf基因的探针；或特异性识别ppdpf基因的芯片。
28.在本发明的另一方面，提供一种降低离体细胞中的脂肪量的方法，包括步骤：以ppdpf或其上调剂处理细胞，或在细胞中重组表达ppdpf或其上调剂。
29.在一种优选方式中，所述的降低离体细胞中的脂肪量的方法为非治疗性的方法。
30.在另一优选方式中，所述的细胞包括：肝细胞，肝癌细胞。
31.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
32.图1、肝脏特异性敲除ppdpf自发形成脂肪肝。
33.(a)正常饮食饲养8个月小鼠，体重统计结果。(b)小鼠解剖肝脏示意图。(c)肝重与体重比值统计。(d)肝脏h&e和oil red o染色结果。(e，f)小鼠肝脏组织甘油三酯(8)和游离脂肪酸(nefa)的检测结果统计。flox为对照组，cko为实验组，*p<0.05，**p<0.01，***p<
0.001。
34.图2、肝脏脂代谢相关基因的检测。
35.(a)qpcr检测ppdpf在肝脏中的敲除效果。(b)脂质合成基因在ppdpf ko小鼠中显著上调。(c
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e)脂肪酸氧化，脂肪酸摄取和分泌相关基因在对照组和实验组小鼠中均没有差异。
36.图3、肝脏特异性缺失ppdpf促进了高脂诱导的肝脏脂肪变性。
37.(a)ppdpf
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flox小鼠和ppdpf
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cko小鼠高脂喂养16周(16w)体重的改变。(b)正常饮食(nc)和高脂喂养(hfd)16周肝脏重量的变化。(c，d)肝脏tg和nefa的检测。(e)ppdpf
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flox组和ppdpf
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cko组小鼠h&e和oil red o染色结果。(f)脂质合成相关基因的检测。
38.图4、肝脏特异性敲除ppdpf增强了小鼠糖耐受和胰岛素耐受能力。
39.左图为葡萄糖耐受实验(gtt)，右图为胰岛素耐受实验(itt)。
40.图5、肝脏特异性过表达ppdpf抑制了高脂诱导的肝脏脂肪变性。
41.(a)aav8
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con小鼠和aav8
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ppdpf小鼠高脂喂养12周体重的改变。(b)正常饮食和高脂喂养12周肝脏重量的变化。(c，d)肝脏tg和nefa的检测。(e)aav8
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con组和aav8
‑
ppdpf组小鼠h&e和oil red o染色结果。(f)脂质合成相关基因的检测。
42.图6、肝脏特异性过表达ppdpf抑制了小鼠糖耐受和胰岛素耐受能力。
43.左图为葡萄糖耐受实验(gtt)，右图为胰岛素耐受实验(itt)。
44.图7、ppdpf ko促进了nafld
‑
related hcc的发展。
45.(a)den诱导肝癌模型中7个月对照组和ppdpf肝脏特异性ko组小鼠的肝脏图片；(b)den诱导肝癌模型中7个月对照组和ppdpf肝脏特异性ko组小鼠的体重散点图；(c)对照组和ppdpf肝脏特异性ko组小鼠肝脏肿瘤大小的散点图，对照组仅有3只肝脏生有较大的肿瘤；(d)对照组和ppdpf肝脏特异性ko组小鼠肝脏肿瘤的数量统计；(e)对照组和ppdpf肝脏特异性ko组小鼠血液中alt数值的散点图；(f)对照组和ppdpf肝脏特异性ko组小鼠在den诱导肝癌模型中的生存曲线图；(g)对照组和ppdpf肝脏特异性ko组小鼠肝脏(ppdpf肝脏特异性ko组主要是肿瘤组织)的h&e和油红染色代表性图片。
46.图8、ppdpf敲除促进了pa诱导的肝原代细胞脂肪变性。
47.(a)rt
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pcr检测ppdpf敲除效果。(b)肝原代细胞中tg检测在pa处理24h后。(c)pa处理后肝原代细胞油红染色。(d)脂质合成相关基因的检测。
48.图9、ppdpf过表达抑制了pa诱导的hepg2细胞脂肪变性。
49.(a)western blotting检测ppdpf过表达效果。(b)hepg2细胞中tg检测在pa处理24h后。(c)pa处理后hepg2细胞尼罗红染色。(d)脂质合成相关基因的检测。
50.图10、ppdpf抑制了小鼠肝脏中mtor信号通路的激活。
51.(a
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c)通过western blot检测在正常饮食8个月小鼠以及高脂诱导的ppdpf
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flox，ppdpf
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cko，aav8
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con及aav8
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ppdpf小鼠肝脏组织中s6k的磷酸化水平，以及srebp1和fasn的表达。
52.图11、ppdpf在体外抑制了pa诱导的mtor信号通路的激活。
53.(a)western blot检测在pa处理的ppdpf
‑
flox，ppdpf
‑
cko肝脏原代细胞中s6k的磷酸化水平，以及srebp1和fasn的表达。(b)western blot检测在pa处理的对照细胞和过表达ppdpf的hepg2细胞中s6k的磷酸化水平，以及srebp1和fasn的表达。
54.图12、pa刺激情况下，torin1处理小鼠原代细胞。
55.(a)torin1处理后小鼠原代细胞的油红染色。(b)torin1处理后小鼠原代细胞tg检测。(c)脂质合成相关基因表达检测。
56.图13、ppdpf回补抑制了ppdpf
‑
cko小鼠自发脂肪肝的形成。
57.(a
‑
b)小鼠体重，肝重的统计结果。(c
‑
d)小鼠肝脏组织中tg，nefa的检测。(e)小鼠肝脏组织h&e和油红染色结果。(f)rt
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pcr检测小鼠肝脏组织中脂质合成相关基因的表达。
58.图14、ppdpf的回补抑制了ppdpf
‑
cko小鼠肝脏中mtor信号通路的活化。
59.western blot检测小鼠肝脏组织中s6k的磷酸化及srebp1，fasn的表达水平。
60.图15、ppdpf回补抑制了ppdpf
‑
cko小鼠中高脂诱导的脂肪肝的形成。
61.(a
‑
b)小鼠体重，肝重的统计结果。(c
‑
d)小鼠肝脏组织中tg，nefa的检测。(e)小鼠肝脏组织h&e和油红染色结果。(f)rt
‑
pcr检测小鼠肝脏组织中脂质合成相关基因的表达。
62.图16、通过免疫组化检测了ppdpf在健康人的正常肝脏组织和nafld患者的发生了脂肪变性的肝脏组织中的表达。
63.图17、ppdpf和raptor相互作用并抑制raptor的泛素化。(a和b)在293t细胞中共转flag
‑
raptor和ha
‑
ppdpf，通过免疫共沉淀实验检测它们的相互作用；(c和d)通过免疫共沉淀检测了内源ppdpf和raptor的相互作用；(e)ppdpf和raptor的体外相互作用，gst作为阴性对照；(f)通过gst pulldown assay检测了不同的ppdpf截短突变体和raptor的相互作用；(g和h)293t细胞中转入flag
‑
ppdpf wt,flag
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ppdpf mut和ha
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raptor，48小时候，通过免疫共沉淀实验检测了相互作用；(i)通过gst pull down assay检测了gst
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ppdpf，gst
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ppdpf mut和raptor的相互作用；(j)293t细胞中转入myc
‑
ppdpf wt,myc
‑
ppdpf mut和flag
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raptor，48小时后，通过免疫共沉淀实验检测了相互作用，并检测了raptor的泛素化。
64.图18、ppdpf和ppdpf mut对raptor泛素化和mtor信号通路的影响。(a)在hepg2细胞中检测了raptor的泛素化；(b)在pa处理下，在hepg2细胞中检测了raptor泛素化的动态变化；(c)在对照和ppdpf lko的肝原代细胞中检测了raptor的泛素化；(d)检测了pa处理后的hepg2细胞中各分子的水平。
65.图19、aav8介导的将ppdpf和ppdpf mut引入到ppdpf
‑
lko小鼠中。(a和b)每组小鼠的体重(a)和肝重(b)，每组5只；(c)脂质生成相关基因的mrna水平；(d和e)高脂喂食3个月后每组的的体重(d)和肝重(e)，每组5只；(f)高脂喂食3个月后脂质合成相关基因的mrna水平。
66.图20、aav8介导的将ppdpf和ppdpf mut引入到ppdpf
‑
lko小鼠中(另一部分数据)。(a和b)8个月正常饮食小鼠每组的肝脏甘油三酯(a)和游离脂肪酸(b)含量，每组5只；(c)注射了不同aav的正常饮食8个月小鼠的肝脏h&e和油红染色的代表性图片；(d)各个分子的表达情况；(e和f)高脂喂食小鼠各组的肝脏甘油三酯(e)和游离脂肪酸(f)含量；(g)高脂喂食小鼠各组的肝脏h&e和油红染色的肝脏代表性图片；(h)高脂喂食小鼠各组的标注分子表达情况。
67.图21、鉴定raptor的e3连接酶。(a)293t细胞中3xflag
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ppdpf免疫沉淀的银染图；(b)ddb1
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cul4b e3连接酶复合物示意图；(c)ppdpf对raptor
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ddb1和raptor
‑
mtor的相互作用的影响是剂量依赖性的。
68.图22、ppdpf破坏了raptor和ddb1的相互作用。(a和b)在293t细胞中共转了flag
‑
ddb1和ha
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ppdpf，通过免疫共沉淀检测了ppdpf和ddb1的相互作用；(c)通过gst pulldown assay检测了ppdpf和ddb1的相互作用；(d)ppdpf能抑制ddb1介导的raptor泛素化的增加；(e和f)在293t和hepg2细胞中ppdpf抑制了raptor
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ddb1和raptor
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mtor相互作用；(g)在对照和ppdpf过表达的hepg2细胞中，检测了pa处理下raptor和ddb1以及mtor的相互作用；(h)pa处理下对照和ppdpf
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lko肝原代细胞中raptor
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ddb1和raptor
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mtor相互作用；(i)在ppdpf lko小鼠中通过aav8重新引入ppdpf抑制了raptor
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ddb1和raptor
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mtor的相互作用。
69.图23、ppdpf mut不能影响raptor
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ddb1和raptor
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mtor相互作用。在293t(a)和hepg2(b)细胞中，分别转入flag
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ppdpf和flag
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ppdpf mut，检测了raptor和mtor、ddb1、ppdpf和ppdpf mut之间的相互作用。
具体实施方式
70.本发明人经过深入研究，首次揭示一种胰腺祖细胞分化与增殖因子(ppdpf)在防治肝脏脂质过度合成相关疾病的组合物或药物中的应用。ppdpf其本身或其上调剂能够用于抑制肝脏脂质过度合成；也可基于ppdpf的上述功能，筛选抑制肝脏脂质过度合成的物质。
71.ppdpf
72.ppdpf位于人类20号染色体上，其编码的蛋白质约为12kd，目前关于该基因的功能研究较少，其在哺乳动物中的功能还不清楚。人源ppdpf的氨基酸序列可以如seq id no:1所示或如gene id:79144；np_077275.1所示；鼠源ppdpf的氨基酸序列可以如seq id no:1所示或如gene id:66496；np_079874.1所示。本发明还包括来自其它物种的ppdpf同源物及其应用。
73.本发明所述ppdpf可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的ppdpf也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组ppdpf，以应用于实验或临床。在应用时，可采用重组的ppdpf。所述的ppdpf包括全长的ppdpf或其生物活性片段。优选的，所述的ppdpf的氨基酸序列可以与seq id no:1所示的序列基本上相同。根据ppdpf的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。
74.经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的ppdpf的氨基酸序列也包括在本发明中。ppdpf或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见watson等，molecular biology of the gene，第四版，1987，the benjamin/cummings pub.co.p224。
75.任何一种ppdpf的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，ppdpf的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的ppdpf的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长ppdpf的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长ppdpf的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
76.本发明也可采用经修饰或改良的ppdpf，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的ppdpf。所述经过修饰或改良的ppdpf可以是一
种ppdpf的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的ppdpf可以是与天然存在的ppdpf具有较小的共同点，但也能防治肝脏脂质过度合成相关疾病，降低肝脏脂肪合成，降低肝脏脂肪量，降低肝脂肪变性，抑制脂质合成基因的表达，抑制mtor激活，抑制转录因子srebp1的表达及活化，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响ppdpf的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
77.ppdpf及其上调剂的应用
78.在本发明人的研究工作中，构建了肝脏特异性敲除ppdpf基因的动物模型(ppdpf cko)，在正常饲养8个月后，动物模型自发形成脂肪肝。在高脂(hfd)诱导的脂肪肝动物模型中，肝脏特异性敲除ppdpf的动物脂肪肝更加严重。通过尾静脉注射腺相关病毒(adenovirus associated virus，aav)，在肝脏中过表达ppdpf，显著抑制了脂肪肝的形成。在肝原代细胞中，ppdpf敲除显著促进了脂滴的聚集。而过表达ppdpf的肝癌细胞系脂滴累积被显著抑制。此外，在二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，den)诱导的肝癌模型中，肝脏特异性ppdpf ko动物模型在den诱导后，生成的肝脏肿瘤数量和大小都显著高于对照组动物，并具有nafld
‑
related hcc的特征。ppdpf ko动物的生存时间远短于对照。在ppdpf
‑
cko动物中回补表达ppdpf后，动物体重和肝重出现了明显的回复；在高脂诱导的脂肪肝的动物模型中，回补ppdpf抑制了高脂诱导的脂肪肝的形成。因此，ppdfp与肝脏脂质代谢密切相关。
79.在机制研究方面，本发明人通过real
‑
time pcr检测，发现在ppdpf ko动物的肝脏组织及细胞中，与脂质合成相关的基因显著上调。进一步研究揭示ppdpf ko激活了mtor信号通路以及下游的脂代谢重要调控分子srebp1，进而促进了与脂质形成相关基因的表达，造成肝脏中脂质积累，促进了nafld及相关肝癌的发生发展。因此，本发明人发现ppdpf通过调控mtor及下游脂代谢通路的激活，从而影响非酒精性脂肪肝病和肝癌的发生发展，提示ppdpf为非酒精性脂肪肝病和肝癌的治疗或诊断靶点。
80.在本发明的具体实施例中，论证了以下方面：(a)肝脏特异性敲除ppdpf自发形成非酒精性脂肪肝；(b)脂质合成增加导致脂肪肝的形成；(c)ppdpf在肝脏中特异性敲除加速了高脂饮食诱导的脂肪肝；(d)ppdpf在肝脏中特异性过表达抑制了高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性；(e)肝脏特异性ppdpf ko促进了肝癌的发生发展；(f)缺失ppdpf促进了肝原代细胞的的脂质合成；(g)过表达ppdpf抑制hepg2细胞脂质合成能力；(h)ppdpf对脂质合成的调控依赖于mtor信号通路的活化。
81.基于本发明人的新发现，本发明提供了ppdpf或其上调剂的应用，用于制备(1)防治肝脏脂质过度合成相关疾病，(2)降低肝脏脂肪合成，降低肝脏脂肪量，降低肝脂肪变性，(3)抑制脂质合成基因的表达，(4)抑制mtor激活，抑制转录因子srebp1的表达及活化的组合物或药物；或用于筛选抑制上述疾病或症状的物质。
82.如本文所用，所述的ppdpf的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高ppdpf的活性、维持ppdpf的稳定性、促进ppdpf的表达、促进ppdpf的分泌、延长ppdpf有效作用时间、或促进ppdpf的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为具有上调功能的有效物质。
83.作为本发明的优选方式，所述的ppdpf的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)ppdpf的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码ppdpf的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相
连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性dna序列的某些部分能够调节或控制同一线性dna序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
84.本发明中，ppdpf多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，从而可将之转入到细胞中，过表达产生ppdpf。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。例如，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括(但不限于)：腺相关病毒，慢病毒载体，腺病毒载体等。
85.本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ppdpf的dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。
86.本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001
‑
20wt％；较佳的0.00001
‑
10wt％)的所述的ppdpf、或其上调剂(如过表达该ppdpf的表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。
87.本发明的组合物可直接用于防治肝脏脂质过度合成相关疾病，降低肝脏脂肪合成，降低肝脏脂肪量，降低肝脂肪变性，抑制脂质合成基因的表达，抑制mtor激活，抑制转录因子srebp1的表达及活化。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。
88.通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5
‑
8，较佳地，ph约为6
‑
8。
89.如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
90.如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
91.本发明的组合物含有安全有效量的ppdpf、或其上调剂(如过表达该ppdpf的表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
92.本发明所述的ppdpf或其上调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的ppdpf或其上调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的ppdpf或其上调剂每天以约0.00001mg
‑
10mg/kg动物体重1的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
93.本发明还提供了一种防治肝脏脂质过度合成相关疾病，降低肝脏脂肪合成，降低
肝脏脂肪量，降低肝脂肪变性，抑制脂质合成基因的表达，抑制mtor激活，抑制转录因子srebp1的表达及活化的方法，包括给予受试者有效量的ppdpf、或其上调剂(如过表达该ppdpf的表达载体)、或其类似物。
94.本发明的ppdpf或其上调剂、或其类似物的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。例如，本发明的ppdpf或其上调剂可通过腹腔注射、静脉注射、口服、皮下注射、脊髓鞘内注射、皮内注射等的方式给予动物。
95.在得知了所述的ppdpf的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的ppdpf或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可直接将ppdpf通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带ppdpf基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的ppdpf。
96.作为本发明的一种实施方式，可将所述的ppdpf直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码ppdpf的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述ppdpf的细胞中，使所述的细胞表达ppdpf。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现ppdpf的表达。
97.ppdpf的上调剂或类似物的给药方式主要取决于所述上调剂的类型和特性，这是本领域人员可以评估的。
98.ppdpf作为药物筛选靶点
99.在得知了所述的ppdpf的功能和作用机制后，可以基于该特征来筛选促进ppdpf的表达或活性的物质。
100.因此，本发明提供一种筛选可用于抑制肝癌的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达ppdpf的体系接触；和检测候选物质对ppdpf的影响；若所述候选物质可提高ppdpf的表达或活性或分泌，则表明该候选物质是可用于防治肝脏脂质过度合成相关疾病、降低肝脏脂肪合成、降低肝脏脂肪量、降低肝脂肪变性、抑制脂质合成基因的表达、抑制mtor激活、抑制转录因子srebp1的表达或活化的潜在物质。
101.脂质信号增强raptor的泛素化，ppdpf通过干扰raptor与ddb1的相互作用而抑制raptor的泛素化，从而抑制raptor与mtor的相互作用，抑制脂质信号对mtor信号通路的激活。基于这一新发现，在本发明的优选方式中，所述的体系中还包括：raptor与ddb1；并且还包括：检测所述体系中胰腺祖细胞分化与增殖因子与所述raptor、ddb1及mtor的相互作用；若ppdpf干扰raptor与ddb1的相互作用能力增强、raptor的泛素化被抑制、raptor与mtor的相互作用被抑制，则表明该候选物质是所需的药物或化合物。
102.在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到ppdpf及其所参与的信号通路蛋白或其上下游蛋白的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达ppdpf、mtor、raptor和/或ddb1的体系。
103.所述的表达体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达ppdpf、srebp1、mtor、raptor和/或ddb1的细胞；或可以是重组表达ppdpf、srebp1、mtor、raptor和/或ddb1的细胞。所述的表达ppdpf、srebp1、mtor、raptor和/或ddb1的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)
等。
104.作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肝脏脂质过度合成等真正有用的物质。
105.本发明对于ppdpf的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：sds
‑
page法，western
‑
blot法，elisa等。
106.另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的化合物、组合物或药物，或一些潜在物质。一些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制肝脏脂质过度合成等真正有用的物质，从而用于临床。
107.ppdpf作为诊断靶点
108.基于本发明人的上述新发现，可以将ppdpf作为诊断肝脏脂质过度合成相关疾病(如脂肪肝或肝癌)的标志物：(i)进行肝脏脂质过度合成相关疾病的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的肝脏脂质过度合成相关疾病治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群肝脏脂质过度合成相关疾病患病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由ppdpf基因表达异常而导致肝脏脂质过度合成相关疾病的人群，从而可进行更有针对性地治疗。
109.因此，本发明提供了ppdpf的用途，用于制备诊断(或检测)肝脏脂质过度合成相关疾病的试剂或试剂盒。
110.可采用各种本领域已知的技术来检测ppdpf基因的存在与否、表达情况、表达水平或活性，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如southern印迹法、western印迹法、dna序列分析、pcr等，这些方法可结合使用。
111.本发明还提供了用于在分析物中检测ppdpf基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增ppdpf的引物；或特异性识别ppdpf的探针来确定ppdpf基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合ppdpf编码的蛋白的抗体或配体来确定ppdpf蛋白的表达情况。作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出ppdpf基因或基因片段。针对ppdpf基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与ppdpf基因上特定位点发生特异性结合，而不与ppdpf基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。此外，利用特异性结合ppdpf蛋白的抗体来检测分析物中ppdpf蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。
112.本发明还提供了用于在分析物中检测ppdpf基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增ppdpf基因的引物；特异性识别ppdpf基因的探针；或特异性结合ppdpf蛋白的抗体或配体。
113.所述的试剂盒中还可包括用于提取dna、pcr、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
114.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
115.材料和方法
116.1、肝脏ppdpf特异性敲除小鼠的构建
117.ppdpf
flox/flox
构建包括：通过同源重组的方法在exon1～5的两侧引入同向的loxp位点(以frt
‑
neo
‑
frt
‑
loxp cassette引入第二个loxp)。将此小鼠与albumin
‑
cre(购自jackson laboratory)杂交，可得到同时带有ppdpf
‑
flox基因和cre基因的后代，cre重组酶的表达会导致ppdpf的exon1
‑
5被删除，即得到了肝脏ppdpf特异性敲除的小鼠。
118.2、高脂诱导小鼠脂肪肝模型
119.将小鼠分为两组，每组都包括对照组和ppdpf
‑
ko组，所有小鼠年龄大小相差不到1周，从小鼠出生一直正常饲养到8周大，此时，一组正常饮食，另一组进行60％高脂饲料(hfd)(购自research diets)饲养，分别设置8周、12周、16周的时间点进行饲养，每一个时间点都要采集体重、血糖等信息以及进行相关的动物实验。所有动物实验都严格遵循中国科学院上海营养与健康研究所动物实验管理规定。
120.3、二乙基亚硝胺(den)诱导的肝癌模型
121.出生14天的雄鼠，通过腹腔注射den(40mg/kg)，诱导肝癌。den注射后7
‑
10月间一般会有肝癌生成。
122.4、小鼠肝脏原代细胞的分离与培养
123.准备工作：手术器械(剪刀，镊子，动脉夹)进行高温灭菌；37℃水浴锅清洗干净；70um细胞筛，配制好的dmem；灌流用buffer1和消化用buffer2现用现配；安装灌流泵并清洗消毒。
124.小鼠灌流及消化：首先麻醉小鼠约3
‑
5分钟，待完全麻醉后，解剖小鼠，剪开其腹部皮肤(尽量不要使鼠毛残留在腹腔上)，将腹腔打开，将小鼠腹腔内的肠子等拨到右边暴露其下腔静脉，然后将肝脏向上翻开，暴露肝门静脉(其中，肝门静脉与下腔静脉成45
°
，上部连着肝脏，右下部在胰腺及胃等处)。第二，小鼠扎针及bufer 1灌流，将灌流针插入到下腔静脉内部，确定插好后，用动脉夹夹住将其固定，尽量拨开旁边的结缔组织，此时先打开灌流开关，然后马上剪断肝门静脉，如果血液迅速流出，并且肝脏逐渐发白，说明插针正确。灌流流速开始维持在25，然后稳定后调到30。此时灌流的液体是放在37℃的水浴锅，灌流约3
‑
5min后肝脏几乎完全变白，换用含collagenase type i的bufer 2灌流，流速设置为16
‑
18，待40ml液体全部灌流完全，关闭灌流开关(大概20min)。
125.收集细胞：灌流完成后，将肝脏剪下放入冰的bufer 2(不含胶原酶)的平皿中(细胞房操作)。然后在超净台中将肝脏放在10cm皿中，加入少量的冰的dmem培养基，用剪刀将肝脏剪碎，反复吹吸均匀，将其通过70μm的滤膜过滤到50ml离心管中，随后，再用冰培养基反复吹吸几次位于滤膜上的剪碎的肝组织。过滤后的细胞4℃离心800rpm离心3min。离心后倒掉上清，用5mldmem吹散，吸到梯度离心液(4.32mlpercoll，0.68ml 10xpbs)中，混匀，800rpm离心10min。离心后弃上层，在加入5ml左右的dmem洗一下，700rpm，2min(洗掉percoll)。倒掉上清，适量的dmem重悬，计数铺板。一般6～8小时贴壁，贴壁后即可用来做实验，若细胞很脏可换液。
126.5、油红(oil red o)染色
127.组织油红染色：冰冻包埋的肝脏组织进行切片(8
‑
10um)。切好的片子首先在预冷的pbs中来回摆动(为了去掉oct)，然后用预冷的10％的多聚甲醛固定10min，随后放入85％异丙醇中3min，取出放进提前60℃加热好的油红，染色10min。在放入85％异丙醇中1min，接着放进苏木精染核1min，自来水冲洗2min。最后将片子在ddh2o中清洗，吸水纸擦拭，70％甘油封片，正置显微镜拍照。
128.细胞油红染色：首先将要染色的细胞以一定数量铺在圆形载玻片上，先将载玻片放在24孔板中，然后再加细胞，细胞密度不宜过密。24孔板放于37℃培养箱继续培养48小时，之后加入pa处理细胞，并设置对照组。染色时先将培养及倒掉，预冷的pbs洗两次后倒尽。加入预冷4％的多聚甲醛固定细胞15分钟，倒掉多聚甲醛后用85％异丙醇浸润细胞1分钟，倒掉之后加入60℃加热的油红染色15分钟。倒掉油红，85％异丙醇短暂清洗，加入苏木精染细胞核1分钟，之后用自来水冲洗掉苏木精，ddh2o清洗，封片，尽快用显微镜拍照。细胞的油红染色步骤基本类似，只不过由于细胞是铺在很小的载玻片上，所以每一步都要更加小心。
129.6、石蜡包埋
130.取合适大小的肝脏组织放入4％甲醛中4℃固定过夜，第二天换到75％乙醇中4℃浸泡过夜。之后将组织依次放进80％乙醇中1小时，95％乙醇中45分钟，连续浸泡2遍，无水乙醇中25min两次，接着在正丁醇中浸泡2h，将烘箱调至65℃，将蜡熔化，中间一小时的时候换一次新的正丁醇，这些均在常温进行。随后将组织转移到烘箱中熔化的石蜡中浸蜡2h，中间也要换一次新的。最后，用石蜡包埋机将组织包成合适的蜡块。待冷却后即可用切片机切片，一般厚度为5um，切片要贴附在多聚赖氨酸包被的载玻片上。
131.7、h&e染色
132.将要染色的片子放进65℃烘箱熔蜡，大约50min后转移至二甲苯中脱蜡10分钟，此后的步骤都应在通风橱中进行，二甲苯脱蜡进行两次，第二次5分钟。接下来是水化，无水乙醇中浸泡2次，每次5分钟；接着95乙醇浸泡2次，每次5分钟；随后在75％乙醇中分别浸泡3分钟和2分钟，蒸馏水中洗1分钟，在水平摇床上进行。下面是染色步骤，蒸馏水清洗后直接放入苏木精中染细胞核10分钟，10分钟后依次在自来水(2秒)，1％盐酸乙醇(3秒)中脱去浮色，放入染色缸，自来水冲洗返蓝，此时水流不宜过大，一般返蓝15分钟即可。返蓝后用蒸馏水清洗2分钟，放入伊红染液中染色30秒，随即放入80％乙醇中脱水，再经95％乙醇，100％乙醇，二甲苯脱水，每次5分钟，每种溶液进行两遍。最后，70％中性树胶和30％二甲苯配成的封片剂封片。
133.8、尼罗红(nile red)染色
134.细胞铺板：24孔板，每孔加500uldmem培养基和细胞圆形爬片，避免出现气泡，细胞消化后计数，每孔加5x10^3个细胞，摇匀，放进培养箱。第二天早上加入200mm的棕榈酸处理12小时，之后进行染色。
135.染色过程：24孔板倒掉培养基，pbs洗3次，将培养基洗干净，真空泵吸尽pbs。预冷的4％多聚甲醛固定15min，随后倒掉甲醛，pbs洗涤3次，每次5分钟，在摇床上进行。尼罗红按照1：2000稀释在pbs中，每孔加入300ul，37℃培养箱中染色30分钟，之后按照前面步骤pbs洗三次，常温下，1：2000稀释好的hoechast染核3分钟，除去之后再用pbs洗三次，每次5分钟，最后用封片剂封片，避光4℃保存。
136.9、mrna提取与real
‑
time pcr
137.mrna提取:将适量组织在液氮中研成粉末或者细胞用pbs洗净培养基，加入1ml trizol，用rnaase free的枪头吹打均匀，放于冰上裂解15min。随后加入200ul三氯甲烷，翻转混匀，室温静置5分钟。4℃、12000rpm/min离心10min，将上清转移到新的rnaase free的离心管中，加入等体积的异丙醇，放置20min后，4℃、12000rpm/min离心10min。随用将上清倒掉，用depc水配制的70％乙醇洗涤两次，短暂离心，将残留的乙醇吸净，晾干，根据沉淀多少加入适量depc水溶解，测定浓度，准备反转录。
138.反转录成cdna：反转录用promega试剂盒完成，细胞中抽提的mrna用25ul的体系：mrna 3ug，随机引物1ul，depc水补到10ul，70℃加热10分钟后放在冰上。然后加入5xbuffer 5ul，dntp 5ul，反转录酶1ul，rna酶抑制剂0.625ul，depc水3.375ul，离心混匀，37℃反转，两个小时后取出稀释20倍用于荧光定量pcr。组织中抽提的mrna用50ul的体系：mrna 4ug，随机引物2ul，depc水补到20ul，70℃加热10分钟后放在冰上。然后加入5xbuffer 10ul，dntp 10ul，反转录酶2ul，rna酶抑制剂1.25ul，depc水6.75ul，离心混匀，37℃反转，两个小时后取出稀释10倍用于荧光定量pcr。
139.荧光定量pcr：实验为10ul体系，pcr mix 5ul，cdna 3ul，引物1ul(包括正反向)，水1ul。应用mx3000p系统进行检测。文中所用到的引物序列如表1。
140.表1、real
‑
time pcr引物序列
141.[0142][0143]
10、组织和细胞蛋白提取
[0144]
首先配制裂解液，ripa裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。适量组织研成粉末，或细胞用pbs洗两遍，吸净pbs，组织中加入500ul裂解液，6cm平皿细胞加入200ul裂解液，放于冰上裂解。细胞裂解20分钟即可，组织裂解两个小时，期间要不断震荡，最后13000rpm/min离心20min，4℃，将上清转移到新的ep管中，测定蛋白浓度，进行western blot。
[0145]
11、western blot
[0146]
首先根据需要配制不同浓度的sds
‑
page胶，将上述调好浓度的蛋白样品中加入6
×
loading，100℃金属浴5分钟，短暂离心，震荡混匀，上样。然后80v电压跑胶约20min至loading被压成一条直线，调电压到140v，继续跑胶大约一小时至loading跑到胶的最底部。开始转膜，将胶取下，切掉浓缩胶，pvdf膜提前用甲醇激活，按照海绵
‑
滤纸
‑
胶
‑
pvdf膜
‑
滤纸
‑
海绵的模式(阴极
‑
阳极)放入转膜夹子，以300ma横流将蛋白转到膜上。转膜结束后，将膜取下，根据marker标记和需要的蛋白大小进行裁膜，用5％的bsa(tbst配制)封闭1小时，加入一抗，4℃，水平摇床孵育过夜。第二天回收一抗，用tbst洗三次，每次5分钟，根据一抗的属性加二抗，室温孵育70分钟，再用tbst洗三次，每次10分钟，最后用tbs洗掉吐温，用tanon全自动化学发光成像系统进行显影。
[0147]
12、鼠尾总dna抽提
[0148]
1、鼠尾中加入600ul细胞裂解液和3ul蛋白酶k，65℃消化过夜(至少4小时)。
[0149]
2、第二天取出后先在4℃离心机短暂离心，将管壁上的液体离下去，加入400ul蛋白沉淀液，混匀，
‑
20℃放置20min。
[0150]
3、4℃，12000rpm/min离心10min，将上清迅速倒入新的ep管。
[0151]
4、每管加600ul异丙醇，混匀，4℃，12000rpm/min离心10min。
[0152]
5、弃去上清，用1ml无水乙醇清洗沉淀两次。
[0153]
6、将乙醇吸净晾干，加入100ul溶解液溶解，放入37℃培养箱30min，取出震荡即可溶解。
[0154]
13、小鼠基因型鉴定
[0155]
小鼠基因型鉴定pcr为10ul体系，2xphanta max master mix 5ul，dna 1ul，引物1ul，ddh2o 3ul。albcre和ppdpf均为同一个pcr程序，60℃退火，72℃延伸40s。所需鉴定引物如表2。
[0156]
表2、小鼠基因型鉴定引物
[0157][0158]
14、腺相关病毒(aav)的包装
[0159]
a)准备状态良好的293t细胞24皿。
[0160]
b)当细胞密度达到80％的时候，用pei将包装病毒的质粒转染进去。
[0161]
c)每个10cm培养皿加入10ug aav8，10ug helper，10ug aav shuttle vector，
[0162]
d)三种质粒加入910ul dmem(无fbs)，然后加90ul pei(总体积：1ml，dna：pei＝1：3)。
[0163]
e)震荡混匀，室温静置15min，每皿细胞加入1ml混合液。
[0164]
f)次日换液，约24小时后补加5ml培养基。
[0165]
g)转然后大约60小时后，将病毒上清收集到50ml管子中，并将细胞吹打下来收集起来。
[0166]
h)用浓缩柱(merck ufc905096)4000rpm 4℃将所有上清离心浓缩至10
‑
15ml。
[0167]
i)收集的细胞用3ml细胞裂解缓冲液(150mm nacl，20mm tris ph8.0)重悬，液氮和37℃水浴反复冻融裂解3次。
[0168]
j)将7和8得到的溶液混匀，加入mgcl2至终浓度1mm，并加入benzonase至终浓度为25u/ml，混匀后37℃水浴40min，4000rpm 4℃离心30min取上清。
[0169]
k)使用梯度碘克沙醇浓缩病毒，rt
‑
pcr法测定病毒滴度，
‑
80℃保存。
[0170]
15、细胞培养
[0171]
实验中用到的293t系为实验室原有细胞系，hepg2细胞系从李于课题组(上海生科院)获得。二者都用dmem+10％fbs+1％penicillin/streptomycin培养，均培养在37℃，5％co2的培养箱中。
[0172]
16、质粒构建
[0173]
全长的ppdpf编码序列分别克隆到p23
‑
3xflag，pcdh
‑
cmv
‑
ha，pcdna3.1
‑
myc载体
中，全长的raptor，ddb1编码序列都克隆到p23
‑
3xflag载体上。首先用primer5软件分别设计克隆引物，并且根据质粒图谱加上相应的酶切位点，使用kod
‑
plus
‑
neo高保真酶进行pcr扩增，获得全长序列。pcr产物进行dna电泳跑胶，再紫外灯下切下目的条带，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，具体按照试剂盒说明书执行。回收后的产物用适合的限制性内切酶进行酶切产物，同时酶切载体，酶切后再次回收。然后用连接酶连接回收后的片段和载体，16℃连接1小时后，转入stbl3感受态，冰浴30min，42℃热激90s，将感受态涂在相应抗性的平板上，37℃培养过夜。第二天，挑取单克隆于lb培养基中，37℃过夜培养。第3天，用天根质粒小提试剂盒进行质粒小抽，测序验证。设计克隆引物如表3。
[0174]
表3、质粒构建引物序列
[0175][0176]
17、质粒大抽
[0177]
首先，进行质粒的粗提，步骤如下：
[0178]
a)将前一天培养的250ml菌液倒入离心瓶中，配平，4℃，6000rpm，5min。
[0179]
b)弃上清，倒置干净。
[0180]
c)每管加6ml溶液i悬浮沉淀，震荡均匀。
[0181]
d)每管加12ml溶液ii(碱裂解)，轻轻横向转动，混合均匀，室温放置5min。
[0182]
e)每管加9ml溶液iii，轻微震荡混匀，4℃放置20min。
[0183]
f)4℃，12000rpm，10min。
[0184]
g)在一个新的50ml的离心管上放好檫镜纸，将上清转移到新的离心管中。
[0185]
h)加入0.6
‑
1.0倍体积的异丙醇(沉淀dna)，充分混匀，室温放置20min。
[0186]
i)4℃，12000rpm，15min。
[0187]
j)弃上清，70％乙醇洗管底和管壁2次，倒置晾干。
[0188]
k)加入2mlte(ph8.0)，溶解沉淀，放到摇床上摇15min。然后转移到2ml的离心管中，分成两管，每管1ml。
[0189]
其次，进行质粒的纯化，步骤如下：
[0190]
a)加入等体积的预冷的licl(5m)，混匀。
[0191]
b)4℃，12000rpm，10min。
[0192]
c)上清转移到另一2ml的新管中，加等体积的异丙醇，充分混匀，室温放置20min。
[0193]
d)4℃，12000rpm，10min。
[0194]
e)弃上清，70％乙醇洗2次，晾干，加入400ulte(含rnasea，1mlte加4ulrnasea)溶解沉淀，37℃中消化。消化好后，吹打均匀。
[0195]
f)加等体积40％peg8000(含1.6m nacl)，充分混匀，4℃放置过夜。
[0196]
g)4℃，12000rpm，10min。
[0197]
h)弃上清，倒置流尽，加600ul 1
×
te溶解沉淀，37℃放置。
[0198]
i)加等体积的饱和酚(注意不要吸到上层水封)，混匀以后，4℃，12000rpm，10min。
[0199]
j)小心吸上清到另一管。
[0200]
k)加等体积的酚/氯仿(各300ul)，4℃，12000rpm，10min。
[0201]
l)小心吸上清到另一管，注意不要吸到界面。
[0202]
m)加等体积氯仿，4℃，12000rpm，10min。
[0203]
n)小心吸上清到另一管，注意不要吸到界面。
[0204]
o)加入50ul(1/10体积)的naac(ph5.2)，和1ml(2倍体积)无水乙醇(沉淀dna)，混匀，室温放置。
[0205]
p)4℃，12000rpm，10min。
[0206]
q)弃上清，70％乙醇洗涤2次，晾干，让酒精充分挥发。
[0207]
r)加入400ul ddh2o溶解dna，测浓度。
[0208]
s)分装，
‑
20℃保存。
[0209]
18、慢病毒包装和稳转细胞系的构建
[0210]
病毒包装：293t细胞在10cm培养皿中培养，16h后换液9ml，按照核心质粒p23：pax：pmd.2g＝4:3:1的比例(1ml体系)，使用磷酸钙法转染293t细胞，分别在转染后24h，48h，72h收集病毒上清。将收集的病毒用0.45um的滤膜过滤进50ml离心管中，底部缓慢加入5ml20％的蔗糖溶液。4℃20000rpm/min离心2小时，倒掉上清，沉淀用2ml无血清dmem培养基溶解过夜，次日分装，
‑
80℃保存备用。
[0211]
病毒感染：hepg2消化离心后，接种到6孔板，待密度达到30％左右时，吸掉原有培养基，加入1ml含血清的培养基，然后加入500ul上述保存的病毒，24h后换正常培养基继续培养。
[0212]
流式分选：待上述6孔板长满后传至大皿，长到80％左右时消化后加入到流式管，在流式细胞分选仪上将gfp阳性的细胞分选出来，分选的细胞即为过表达稳转细胞系。
[0213]
19、肝脏甘油三酯(tg)、自由脂肪酸(nefa)的检测
[0214]
称取待检测的肝脏组织30mg左右，至于1.5ml离心管中，加入500ul 1xpbs和小钢珠，在组织匀浆仪器中将组织处理成匀浆状。将匀浆状态的组织取400ul到新的ep管中，加入1.6ml甲醇：氯仿(1：2)，放在旋转混合仪，4℃旋转过夜。剩余的100ul匀浆液离心，取上清测定蛋白浓度。次日，将上述混合液2500rpm/min，离心10min，取下层液体到另一个新的管子中，放在通风橱中风干，待液体即将挥发尽之前，用含1％tritonx
‑
100甲醇溶解。溶解后，用tg，nefa检测试剂盒根据说明去检测其含量。
[0215]
20、小鼠糖耐受(gtt)和胰岛素耐受(itt)实验
[0216]
将待检测的小鼠提前禁食12小时，然后在安静的房间将小鼠分笼，每笼分一只小鼠。gtt实验是给小鼠腹腔注射葡萄糖溶液，然后分别在0，15，30，60，120分钟通过血糖仪检测小鼠的血糖值。itt是腹腔注射胰岛素溶液，也是在0，15，30，60，120分钟通过血糖仪检测
小鼠的血糖值。
[0217]
21、石蜡切片
[0218]
健康人正常肝脏和nafld患者发生了脂肪变性的肝脏组织石蜡切片购自西安艾丽娜生物科技有限公司。
[0219]
实施例1、肝脏特异性敲除ppdpf自发形成非酒精性脂肪肝
[0220]
为了研究ppdpf在肝脏中的功能，本发明人构建了肝脏特异性敲除ppdpf的小鼠。实验分为对照组(flox)和实验组(cko)，每组10只小鼠，标准条件下饲养小鼠，将实验组与对照组进行比较。结果发现，正常饲养至8个月大时，小鼠体重出现明显差异，ppdpf敲除的小鼠体重明显增加(图1a)，解剖小鼠发现ppdpf
‑
ko组小鼠肝脏类似有大量脂肪聚集(图1b)，肝脏重量与体重的比率也明显上调(图1c)。
[0221]
为了确认ppdpf敲除小鼠有脂肪肝的出现，本发明人进行了一系列的检测，通过h&e染色发现在ppdpf
‑
ko组小鼠肝脏出现了明显的脂肪变性(图1d)。油红(oil red o)染色显示，ppdpf
‑
ko组小鼠肝脏出现大量的脂滴积累(图1d)，而且超过肝脏面积的5％。
[0222]
进一步地，本发明人通过甲醇氯仿法测定肝脏中的甘油三酯(8)(图1e)和游离脂肪酸(nefa)(图1f)的含量。结果表明，在敲除ppdpf后，二者在肝脏中的含量显著上调。
[0223]
以上数据表明，ppdpf对非酒精性脂肪肝的发生有重要作用，肝脏特异性敲除ppdpf的小鼠自发形成非酒精性脂肪肝。
[0224]
实施例2、脂质合成增加导致脂肪肝的形成
[0225]
为了探究上述脂肪肝的成因，本发明人通过rt
‑
pcr检测了与脂质合成，脂肪酸氧化，脂肪酸摄取和脂肪酸分泌相关的基因的表达变化。
[0226]
首先，本发明人检测了ppdpf mrna水平以确定小鼠的敲除效果，根据结果可以看出小鼠肝脏ppdpf实现了敲除(图2a)。
[0227]
然后，本发明人检测了脂代谢相关基因的mrna水平，其中与脂质合成相关的基因srebp1，fasn，acly，me和pparg在ppdpf
‑
cko的小鼠肝脏中显著上调(图2b)；而脂肪酸氧化相关的基因ppara，ehhadh，mcad，acox1，acad1和ech1(图2c)，脂肪酸摄取相关基因cd36和fabp1(图2d)，脂肪酸分泌相关基因apoe，apoa1和apob(图2e)，在对照组和实验组中没有显著性的差异。
[0228]
综上所述，正常饲养8个月大的小鼠，肝脏特异性敲除ppdpf的小鼠脂质合成相关基因显著上调。因此，本发明人认为，上述小鼠脂肪肝形成归因于肝脏中脂质合成增加，造成了肝脏中甘油三酯积累，最终导致脂肪肝。
[0229]
实施例3、ppdpf在肝脏中特异性敲除加速了高脂饮食诱导的脂肪肝
[0230]
1、肝脏特异性缺失ppdpf促进肝脏的脂肪变性
[0231]
由于饮食方式的不同，尤其是高热量高脂肪的饮食对脂肪肝的形成有明显的影响，因此本发明人建立了高脂诱导的脂肪肝模型，高脂喂养4个月，检测对照组和实验组小鼠的各项指标。
[0232]
首先，根据体重的统计结果(图3a)，高脂饮食后，对照组和实验组体重均明显增加，但是ppdpf
‑
cko组并没有比对照组体重增加更多。然而，在高脂喂养的小鼠中，ppdpf
‑
cko组肝脏的重量显著上调(图3b)。
[0233]
接下来，本发明人检测了肝脏中tg和nefa的含量，根据结果可以看出，tg的含量在
正常饮食和高脂饮食组均有显著的差异(图3c)，而nefa的含量只有在高脂喂养组显著上调(图3d)。
[0234]
h&e和油红染色的结果表明，在高脂喂养后，ppdpf
‑
cko组小鼠肝脏出现严重的脂肪变性，脂滴大量积累(图3e)。
[0235]
通过rt
‑
pcr检测脂质合成相关基因的表达发现，在高脂饮食后，ppdpf
‑
cko组小鼠脂质合成基因表达显著上调(图3f)，这也能解释肝脏中脂肪变性的表型。
[0236]
以上实验结果表明，肝脏特异性缺失ppdpf促进肝脏的脂肪变性。
[0237]
2、肝脏特异性缺失ppdpf葡萄糖耐受能力和胰岛素耐受能力增加
[0238]
为了更好地评估小鼠机体的代谢状态，本发明人分别通过腹腔注射葡萄糖和胰岛素进行了葡萄糖耐受试验(gtt)和胰岛素耐受试验(itt)。
[0239]
结果显示，正常饮食的小鼠对照组和实验组均没有明显的差异，而高脂饮食的小鼠，ppdpf
‑
cko组的小鼠展示了更强的葡萄糖耐受能力和胰岛素耐受能力(图4)。
[0240]
实施例4、腺相关病毒介导的ppdpf在肝脏中特异性过表达抑制了高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性
[0241]
1、肝脏过表达ppdpf抑制脂肪肝的进展
[0242]
为了进一步确认ppdpf对高脂诱导的肝脏脂肪变性的抑制作用，本发明人通过尾静脉注射腺相关病毒(aav)的技术构建了特异性肝脏过表达ppdpf小鼠，aav8
‑
con为对照组，aav8
‑
ppdpf为实验组，正常饮食和高脂喂食12周后分别进行各项指标的检测。
[0243]
体重统计的结果表明，高脂饮食的小鼠过表达ppdpf后体重有轻微的降低(图5a)，而肝脏重量显著下降(图5b)。
[0244]
肝脏组织tg和nefa检测表明，ppdpf过表达显著抑制了肝脏中脂质的积累(图5c，d)。
[0245]
h&e和油红染色更直观的呈现出ppdpf在肝脏中过表达抑制了高脂诱导的肝脏脂肪变性和脂滴的积累(图5e)。
[0246]
rt
‑
pcr检测脂质合成相关基因的表达进一步确认了ppdpf对肝脏脂质合成的抑制功能(图5f)。
[0247]
综上所述，肝脏过表达ppdpf抑制了肝脏脂质合成的能力，进而抑制了高脂诱导的脂肪肝的进展。
[0248]
2、肝脏过表达ppdpf提高葡萄糖和胰岛素感应能力
[0249]
本发明人分别通过腹腔注射葡萄糖和胰岛素进行了葡萄糖耐受试验(gtt)和胰岛素耐受试验(itt)。
[0250]
结果显示，正常饮食的小鼠对照组和实验组均没有明显的差异，而高脂饮食的小鼠，aav8
‑
ppdpf组的小鼠显示出更敏感的葡萄糖和胰岛素感应能力(图6)。
[0251]
实施例5、肝脏特异性ppdpf ko促进了肝癌的发生和发展
[0252]
在den诱导的模型中，本发明人发现ppdpf肝脏特异性ko促进了肝癌的发生发展。den(40mg/kg)诱导7个月后，本发明人处死小鼠，取肝脏进行检测。如图7a所示，对照组小鼠并没有明显的肝癌生成，但是ppdpf ko组小鼠均有显著的肝癌。
[0253]
本发明人检测了den诱导肝癌模型中小鼠的体重，肿瘤的大小、数量，血液中的alt水平，记录了小鼠的生存时间。结果发现，ppdpf肝脏特异性ko的小鼠相比于对照小鼠，体重
增加(图7b)，大体积的肿瘤更多(图7c)，肿瘤的数量更多(图7d)，alt的水平更高(图7e)，生存时间缩短(图7f)。并且，ppdpf肝脏特异性ko小鼠产生的肝癌细胞中，有着明显的脂滴沉积，以及膨胀的肝癌细胞，具有显著的非酒精性脂肪肝病相关的肝癌(nafld
‑
related hcc)的特征(图7g)。
[0254]
实施例6、缺失ppdpf促进了体外培养的肝原代细胞的脂质合成
[0255]
接下来本发明人研究了ppdpf在体外对脂肪变性的影响。分离flox和cko小鼠的肝脏原代细胞，体外用棕榈酸(pa)处理细胞，模拟一种高脂的环境。
[0256]
图8a表明cko小鼠的肝脏原代细胞中ppdpf的敲除效果。在经过pa处理24小时后检测细胞中tg的含量。结果表明，pa处理后，ppdpf敲除的原代细胞中tg含量显著上调，而加bsa处理的对照组没有明显变化(图8b)。油红染色也表明了这一点，ppdpf敲除促进了原代细胞中脂滴的积累(图8c)，脂质合成相关基因的检测也印证了体内的结果，ppdpf敲除显著促进了pa诱导的脂质合成相关基因的表达(图8d)。
[0257]
这些研究结果表明，在体外，敲除ppdpf也促进了pa诱导的肝脏原代细胞脂肪变性，这与体内结果是一致的。
[0258]
实施例7、过表达ppdpf抑制hepg2细胞脂质合成能力
[0259]
为了确定ppdpf在人类肝细胞中对脂质合成的作用，本发明人构建了ppdpf过表达的hepg2稳转细胞系。
[0260]
图9a通过western blot说明了ppdpf的过表达效果。本发明人用pa处理细胞后检测细胞中tg的含量，结果表明过表达ppdpf显著抑制了hepg2细胞中tg的产生(图9b)。尼罗红染色也直观地呈现出过表达ppdpf抑制了hepg2细胞中脂滴的积累(图9c)。rt
‑
pcr的结果说明，hepg2细胞过表达ppdpf显著抑制了脂质合成相关基因的表达。
[0261]
以上hepg2细胞系中的结果说明，ppdpf在人类肝细胞系中也有和小鼠中一致的表型，过表达ppdpf抑制了pa诱导的hepg2细胞脂肪变性。
[0262]
实施例8、ppdpf对脂质合成的调控依赖于mtor信号通路的活化
[0263]
以上的研究结果表明，ppdpf通过抑制脂质合成基因的表达进而抑制了肝脏脂肪变性，抑制了脂肪肝的发展。考虑到mtor信号通路是调控机体代谢的中枢，而且上述本发明人检测到的与脂质合成相关的基因的表达也主要是受到mtor信号通路的调控，多篇文章报道mtor通过调控srebp1以及其靶基因的表达来影响脂质合成，因此，本发明人假设ppdpf对脂质合成的调节是通过mtor信号通路完成的。接下来本发明人通过western blotting检测了上述肝脏组织中mtor信号通路的变化情况。
[0264]
首先对正常饲养8个月自发形成脂肪肝的小鼠肝脏组织进行检测，结果显示s6k的磷酸化显著上调，脂质合成相关基因srebp1，fasn的蛋白水平也显著上调(图10a)。随后对高脂饲养16周的小鼠肝脏组织检测也发现类似结果，ppdpf敲除后显著促进了高脂诱导的s6k的磷酸化以及srebp1和fasn的表达(图10b)。相反，过表达ppdpf后抑制了s6k的磷酸化以及srebp1和fasn的表达(图10c)。这些结果表明，ppdpf抑制了小鼠肝脏mtor信号通路的活化和脂质合成相关基因的表达。
[0265]
那么，ppdpf对mtor信号通路的影响在体外是如何呢？发明人用pa分别去处理从ppdpf
‑
flox和ppdpf
‑
cko小鼠中分离的肝原代细胞及过表达ppdpf的hepg2细胞系，分别处理不同的时间点。结果表明，在原代细胞中，ppdpf敲除促进了pa诱导的s6k的激活以及
srebp1，fasn的表达(图11a)。反之，hepg2细胞中的得到了相反的结果(图11b)。
[0266]
为了确认ppdpf对脂质合成的调控是通过mtor信号通路介导的，本发明人用mtor信号通路的抑制剂torin1处理分离的肝脏原代细胞在pa处理的情况下，然后去检测细胞中的脂质合成。油红染色表明pa处理后ppdpf
‑
cko的小鼠肝脏原代细胞中脂滴积累显著多于对照组，而加入torin1后脂滴明显减少(图12a)，细胞中tg检测也是类似结果(图12b)，在torin1处理后脂质合成相关基因的表达也显著下调(图12c)。
[0267]
以上实验结果表明，ppdpf通过抑制mtor信号通路的激活，从而抑制了转录因子srebp1的表达及活化，进而抑制了与脂质合成相关靶基因的表达，抑制了肝脏中脂质的积累，减弱了脂肪肝的进程。
[0268]
实施例9、回补ppdpf抑制了ppdpf
‑
cko小鼠自发脂肪肝的形成
[0269]
以上实施例证明，ppdpf的敲除通过促进mtor信号通路的激活进而影响脂质合成相关基因的表达，增加肝脏中脂滴聚集，促进脂肪肝形成。那么本发明人在敲除的基础上回补ppdpf的表达是否能反转表型，抑制脂肪肝形成，从而让这一研究更具有治疗意义呢？鉴于此，本发明人通过腺相关病毒aav8介导的ppdpf过表达在ppdpf
‑
cko的小鼠中进行回补ppdpf的实验。小鼠出生后3个月时，在ppdpf
‑
cko的小鼠中进行尾静脉注射aav8
‑
ppdpf，同时设置aav8
‑
con的对照组，继续正常饲养5个月后对小鼠进行各项指标的检测。结果显示，回补表达ppdpf后，小鼠体重和肝重出现了明显的回复(图13a和图13b)，对小鼠肝脏进行tg和nefa的检测发现回补ppdpf后，肝脏中脂质的积累明显减少(图13c和图13d)。h&e和油红染色的结果更加直观地揭示回补ppdpf后小鼠肝脏中脂肪变性在很大程度上缓解，脂滴累积也出现了回复(图13e)。rt
‑
pcr检测与脂质合成相关基因的表达也与表型相符，ppdpf回补抑制了由于ppdpf ko而上升的基因表达(图13f)。这些结果表明，ppdpf的回补达到了对ppdpf
‑
cko小鼠自发形成脂肪肝的抑制效果。
[0270]
接下来，本发明人用小鼠肝脏组织进行体内分子机制的验证。western blot的实验表明，回补ppdpf后s6k的磷酸化水平被抑制，srebp1和fasn的表达也出现明显的下降(图14)，这进一步证明了在体内ppdpf发挥作用的分子机制。
[0271]
以上结果表明，ppdpf的回补抑制了ppdpf
‑
cko小鼠肝脏中mtor信号通路的活化，进而缓解了脂肪肝的形成。
[0272]
实施例10、回补ppdpf抑制了ppdpf
‑
cko小鼠中高脂诱导的脂肪肝的形成
[0273]
进一步地，本发明人也在高脂诱导的脂肪肝模型中，进行了ppdpf的回补实验。小鼠出生后2个月时，在ppdpf
‑
cko的小鼠中进行尾静脉注射aav8
‑
ppdpf，同时设置aav8
‑
con的对照组，在此期间进行高脂(hfd)喂食。继续饲养3个月后对小鼠进行各项指标的检测。结果显示，回补ppdpf的表达后小鼠体重和肝重出现了明显的回复(图15a和图15b)，对小鼠肝脏进行tg和nefa检测，发现回补ppdpf后，肝脏中脂质的积累明显减少(图15c和图15d)。h&e和油红染色的结果更加直观地揭示回补ppdpf后小鼠肝脏中脂肪变性在很大程度上缓解，脂滴累积也出现了回复(图15e)。rt
‑
pcr检测与脂质合成相关基因的表达也符合表型，ppdpf的回补又抑制了这些基因的表达(图15f)。
[0274]
上述结果表明，在ppdpf
‑
cko小鼠中ppdpf的回补达到了对高脂诱导形成脂肪肝的抑制效果。
[0275]
实施例11、ppdpf在nafld患者的脂肪变性组织中的表达下调
[0276]
本发明人通过免疫组化的方法检测了健康人肝脏组织以及nafld患者发生了脂肪变性的肝脏组织中ppdpf的表达，进行比较。
[0277]
结果显示，ppdpf在脂肪变性肝脏组织中的表达显著下调(图16)。
[0278]
实施例12、ppdpf和raptor直接相互作用，并对raptor的泛素化进行负调控
[0279]
本发明人发现，ppdpf能够影响mtor的激活，由于ppdpf和mtor复合物都存在于细胞质中，所以推测有可能ppdpf通过和mtor复合物相互作用影响mtor信号通路的激活。
[0280]
本发明人通过免疫共沉淀实验检测了ppdpf和mtor复合物重要成员mtor、raptor和rictor的相互作用。本发明人发现ppdpf能与mtor和raptor相互作用，但是不能和rictor相互作用。正反向免疫沉淀均证实了ppdpf和raptor的互作，而沉淀mtor不能拉下来ppdpf(图17a和17b)。本发明人在肝原代细胞中检测到內源的raptor和ppdpf的相互作用(图17c和17d)，而gst pulldown assay进一步确证了两者间的相互作用(图17e)。
[0281]
为了阐释ppdpf和raptor的具体相互作用，本发明人将ppdpf分成5个片段，将每个片段分别和gst tag相连。gst pulldown assay揭示ppdpf的51
‑
64位氨基酸介导了它和raptor的相互作用(图17f)。为了进一步验证这一发现，本发明人将51
‑
64位氨基酸全部突变为丙氨酸(ppdpf mut)，在293t细胞中分别转入野生型ppdpf和ppdpf mut，通过免疫沉淀发现ppdpf mut不能和raptor相互作用(图17g，17h)，gst pulldown assay进一步证明了这一点(图17i)。
[0282]
mtor信号通路在众多生物学事件中都扮演着重要角色，在很多疾病中都呈现出高度活化。除了遗传学水平(比如突变)，关键成员的翻译后修饰也是非常重要的。据报道，raptor的泛素化在mtor信号通路的激活中是一个关键步骤。因此，本发明人在293t和hepg2细胞中检测了野生型ppdpf和ppdpf mut对mtor泛素化的影响。如图17j和18a所示，ppdpf过表达显著降低了raptor的泛素化，而ppdpf mut则对raptor的泛素化没有显著影响。
[0283]
由于并不清楚raptor的泛素化是否参与了对脂质信号的响应，本发明人用棕榈酸(palmitic acid，pa)处理了细胞。在hepg2细胞中，pa刺激显著增强了raptor的泛素化，而pa对raptor泛素化的诱导在ppdpf过表达的细胞中被抑制，但是ppdpf mut并未显示出抑制作用(图18b)。相应的，在原代肝脏细胞中，ppdpf敲除增强了pa诱导的raptor的泛素化(图18c)。
[0284]
此外，本发明人还在hepg2细胞中检测了pa处理对s6k磷酸化，srebp1和fasn表达水平的影响。ppdpf过表达显著抑制了pa诱导的mtor信号通路的激活，而ppdpf mut则对mtor信号通路没有明显影响(图18d)。
[0285]
这些数据说明，ppdpf通过影响raptor的泛素化，调控了脂质信号对mtor信号通路的激活。
[0286]
实施例13、ppdpf
‑
raptor相互作用是ppdpf对脂代谢及mtor信号通路的调控所必需的
[0287]
为了阐释ppdpf
‑
raptor相互作用对mtor信号通路和脂代谢的调控作用，aav8
‑
tbg
‑
ppdpf和aav8
‑
tbg
‑
ppdpf mut病毒通过尾静脉注射到ppdpf
‑
lko(ppdpf肝特异性敲除ppdpf，liver specific knockout)小鼠的肝脏中。和之前的发现一致，aav8
‑
tbg
‑
ppdpf显著降低了8个月时ppdpf
‑
lko小鼠的体重(图19a)、肝重(图19b)、肝脏甘油三酯(图20a)、游离脂肪酸(图20b)，脂滴累积(图20c)和脂质生成基因的表达(图19c)。而ppdpf mut并未显
示出任何rescue效果(图20a
‑
c，图19a
‑
c)。此外，相比vector对照，ppdpf过表达降低了ppdpf
‑
lko小鼠中p
‑
p70s6k、srebp1和fasn的水平，而ppdpf mut则对mtor signaling没有显著影响(图20d)。
[0288]
本发明人也在高脂喂食动物模型中做了类似的实验，将ppdpf和ppdpf mut重新导入10周大的高脂喂食的ppdpf
‑
lko小鼠的肝脏中，然后再进行3个月的高脂喂食。在3个月高脂喂食后，和aav8
‑
con相比，aav8介导的ppdpf的重新导入降低了小鼠的体重(图19d)、肝重(图19e)，肝脏甘油三酯(图20e)和游离脂肪酸(图20f)，脂滴累积(图20g)以及脂质生成基因的mrna水平(图19f)，而ppdpf mut则并没有减轻hfd诱导的肝脏脂肪变性(图20e
‑
g，图19d
‑
f)。相应的，和对照相比，ppdpf过表达降低了p
‑
p70s6k、srebp1和fasn的水平，而ppdpf mut则没有这种作用(图20h)。
[0289]
这些数据表明，ppdpf能够抑制ppdpf
‑
lko小鼠中自然发生或者是高脂喂食诱导的nafld，而ppdpf mut则丧失了这一功能，提示ppdpf和raptor的相互作用对于ppdpf对mtor信号通路和脂代谢的调控是非常重要的。
[0290]
实施例14、ppdpf干扰了ddb1和raptor的相互作用，从而阻断了raptor的泛素化
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为了研究ppdpf如何调控raptor的泛素化，本发明人在293t细胞中过表达了3xflag
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ppdpf(图21a)，然后进行了质谱分析。本发明人发现和ppdpf相互作用的分子中有很多e3 ligase，其中有cul4b。由于之前报道cul4b
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ddb1能够对raptor进行泛素化，而ddb1负责将靶蛋白和e3 ligase相偶联(图21b)。本发明人通过免疫共沉淀实验检测到了ddb1和ppdpf之间的相互作用(图22a和22b)。gst
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pulldown assay进一步确证了ppdpf和ddb1之间的相互作用(图22c)。此外，ddb1过表达能够增强raptor的泛素化，而ppdpf能减弱这一作用(图22d)，证明ppdpf的确能调控cul4b
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ddb1对raptor的泛素化。
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由于mtoc1的激活依赖于cul4b
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ddb1对raptor的泛素化，因此本发明人假设ppdpf也许会干扰raptor
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ddb1相互作用。为了证明这一假设，本发明人在293t中过表达ppdpf，然后使用raptor的抗体进行了免疫共沉淀。如图22e所示，raptor和ddb1的相互作用被ppdpf减弱了。此外，raptor和mtor的相互作用也减弱了，这可能和ppdpf降低了raptor的泛素化有关。本发明人在hepg2细胞中也得到了同样的结果(图22f)。本发明人还在293t和hepg2细胞中检测了ppdpf mut是否能干扰raptor和ddb1的相互作用。本发明人发现，ppdpf mut无法干扰raptor和ddb1的相互作用(图23a和23b)。另外，本发明人使用pa处理了对照和ppdpf过表达的hepg2细胞，检测了raptor和ddb1、mtor的相互作用。如图22g所示，pa处理增强了raptor
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mtor的相互作用，但是几乎不影响raptor
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ddb1的相互作用。无论是在静息状态还是pa刺激下，ppdpf过表达显著降低了raptor
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mtor以及raptor
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ddb1的相互作用，提示ppdpf对raptor
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ddb1相互作用的干扰可能影响了脂质信号对mtor信号通路的激活。为了进一步证实这一假设，本发明人从ppdpf
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wt和ppdpf
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lko小鼠中分离了肝原代细胞，然后免疫共沉淀揭示ppdpf ko显著增强了raptor和ddb1以及mtor之间的相互作用(图22h)。此外，本发明人还发现，ppdpf对raptor与ddb1、mtor相互作用的抑制呈现剂量依赖效应(图20c)。
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此外，补回ppdpf削弱了raptor和ddb1、mtor在体内的相互作用(图22i)，这就进一步证实了这一机制。
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总的来说，本发明人的数据揭示脂质信号能增强raptor的泛素化，ppdpf通过干扰raptor和ddb1的相互作用，抑制raptor的泛素化，从而影响了raptor和mtor的相互作用，并
抑制了脂质信号对mtor信号通路的激活。
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在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。