一种用于根管冲洗和阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料及其制备方法

本发明属于生物材料技术领域,尤其是涉及一种用于阻断治疗不同病变程度牙体硬组织龋的抗生物膜-再矿化材料及其制备方法。

背景技术：

针对一些暂时不便或没有条件进行有创治疗的特殊患龋人群，比如治疗不配合的幼儿和残障人士、行动不便的老年人，甚至也包括较长时间在外执行任务的航天员、海军战士等特殊人群，或在口腔医生职业暴露风险提高的公共卫生事件中(2003年严重急性呼吸综合征(sars)和2019年新型冠状病毒(covid-19)疫情)，目前仍缺乏一种高效精准的无创阻断龋病进展的技术和材料来暂时代替有创治疗，目前氟化物为主的龋病药物治疗尚不能完全有效地解决上述问题。此外，用于治疗牙髓炎及根尖周炎的根管治疗术的核心技术是控制感染，经过机械预备后根管内仍可残留细菌生物膜，因此通过根管冲洗进行化学预备尤为重要。目前临床所用根管冲洗液存在作用时间短，无法作用于牙本质小管等微细结构以及冲洗后药物无法存留于作用部位等局限性，大大减低了杀菌效果。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种用于根管冲洗和阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料及其制备方法，以克服现有技术缺点，材料可深入牙本质小管内部，携带抗菌剂发挥长期稳定的杀菌作用，同时在唾液环境内再矿化牙本质小管，实现控制根管感染、阻断龋病进程并再矿化脱矿牙体硬组织的目的。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于根管冲洗和阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料，将溶菌酶和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶于羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，ph调至6.5-7.5，混合溶菌酶和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液得到相转变溶菌酶(phasetransitedbovinelysozyme,ptl)溶液，加入抗菌剂，形成根管冲洗和阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料。

优选的，所述抗菌剂(chlorhexidine,chx)为氯己定或奥替尼啶(octenidine,oct)。

优选的，所述溶菌酶与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的质量比例为1-10:130-150。

优选的，当抗菌剂为葡萄糖酸氯己定时，溶菌酶与葡萄糖酸氯己定的质量比例为1-10:2-25，优选的，2-4:15-20；当抗菌剂为奥替尼啶时，溶菌酶与加入的奥替尼啶的质量比例分别为2-10:5-15，优选的，2-4:5-10。

优选的，相转变溶菌酶ptl的平均粒径为100-500nm，加入葡萄糖酸氯己定形成的ptl-chx纳米复合物的平均粒径为300-500nm，加入奥替尼啶形成的ptl-oct纳米复合物的平均粒径为300-500nm。

本发明还提供一种制备如上所述的用于根管冲洗和阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料的方法，包括如下步骤，

1)在充分搅拌的条件下，向羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入溶菌酶，得到a溶液；温度为20℃-30℃；

2)在充分搅拌的条件下，向羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，得到b溶液；温度为20℃-30℃；

3)在充分搅拌的条件下，向羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入葡萄糖酸氯己定，得到c溶液；混合b溶液和c溶液，得到d溶液，温度为20℃-30℃；

4)在充分搅拌的条件下，混合a溶液和d溶液，得到ptl-chx溶液，即用于根管冲洗的抗生物膜-再矿化材料；优选的，所述氯己定在相转变溶菌酶溶液(ptl溶液)中的质量分数为2-4％；

步骤1)-步骤4)中，搅拌速度均为1000r/min-2000r/min。

本发明还提供一种制备如上所述的用于根管冲洗和阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料的方法，包括如下步骤，

1)在充分搅拌的条件下，向羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入溶菌酶，得到a溶液；温度为20℃-30℃；

2)在充分搅拌的条件下，向羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，得到b溶液；温度为20℃-30℃；

3)在充分搅拌的条件下，混合a溶液和b溶液，得到ptl溶液；

4)在充分搅拌的条件下，向步骤3)中得到的ptl溶液中加入奥替尼啶，得到ptl-oct溶液，即用于阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料；优选的，奥替尼啶在相转变溶菌酶溶液(ptl溶液)中的质量分数为0.5-1％。

步骤1)-步骤4)中，搅拌速度均为1000r/min-2000r/min。

优选的，步骤1)中，所述羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液的浓度为10mm。

本发明也提供如上所述的用于根管冲洗和阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料在根管治疗、脱矿牙体硬组织仿生再矿化和牙本质龋的龋病阻断药物及护理产品中的应用。

本发明也提供如上所述的用于根管冲洗和阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料制备方法制备的材料在根管治疗、脱矿牙体硬组织仿生再矿化和牙本质龋的龋病阻断药物及护理产品中的应用。

相对于现有技术，本发明所述的一种用于根管冲洗和阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料及其制备方法，具有以下优势：

本发明所述材料制备方法简便，条件温和环保，相转变溶菌酶具有良好的亲水性和稳定的粘附性，作为药物载体体积较小，可携带抗菌剂深入牙本质小管内部，清除根管致病细菌生物膜发挥长效抗菌作用并长期维持根管内无菌状态；同时相转变溶菌酶具有丰富的官能团，在唾液环境下可螯合钙离子进一步在牙本质龋处形成再矿化矿物，氯己定及奥替尼啶对龋损处细菌生物膜具有一定的杀菌作用，可达到特殊情况下阻断治疗牙本质龋的效果。本材料无毒、无刺激且具有良好的生物相容性，具有理想的使用效果及较高的临床价值。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为实验一中制备的ptl(a)及ptl-chx(b)透射电镜图像及粒径检测结果。ptl为无序堆积的淀粉样蛋白聚集体，ptl-chx为分散的载药纳米蛋白颗粒。粒径检测结果显示ptl纳米颗粒平均直径约为100～500nm(c)；ptl-chx载药纳米蛋白颗粒平均直径约为300～500nm(d)。

图2为实验二中ptl及ptl-chx溶液外观及根管内粘附扫描电镜图像。弱酸条件下，ptl及ptl-chg溶液外观白色乳液，扫描电镜结果显示在ph＝6.5条件下ptl(a)及ptl-chx(b)复合物呈纳米级颗粒状态。

图3为实验三中ptl-chx对牙本质表面生物膜形成影响的评估，结果表明，chx及ptl-chx均对生物膜形成均有明显的抑制作用，且ptl-chx生物膜抑制率更高，与chx和ptl组均有显著差异。

图4为实验四中ptl-oct溶液外观、透射电镜图像及粒径检测结果。溶液外观无色澄清(a)，透射电镜结果显示负染后ptl-oct呈白色圆形纳米颗粒(b)，粒径检测结果显示ptl-oct复合物颗粒平均直径约为300-500nm(c)。

图5为实验四中牙本质龋模型再矿化处理后扫描电子显微镜图像，结果显示牙本质龋模型(a)中牙本质小管完全暴露，小管内部无玷污层；去离子水处理组(b)可见少量矿化物形成，散在分布，牙本质小管未被完全封闭；ptl-oct组(c)中牙本质小管被矿化物完全封闭，封闭物较为致密，矿化效果明显。

图6为实验五中ptl-oct对牙本质表面生物膜形成影响的评估，结果表明，oct、ptl及ptl-oct均对生物膜形成均有明显的抑制作用，且ptl-oct生物膜抑制率更高，与chx和ptl组均有显著差异。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例一

一种用于根管冲洗的抗生物膜-再矿化材料，通过如下步骤制备而成，

(1)葡萄糖酸氯己定与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐混合液的合成

在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，向7ml羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入3ml质量分数为20％葡萄糖酸氯己定原液后，得到a溶液；

在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，向10ml羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.14g，待完全溶解后，得到b溶液；

在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，等体积将b液加入到a液中，用溶液震荡仪将混合液震荡5分钟至溶液无色透明，得到c液。

(2)相转变溶菌酶蛋白复合物的合成

在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，向10ml羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入溶菌酶20mg，待完全溶解后，得到d溶液；将b溶液和d溶液等体积混合，反应50min后，得到ptl溶液。形成的ptl纳米复合物的平均粒径为100-500nm。

(3)抗生物膜-再矿化材料的形成

在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，将c溶液和d溶液按1:2体积比混合，反应20min后，得到ptl-chx溶液。形成的ptl-chx载药纳米颗粒的平均粒径为300-500nm，即根管冲洗的抗生物膜-再矿化材料。

实验一

使用实施例一中步骤(2)(3)中的ptl溶液及ptl-chx溶液滴于铜网，磷钨酸负染后进行tem检测。分别对ptl及ptl-chg溶液进行dls粒径检测。表征结果如图1所示。

实验二

收集因智齿阻生拔除的完整无龋坏无明显磨耗的新鲜离体牙20个，去离子水冲洗干净，用慢速磨牙机在流水冷却下去除牙冠。将得到的牙根用常规冠向下方法进行根管预备，并用次氯酸钠及edta溶液去除根管内玷污层，离体牙根高温高压灭菌后生理盐水4℃保存。将离体牙分别浸泡于实施例一中步骤(2)(3)中的ptl溶液及ptl-chx溶液中50min，之后用大量去离子水去除游离药物，对离体牙梯度脱水并干燥后对根管内壁进行sem检测。表征结果如图2所示。

实验三

对于生物膜形成测定，用添加质量分数为1％蔗糖的bhi培养基将粪肠球菌悬浮液重悬至1×10⁸cfu/ml。将唾液包被的离体牙根分别用pbs、chx、ptl及ptl-chx进行根管冲洗后，用去离子水完全去除离体牙根表面游离药物后分组置于孔板中，每孔加入2ml体积的细菌悬浮液+2mlbhi进行21天生物膜培养，通过clsm比较各组之间的生物膜总生物量。表征结果如图3所示。

实施例二

一种用于根管冲洗的抗生物膜-再矿化材料，通过如下步骤制备而成：

(1)相转变溶菌酶复合物的合成

在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，向10ml羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入溶菌酶20mg，待完全溶解后，得到e溶液；向10ml羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.14g，待完全溶解后，得到f溶液。将e溶液和f溶液等体积混合，反应50min后，得到ptl溶液。形成的ptl纳米复合物的平均粒径为100-500nm。

(2)抗生物膜-再矿化材料的形成

在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，向实施例二步骤(1)所得的e溶液和f溶液等体积混合，同时加入100mg奥替尼啶，常温常压下反应50min，反应后形成的ptl-oct纳米复合物的平均粒径为300-500nm，即阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料。

实验四

收集因智齿阻生拔除的完整无龋坏无明显磨耗的新鲜离体牙20个，去离子水冲洗干净，用慢速磨牙机在流水冷却下制备4mm*4mm*1.5mm的牙本质样品，sic砂纸精细打磨抛光。牙本质样品edta脱矿30min制备人工牙本质龋模型，随机选择5个进行sem表征。表征结果如图4所示。

实验五

将人工牙本质龋分别浸泡于实施例二中步骤(2)中的阻断治疗牙本质龋的抗生物膜-再矿化材料ptl-oct溶液和去离子水中20分钟，自然晾干，随后将牙本质浸泡于模拟唾液7天，每天更换新鲜模拟唾液。检测前，用去离子水反复冲洗牙本质表面三次，干燥脱水后进行clsm、sem检测。表征结果如图5所示。

实验六

对于生物膜形成测定，用添加质量分数为1％蔗糖的bhi培养基将变形链球菌悬浮液重悬至2×10⁶cfu/ml。将唾液包被的牙本质片分组置于孔板中，每孔加入200μl体积的细菌悬浮液，实验组每孔加入等体积实施例二中步骤(2)中的抗生物膜-再矿化溶液，对照组加入等体积的去离子水，然后在厌氧条件下于37℃培养24小时。培养结束后用pbs冲洗牙本质片三次，干燥、0.1％(w/v)结晶紫染色15分钟，再用pbs洗涤三次，干燥后用400μl80％(v/v)乙醇溶液脱色。酶标仪检测溶液在590nm处的吸光度值，比较各组之间的生物膜总生物量。表征结果如图6所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。