1.本发明涉及涉及医药技术、美容保健技术领域，特别涉及一种间充质干细胞分泌因子与内容物和金银花干细胞提取物组合物及其制备方法。
背景技术：
2.间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，根据来源的不同可以分为胎盘间充质干细胞和牙髓间充质干细胞，子宫蛻膜间充质干细胞，骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞等。分化方向是具有组织或器官特异性的细胞，能在适宜的环境中分化成与其定位相宜的细胞系，又称为多能干细胞。干细胞在特定的环境中可以定向分化，从而达到修复组织和细胞损伤的作用。间充质干细胞可以通过分化为特定的细胞来修复组织，而间充质干细胞的干细胞分泌因子的旁分泌作用在组织的修复中发挥了更大的作用。也就是说，在间充质干细胞治疗组织损伤的时候，干细胞分泌的细胞因子也发挥了极为重要的作用。甚至影响到分化方向。间充质干细胞的干细胞分泌因子体系包括内皮细胞生长因子(vegf)、表皮细胞生长因子(egf)、干细胞因子(scf)、肿瘤凋亡因子(tnf)，肝细胞生长因子(hgf)、神经生长因子(ngf)、胰岛素样成长因子(igf)、纤维母细胞生长因子、白细胞介素2(il)，粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)等20余种。
3.此外，干细胞分泌因子中还含各型胶原蛋白(如i、ii、iii、iv型胶原蛋白)以及各种溶菌酶等对机体的作有及修复损伤中都是必不可少的。表皮干细胞是一种单能干细胞，也是皮肤更新的种子细胞。人类表皮每天都有大量的表皮细胞死亡脱落，也会有相应数量的新生表皮细胞加以补充。随着人们年龄的增加，干细胞数量逐渐枯竭，以及干细胞再生能力下降。皮肤出现斑点，折皱也逐渐增多，这就是表皮干细胞再生能力的减退，如何使表皮干细胞保持旺盛的新陈代谢能力，是保持皮肤健康的关键。
4.基于人们对皮肤的健康以及美容的需求，干细胞美容技术及其相关产品的近年来受到业界的重视。目前市场上出现了大量所谓的干细胞产品，从专业技术角度上并不具备实施的可行性。中国专利cn1817339a、n1872025a、cn1817339a专利涉及产品的内容使用了活性干细胞和中药组分，首先如何在护肤品种保持干细胞的活性？干细胞如何穿透皮肤的角质层？其次如何避免干细胞培养液中添加的毒素对人体的损害？以上问题及因素在其公布的专利中的组分无法解决，这些都是对干细胞的不成熟认识，且中国专利cn107714640a公开了本发明公开了一种含有荷花干细胞提取物的美白祛斑化妆品所述美白祛斑化妆品由1
‑
10％的美白祛斑制剂和90
‑
99％的载体组成。其中美白制剂为荷花干细胞提取物、甘草提取物和桑叶提取物，其中本发明的美白祛斑化妆品的主要机理是是通过美白制剂抑制酪氨酸酶、减少酪氨酸酶的产生和合成、抑制酪氨酸酶的糖化、加速酪氨酸酶的分解从而抑制酪氨酸酶的活性。观察专利特点，化学配方过于复杂，干细胞配方过于简单，其次，干细胞添加量太少，效果有限。虽然配方具有一定科学性，但是大量的化学品添加影响了当今护肤品的天然，环保的理念
5.基于以上因素，本申请人经过多年的实践经验，特别研发了一种间充质干细胞分泌因子与内容物和金银花干细胞提取物组合物及其制备方法，其中包含间充质干细胞分泌因子与内容物、金银花干细胞提取物、蚯蚓激酶、透明质酸。主要涉及用于水性化妆品制备方法。该组合物对皮肤无过敏反应，无刺激与反应性皮炎，小分子量，是能够展现诸多效应的，很有效吸收的高质量化妆品。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种间充质干细胞分泌因子与内容物和金银花干细胞提取物组合物及其制备方法，该组合物对皮肤无过敏反应，无刺激与反应性皮炎，小分子量，是能够展现诸多效应的，很有效吸收的高质量化妆品。
7.本发明的目的是通过下述技术方案予以实现：一种间充质干细胞分泌因子与内容物和金银花干细胞提取物组合物，包括以下重量组分的原材料，间充质干细胞分泌因子冻干粉、金银花干细胞提取物、透明质酸、蚯蚓激酶、芳香剂、乳化剂、增稠剂；
8.其中，间充质干细胞分泌因子冻干粉10
‑
25份、金银花干细胞提取物10
‑
20份、透明质酸10
‑
30份、蚯蚓激酶1
‑
8份、芳香剂0.01
‑
1份、乳化剂2
‑
10份、增稠剂0.1
‑
1份。
9.进一步地，所述原材料包括以下材料及重量组分：间充质干细胞分泌因子冻干粉10
‑
15份、金银花干细胞提取物10
‑
15份、透明质酸15
‑
25份、蚯蚓激酶2
‑
5份、芳香剂0.01
‑
0.05份、乳化剂3
‑
5份、增稠剂0.1
‑
0.5份。
10.进一步地，所述原材料包括以下材料及重量组分：间充质干细胞分泌因子冻干粉10份，金银花干细胞提取物10份，透明质酸15份，蚯蚓激酶2份，芳香剂0.03份，乳化剂3份、增稠剂0.5份。
11.进一步地，所述原材料包括以下材料及重量组分：间充质干细胞分泌因子冻干粉15份，金银花干细胞提取物15份，透明质酸25份，蚯蚓激酶5份，芳香剂0.05份，乳化剂5份、增稠剂0.5份。
12.进一步地，所述原材料包括以下材料及重量组分：间充质干细胞分泌因子冻干粉10份，金银花干细胞提取物15份，透明质酸20份，蚯蚓激酶4份，芳香剂0.05份，乳化剂5份。
13.进一步地，所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备如下：
14.第一步：间充质干细胞的组织成分液获取步骤：取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，然后将收集的间充质干细胞放置与加入不含丙酮，不含酚红，不含二甲基亚砜制剂的细胞培养基细胞培养基(无菌蒸馏水1000ml，60％低糖dmem，40％mcdb201为基础培养源，然后添加(按体积计算)1％～3％胎牛血清、维生素b1(单独灭菌)1μg/ml，维生素b6(单独灭菌)2mg/ml，5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、10～25μg/l血小板生长因子、5～15μg/l内皮细胞生长因子，5～15μg/l表皮细胞生长因子，0.25～0.5g/l胎盘白蛋白，nacl(氯化钠)0.5g。完全培养基和含双抗的pbs缓冲液体积比为1∶3～5。总ph值缓冲至7.2土0.2可由碳酸氢钠或磷酸二氢钠调节。)中的新容器内。此时采用酶溶细胞破壁法，在细胞培养基中加入溶壁酶，所需浓度为1
‑
2％(w/v)，酶解温度为25
‑
35℃，酶解时间为1
‑
2小时。用倒置显微镜观察细胞破碎程度，满意后所制得液体为间充质干细胞的组织成分液。
15.第二步，向细胞培养工厂中继续加入蛋白培养基p1和含双抗的pbs缓冲液继续进行培养，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内。在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀。然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用无菌蒸馏水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗。将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞的组织成分的蛋白加强培养液。
16.第三步，纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质的溶液。
17.以上三步获得的均为间充质干细胞的组织成分。
18.第四步，间充质干细胞的干细胞分泌因子液获取步骤：取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的a液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基p1(p1：无菌蒸馏水1000ml，甘氨酸0.5g，天冬酰胺0.5g，天冬酰胺0.5g，丝氨酸0.5g，苏氨酸0.5g，半胱氨酸0.5g，na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)0.5g，nh4cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素b1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的pbs缓冲液，继续进行培养。通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内。在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀。然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗。将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞分泌素。
19.第五步，取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的a液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基p2(p2：无菌蒸馏水1000ml，胰蛋白胨5.0g,na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)0.5g，nh4cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素b1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的pbs缓冲液，继续进行培养。通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内。在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀。然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗。将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体也是间充质干细胞分泌素。
20.第六步，纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，经再次灭菌处理，获得物为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质，所制得液体也是间充质干细胞分泌素。
21.进一步地，所述金银花干细胞以及提取内容物的制备如下：
22.第一步，取金银花未开花花苞，以及茎叶连接处，活性最强。冲洗去除周围的土，从母株上切下。立即避光、避热、在20℃清洗，医用碘伏浸泡0.5min，立即用无菌蒸馏水清洗干
净。5～20％的nahco3浸泡3min(7≦ph设定值≦11，10≦最佳ph值≦11)。无菌镊子取出金银花根。无菌滤纸吸干，4℃保存备用。全过程避光、避热。
23.第二步，在无菌条件下，在工作台将金银花花苞、茎叶切成厚度0.5～2mm的薄片，无菌50％葡萄糖注射液高渗处理，使金银花内正常的分化细胞脱水坏死。仅金银花的细胞形成层能保留生命力。
24.第三步，从金银花形成层中分离细胞，经固体或半固体培养基培养后，获得金银花形成层来源的金银花干细胞。培养基采用标准的ms(murashige and skoog)培养基即可。加入0.5～1％的琼脂固化。利于金银花干细胞的快速生长。但是本专利不排斥由氨基酸、酰胺、嘌呤，糖类，微量元素，多种无机盐类，维生素、生长素的各种排列组合培养基。甚至也不排斥使用氨基酸缺陷型培养基。金银花干细胞形成层按每0.1～0.5g/cm2接种密度配置固体或半固体或流体培养基进行接种，培养温度为18～30℃，ph值为7.0～7.9，酸碱平衡用hcl和nahco3缓冲。培养15～25天。金银花形成层组织表现为均一生长的平铺状表现，其他组织则为不规则的聚集表现。去除不规则表现组织，将生长后的形成层组织再次重新换至新鲜的培养基中二次接种，获得物为聚团的金银花干细胞形成层。
25.第五步，将聚团的金银花干细胞形成层加入缓冲分离液，缓冲分离液配方为基础液去离子水，加入10％hcl和10％nahco3的缓冲平衡，ph在4.5～6.5。加入0.1～0.28％的β
‑
1,4
‑
葡聚糖
‑4‑
葡聚糖水解酶，0.1～0.28％的果胶酶，加入半胱氨酸0.5g/1000ml，(半胱氨酸可以拮抗葡萄糖酸内酯、重金属离子对纤维素酶的抑制。)对金银花形成层的干细胞团进行生物酶分离10小时。将金银花干细胞形成层细胞团分离，倒置显微镜观察形态为单个金银花干细胞大量出现。
26.第六步，将上述混合液在30℃恒温摇床200rpm震荡，30分钟，所得全部液体500～2000rpm/min离心20分钟，收集底层细胞，和杂质混合物，150～200目无菌滤网过滤杂质，得到单体游离的金银花干细胞。以上过程可以反复三到五次。细胞混合得到的金银花干细胞，在干细胞培养液内然后逐步传代扩增至第四代。诱导培养基为无菌去离子水1000ml，甘氨酸0.1g，天冬酰胺0.1g，天冬酰胺0.1g，苏氨酸0.1g，丝氨酸0.1g，半胱氨酸0.1g，na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)3.0g，nh4cl(氯化铵)0.5g,mgso4(硫酸镁)0.1g,cacl2(氯化钙)0.2g，feso4.7h2o(硫酸亚铁)0.03g，znso4(硫酸锌)0.01g，mnso4(硫酸锰)0.02g。
27.此外，按质量比添加2,4二氯苯氧乙酸2μg/l(强生长素)，萘乙酸2μg/l(次强生长素)，6
‑
苄基腺嘌呤200mg/l(细胞分裂素)，赤霉素250mg/l(不定胚发育素)，维生素c(单独灭菌)50μg/ml。
[0028][0029]
第七步，每三天更换培养液，培养第4代，至细胞密度为1
×
106/ml，得到高浓度金银花干细胞悬液。
[0030]
第八步，将金银花干细胞悬液送入5～200层的细胞培养工厂，进行半自动化的规模培养，快速迭代。产出的金银花干细胞，一部分液氮储存作为母本。用作化妆品原料的送入离心机，15000～20000rpm/min离心5～10分钟，即得到金银花干细胞裂解产物。
‑
80℃超低温冰箱保存待用。
[0031]
进一步地，所述乳化剂为脂肪醇聚醚、增稠剂为羟乙基纤维素。
[0032]
一种间充质干细胞分泌因子与内容物和金银花干细胞提取物组合物的其制备方法，所述上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水，100转/min搅拌均匀，通过200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存即可。
[0033]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了包含间充质干细胞分泌因子、金银花干细胞提取物、蚯蚓激酶、透明质酸的组合物。提供了高达100余种活性物质。
[0034]
1、本发明通过透明质酸良好的构架体使其保持良好的吸收状态。
[0035]
2、本发明组合物对皮肤、该组合物对皮肤、粘膜无过敏反应，无刺激与反应性皮炎。
[0036]
3、本发明组合物小分子量，是能够很有效的化妆品的组合物。
[0037]
4、本发明组合物符合现代标准、不含化学添加剂的发展趋势。
[0038]
本专利组合物操作工艺合理，适合集团化大规模生产。
具体实施方式
[0039]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0040]
一种间充质干细胞分泌因子与内容物和金银花干细胞提取物组合物，包括以下重量组分的原材料，间充质干细胞分泌因子冻干粉、金银花干细胞提取物、透明质酸、蚯蚓激酶、芳香剂、乳化剂、增稠剂；
[0041]
其中，间充质干细胞分泌因子冻干粉10
‑
25份、金银花干细胞提取物10
‑
20份、透明质酸10
‑
30份、蚯蚓激酶1
‑
8份、芳香剂0.01
‑
1份、乳化剂2
‑
10份、增稠剂0.1
‑
1份。
[0042]
所述芳香剂采用纯植物提取的萜类化合物及衍生物为主的芳香油，其中采用百
合、玫瑰、樟木叶、柑橘、柠檬、杏仁中的任意一种。
[0043]
实施例1
[0044]
原料粉的制备:按重量百分比由以下原料制成:间充质干细胞分泌因子冻干粉10份，金银花干细胞提取物10份，透明质酸15份，蚯蚓激酶2份，芳香剂0.03份，乳化剂3份、增稠剂0.5份，上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水，100转/min搅拌均匀。200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存。
[0045]
所述乳化剂为脂肪醇聚醚、增稠剂为羟乙基纤维素。
[0046]
所述芳香剂采用纯植物提取的萜类化合物及衍生物为主的芳香油，其中采用百合提取物提取物。
[0047]
所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备如下：
[0048]
第一步：间充质干细胞的组织成分液获取步骤：取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，然后将收集的间充质干细胞放置与加入不含丙酮，不含酚红，不含二甲基亚砜制剂的细胞培养基细胞培养基(无菌蒸馏水1000ml，60％低糖dmem，40％mcdb201为基础培养源，然后添加(按体积计算)1％～3％胎牛血清、维生素b1(单独灭菌)1μg/ml，维生素b6(单独灭菌)2mg/ml，5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、10～25μg/l血小板生长因子、5～15μg/l内皮细胞生长因子，5～15μg/l表皮细胞生长因子，0.25～0.5g/l胎盘白蛋白，nacl(氯化钠)0.5g。完全培养基和含双抗的pbs缓冲液体积比为1∶3～5。总ph值缓冲至7.2土0.2可由碳酸氢钠或磷酸二氢钠调节。)中的新容器内。此时采用酶溶细胞破壁法，在细胞培养基中加入溶壁酶，所需浓度为1
‑
2％(w/v)，酶解温度为25
‑
35℃，酶解时间为1
‑
2小时。用倒置显微镜观察细胞破碎程度，满意后所制得液体为间充质干细胞的组织成分液。
[0049]
第二步，向细胞培养工厂中继续加入蛋白培养基p1和含双抗的pbs缓冲液继续进行培养，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内。在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀。然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用无菌蒸馏水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗。将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞的组织成分的蛋白加强培养液。
[0050]
第三步，纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质的溶液。
[0051]
以上三步获得的均为间充质干细胞的组织成分。
[0052]
第四步，间充质干细胞的干细胞分泌因子液获取步骤：取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的a液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基p1(p1：无菌蒸馏水1000ml，甘氨酸0.5g，天冬酰胺0.5g，天冬酰胺0.5g，丝氨酸0.5g，苏氨酸0.5g，半胱氨酸0.5g，na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)0.5g，nh4cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素b1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的pbs缓冲液，继续进行培养。
通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内。在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀。然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗。将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞分泌素。
[0053]
第五步，取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的pbs缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的a液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基p2(p2：无菌蒸馏水1000ml，胰蛋白胨5.0g,na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)0.5g，nh4cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素b1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的pbs缓冲液，继续进行培养。通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内。在上清液中加入pcft聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀。然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗。将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体也是间充质干细胞分泌素。
[0054]
第六步，纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，经再次灭菌处理，获得物为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质，所制得液体也是间充质干细胞分泌素。
[0055]
金银花干细胞以及提取内容物制备如下：
[0056]
第一步，取金银花未开花花苞，以及茎叶连接处，活性最强。冲洗去除周围的土，从母株上切下。立即避光、避热、在20℃清洗，医用碘伏浸泡0.5min，立即用无菌蒸馏水清洗干净。5～20％的nahco3浸泡3min(7≦ph设定值≦11，10≦最佳ph值≦11)。无菌镊子取出金银花根。无菌滤纸吸干，4℃保存备用。全过程避光、避热。
[0057]
第二步，在无菌条件下，在工作台将金银花花苞、茎叶切成厚度0.5～2mm的薄片，无菌50％葡萄糖注射液高渗处理，使金银花内正常的分化细胞脱水坏死。仅金银花的细胞形成层能保留生命力。
[0058]
第三步，从金银花形成层中分离细胞，经固体或半固体培养基培养后，获得金银花形成层来源的金银花干细胞。培养基采用标准的ms(murashige and skoog)培养基即可。加入0.5～1％的琼脂固化。利于金银花干细胞的快速生长。但是本专利不排斥由氨基酸、酰胺、嘌呤，糖类，微量元素，多种无机盐类，维生素、生长素的各种排列组合培养基。甚至也不排斥使用氨基酸缺陷型培养基。金银花干细胞形成层按每0.1～0.5g/cm2接种密度配置固体或半固体或流体培养基进行接种，培养温度为18～30℃，ph值为7.0～7.9，酸碱平衡用hcl和nahco3缓冲。培养15～25天。金银花形成层组织表现为均一生长的平铺状表现，其他组织则为不规则的聚集表现。去除不规则表现组织，将生长后的形成层组织再次重新换至新鲜的培养基中二次接种，获得物为聚团的金银花干细胞形成层。
[0059]
第五步，将聚团的金银花干细胞形成层加入缓冲分离液，缓冲分离液配方为基础液去离子水，加入10％hcl和10％nahco3的缓冲平衡，ph在4.5～6.5。加入0.1～0.28％的β
‑
1,4
‑
葡聚糖
‑4‑
葡聚糖水解酶，0.1～0.28％的果胶酶，加入半胱氨酸0.5g/1000ml，(半胱氨
酸可以拮抗葡萄糖酸内酯、重金属离子对纤维素酶的抑制。)对金银花形成层的干细胞团进行生物酶分离10小时。将金银花干细胞形成层细胞团分离，倒置显微镜观察形态为单个金银花干细胞大量出现。
[0060]
第六步，将上述混合液在30℃恒温摇床200rpm震荡，30分钟，所得全部液体500～2000rpm/min离心20分钟，收集底层细胞，和杂质混合物，150～200目无菌滤网过滤杂质，得到单体游离的金银花干细胞。以上过程可以反复三到五次。细胞混合得到的金银花干细胞，在干细胞培养液内然后逐步传代扩增至第四代。诱导培养基为无菌去离子水1000ml，甘氨酸0.1g，天冬酰胺0.1g，天冬酰胺0.1g，苏氨酸0.1g，丝氨酸0.1g，半胱氨酸0.1g，na2hpo4(磷酸氢二钠)2.0g，kh2po4(磷酸二氢钾)3.0g，nacl(氯化钠)3.0g，nh4cl(氯化铵)0.5g,mgso4(硫酸镁)0.1g,cacl2(氯化钙)0.2g，feso4.7h2o(硫酸亚铁)0.03g，znso4(硫酸锌)0.01g，mnso4(硫酸锰)0.02g。
[0061]
此外，按质量比添加2,4二氯苯氧乙酸2μg/l(强生长素)，萘乙酸2μg/l(次强生长素)，6
‑
苄基腺嘌呤200mg/l(细胞分裂素)，赤霉素250mg/l(不定胚发育素)，维生素c(单独灭菌)50μg/ml。
[0062][0063]
第七步，每三天更换培养液，培养第4代，至细胞密度为1
×
106/ml，得到高浓度金银花干细胞悬液。
[0064]
第八步，将金银花干细胞悬液送入5～200层的细胞培养工厂，进行半自动化的规模培养，快速迭代。产出的金银花干细胞，一部分液氮储存作为母本。用作化妆品原料的送入离心机，15000～20000rpm/min离心5～10分钟，即得到金银花干细胞裂解产物。
‑
80℃超低温冰箱保存待用。
[0065]
实施例2
[0066]
原料粉的制备:按重量百分比由以下原料制成:间充质干细胞分泌因子冻干粉15份，金银花干细胞提取物15份，透明质酸25份，蚯蚓激酶5份，芳香剂0.05份，乳化剂5份、增稠剂0.5份，上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水。100转/min搅拌均匀。200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存。
[0067]
所述芳香剂采用纯植物提取的萜类化合物及衍生物为主的芳香油，其中采用百合提取物。
[0068]
所述乳化剂为脂肪醇聚醚、增稠剂为羟乙基纤维素，所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备与实施例1相同，所述金银花干细胞以及提取内容物的制备与实施例1相同。
[0069]
实施例3
[0070]
原料粉的制备:按重量百分比由以下原料制成:间充质干细胞分泌因子冻干粉15份，金银花干细胞提取物12份，透明质酸25份，蚯蚓激酶2份(蚯蚓激酶每日用量不超过400mg)，芳香剂0.05份、乳化剂5份、增稠剂0.5份，上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水。100转/min搅拌均匀。200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存。
[0071]
所述乳化剂为脂肪醇聚醚、增稠剂为羟乙基纤维素，所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备与实施例1相同，所述金银花干细胞以及提取内容物的制备与实施例1相同。
[0072]
所述芳香剂采用纯植物提取的萜类化合物及衍生物为主的芳香油，其中采用樟木叶提取物。
[0073]
实施例4
[0074]
原料粉的制备:按重量百分比由以下原料制成:间充质干细胞分泌因子冻干粉10份，金银花干细胞提取物15份，透明质酸20份，蚯蚓激酶4份，芳香剂0.05份，乳化剂5份、增稠剂0.5份，上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水。100转/min搅拌均匀。200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存。
[0075]
所述乳化剂为脂肪醇聚醚、增稠剂为羟乙基纤维素，所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备与实施例1相同，所述金银花干细胞以及提取内容物的制备与实施例1相同。
[0076]
所述芳香剂采用纯植物提取的萜类化合物及衍生物为主的芳香油，其中采用柑橘提取物。
[0077]
实施例5
[0078]
原料粉的制备:按重量百分比由以下原料制成:间充质干细胞分泌因子冻干粉12份，金银花干细胞提取物12份，透明质酸18份，蚯蚓激酶5份，芳香剂0.04份，乳化剂脂肪醇聚醚5份、增稠剂羟乙基纤维素0.5份，上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水。100转/min搅拌均匀。200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存。
[0079]
所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备与实施例1相同，所述金银花干细胞以及提取内容物的制备与实施例1相同。
[0080]
所述芳香剂采用纯植物提取的萜类化合物及衍生物为主的芳香油，其中采用柠檬提取物。
[0081]
实施例6
[0082]
原料粉的制备:按重量百分比由以下原料制成:间充质干细胞分泌因子冻干粉15份，金银花干细胞提取物14份，透明质酸15份，蚯蚓激酶5份，芳香剂0.05份，乳化剂3份、增稠剂0.5份，上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水。100转/min搅拌均匀。200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存。
[0083]
所述乳化剂为脂肪醇聚醚、增稠剂为羟乙基纤维素，所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备与实施例1相同，所述金银花干细胞以及提取内容物的制备与实施例1相同。
[0084]
所述芳香剂采用纯植物提取的萜类化合物及衍生物为主的芳香油，其中采用杏仁提取物。
[0085]
实施例7
[0086]
原料粉的制备:按重量百分比由以下原料制成:间充质干细胞分泌因子冻干粉10份，金银花干细胞提取物12份，透明质酸20份，蚯蚓激酶5份，芳香剂0.05份，增稠剂0.5份，上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水。100转/min搅拌均匀。200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存。
[0087]
所述增稠剂为羟乙基纤维素所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备与实施例1相同，所述金银花干细胞以及提取内容物的制备与实施例1相同。
[0088]
所述芳香剂采用纯植物提取的萜类化合物及衍生物为主的芳香油，其中采用樟木叶提取物。
[0089]
实施例8
[0090]
原料粉的制备:按重量百分比由以下原料制成:间充质干细胞分泌因子冻干粉10份，金银花干细胞提取物10份，透明质酸25份，蚯蚓激酶5份，芳香剂0.05份，上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水。100转/min搅拌均匀。200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存。
[0091]
所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备与实施例1相同，所述金银花干细胞以及提取内容物的制备与实施例1相同。
[0092]
所述芳香剂采用纯植物提取的萜类化合物及衍生物为主的芳香油，其中采用杏仁提取物。
[0093]
以上实施例1
‑
实施例8中所述的乳化剂、增稠剂根据实际需要选择性添加。本发明中透明质酸是一种酸性粘多糖，研究发现透明质酸是目前发现的自然界中具备保湿性最好的物质，被称为最理想的天然保湿因子。仅仅2％的纯透明质酸在水溶液中能牢固地保持98％水分。透明质酸在保湿同时又是良好的透皮吸收促进剂。皮肤也含有大量的透明质酸。人类皮肤老化和成熟过程也随着透明质酸的新陈代谢和含量而变化，它可以改善人类皮肤的营养代谢，使皮肤光滑、柔嫩、增加弹性、去皱、防止衰老。
[0094]
金银花，被子植物门，双子叶植物纲，菊亚纲，川续断目，忍冬科，忍冬属，植物忍冬及同属植物。中医药用金银花为干燥的花蕾以及带初开的花。金银花自古以来，它的药用价值在中医领域非常广泛。最主要功效为清热解毒。金银花性寒，味甘，入心、肺、胃经，主治温病发热、胀满下疾、热毒痈疡等症。《神农本草经》最早记载：“金银花性寒味甘，具有凉血化淤、清热解毒之功效，主治瘟病初起、疮疡疔毒、外感风热、红肿热痛”。金银花最主要成分含有绿原酸(chlorogenic acid)、木犀草素苷(luteolin)等具备药理的活性成分。金银花绿原酸类化合物主要包括绿原酸和异绿原酸，其中异绿元酸为金银花中提取的一种混合物。金银花提取物中有机酸的含量，随着金银花本身的品种、产地、收获时间、部位的不同而不同。金银花黄酮类化合物有效成分为木犀草素，其次为忍冬苷。黄酮类化合物有抗氧化、抗自由基的作用；对人体的外周血管系统以及心血管系统有保护作用，改善血管的通透性。金银花挥发油成分复杂，主要含有亚油酸、棕榈酸、十四酸甲酯、二十九烷等。
[0095]
蚯蚓激酶(lumbrukinase)，是从特种蚯蚓(环毛蚯蚓)中提取的一组，具有磷酸化作用机制，从高能供体分子(如三磷酸腺苷)转移磷酸基团，到特定底物靶分子的酶。蚯蚓激酶是蛋白水解酶(酸性蛋白质)，分子量为1.6万～4.5万d。在医学上，是纤溶酶的复合物，蚯蚓激酶可缩短优蛋白溶解时间，降低纤维蛋白原含量，血浆黏黏度t
‑
pa活性增加及降低全
血黏度，纤维蛋白降解产物增加作用。易吸收，用静脉注射125i放射性标记的蚯蚓激酶后，半衰期为1.5～2.5h。体内血药浓度6h后接近于零，瞬时尿排出测定18h后趋于零，即使大剂量在体内停留时间也不会超过24h。表明长期服用不会在体内蓄积。蚯蚓激酶作用可以开放性的修复血管的受损内皮细胞，增加血管的弹性，改善血管的供氧功能，有效降低血液粘度。
[0096]
实施例1
‑
实施例8中的金银花干细胞提取物和间充质干细胞分泌因子组合物，其中包含间充质干细胞分泌因子与内容物、金银花干细胞提取物、蚯蚓激酶、透明质酸，植物干细胞提取物是被反复研究验证的，对人体的皮肤细胞以及皮下组织有效的活性物质，具有抗衰、抗皱、美白等等的功效。
[0097]
吸湿实验：保持环境温度30℃，在干燥器底部分别放入氯化钙和硫酸铵的饱和溶液，确保干燥器的相对湿度分别为70％。称取样品各1.0g(冷冻真空干燥至恒重)至称量器中，然后分别置于干燥器内，放置8，10，24，36，48h后称量各样品质量，由下式计算样品吸湿率：吸湿率＝(m1/m2)x100％式中，m1为样品放置预定时间后质量，m2为样品放置前质量，
[0098] 8h10h24h36h48h实施例1115.1120.6125.1127.2129.2实施例2125.1127.1132.4135.1137.3实施例3122.6123.2126.1130.2133.1实施例4120.6122.5127.5128.9129.9实施例5121.3123.4127.7129.2131.2实施例6123.2124.3127.2128.7130.2实施例7121.6122.7126.2128.4130.1实施例8122.3124.1127.3129.3131.1
[0099]
原料粉的制备:按重量百分比由以下原料制成:间充质干细胞分泌因子冻干粉，金银花干细胞提取物(主要为绿原酸(chlorogenic acid)和异绿原酸、木犀草素苷(luteolin)、忍冬苷、亚油酸、棕榈酸、十四酸甲酯、二十九烷等。)，透明质酸，蚯蚓激酶(蚯蚓激酶每日用量不超过400mg)，芳香剂，如需乳化，加乳化剂(如脂肪醇聚醚)、如需增稠，加增稠剂(如：羟乙基纤维素)，上述原料粉制备好后，按照每克5ml的比例添加去离子水。100转/min搅拌均匀。200nm孔径滤膜过滤，脱水，装瓶，4℃低温保存。
[0100]
以上制备产物，可以用于多种化妆品(water
‑
based cosmetic)，例如包括精华液，爽肤水，清面乳，面霜，喷雾，面膜，保湿霜，防晒霜，沐浴液，收敛剂，剃须用品，洗发素，护发素，粉底液，粉底霜和其他护肤品。应用于人的皮肤，头部、面部、颈部、胸部、背部、腹部、会阴部、四肢。
[0101]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0102]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当
将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。