具有G-四链体结构用作级联反应器的抗菌水凝胶及其制备方法及应用

本发明属于生物医药材料领域，涉及一种具有g-四链体结构的水凝胶作为级联反应器产生羟基自由基，用于耐药金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的杀灭。

背景技术：

细菌感染是人类健康长期以来的威胁。据估计，由细菌感染造成的死亡人数将每年增加1000万，到2050年造成的损失将超过650万亿元。细菌感染难以治愈主要有三个方面的原因，一是细菌可以通过形成生物膜将其自身包覆于生物膜中，以抵御抗生素及免疫细胞的攻击；二是耐药菌的出现导致现有抗生素对其治疗失效，且抗生素的滥用使得耐药菌发展十分迅速；三是新抗生素的研发十分缓慢。在细菌感染中，伤口感染是最常见的一类与每个人相关的细菌感染，包括手术后创口细菌感染、糖尿病足等。

水凝胶因其可以提供伤口愈合的湿润环境以及高的载药量，可作为敷料用来治疗伤口感染，具有巨大的应用价值。水凝胶抗菌性能的构筑一般通过物理负载或化学交联具有抗菌性能的材料，包括抗生素、抗菌肽，及一些有抗菌性能的材料，如含有季铵盐的聚合物、纳米银等，其中，负载抗生素是现有抗菌凝胶常用的策略。而抗生素针对耐药细菌效果有限。优质的抗菌水凝胶要求原料便宜，制备简单，有良好的生物相容性。因此，开发具有优良性能的抗菌水凝胶具有重大意义，尤其是可以杀灭耐药菌的凝胶。

技术实现要素：

本发明的目的是设计一种具有抗菌性能的水凝胶用于治疗细菌感染，采用非抗生素的方式杀灭细菌，实现对耐药性细菌的杀灭，凝胶采用一锅法制备，过程简单，原料便宜易得。

本发明的技术方案：

一种具有g-四链体结构用作级联反应器的抗菌水凝胶，采用g-四链体结构作为凝胶的交联主体，鸟嘌呤核苷在钾离子的配位作用下形成g-四分体平面结构，通过硼酯键将g-四分体连接形成g-四链体，g-四链体交联形成网状结构，将水分子固定于网状结构中形成水凝胶。血红素可以与凝胶中的g-四分体通过π-π堆积形成过氧化酶类似物，能够将h2o2转化成为羟基自由基。利用这一性质，我们将葡萄糖氧化酶与血红素负载在g-四链体水凝胶中。葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖转化为葡萄糖酸以及h2o2，而血红素与g-四分体可以将h2o2转化为有强杀菌能力的羟基自由基。因此形成的g-四链体凝胶能够作为级联反应器，将葡萄糖转化为有强杀菌能力的羟基自由基。羟基自由基可以使细胞膜发生变形，具有广谱杀菌能力，对耐药的细菌也有效，且不会引发细菌产生耐药性。

一种所述具有g-四链体结构用作级联反应器的抗菌水凝胶的制备方法，步骤如下：

1)室温下将鸟嘌呤核苷，氢氧化钾，硼酸加入水中混合得到悬浊液，上述各组分在水中浓度依次为30mmol/l，15mmol/l和15mmol/l；

2)将1)所得悬浊液加热至沸腾(约100℃)，使悬浊液变成澄清液；

3)将血红素加入到2)所述沸腾的溶液中，血红素在溶液中的浓度为0.6mmol/l；

4)待3)所得溶液静置冷却至约40℃，将葡萄糖氧化酶加入其中，葡萄糖氧化酶在溶液中的浓度为0.125g/l；

5)将上述溶液静置，待冷却至室温，得到半透明的具有g-四链体结构的水凝胶。

本发明提供的具有g-四链体结构用作级联反应器的抗菌水凝胶可用于杀灭具有多重耐药性的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌。

本发明的优点是：

该方法利用便宜易得的鸟嘌呤核苷作为原料，一锅法通过动态共价组装得到抗菌水凝胶。本发明有如下的优势：1)原料简单易得；2)合成步骤简单，易批量生产；3)有广谱杀菌性，可以杀灭多重耐药细菌。

附图说明

图1为具有g-四链体结构用作级联反应器的抗菌水凝胶的形成示意图。

图2为制备的抗菌水凝胶的扫描电镜(sem)照片。

图3为制备的抗菌水凝胶对具有多重抗药性的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的杀灭效果图。

图4为制备的抗菌水凝胶对具有多重抗药性的革兰氏阴性细菌铜绿假单胞杆菌的杀灭效果图。

具体实施方式

实施例1：具有g-四链体结构用作级联反应器的抗菌水凝胶的制备，及抗菌性能表征，

(一)有g-四链体结构用作级联反应器的抗菌水凝胶的制备，步骤如下：

1)室温下称取85mg鸟嘌呤核苷，8.4mg氢氧化钾和9.3mg硼酸，加入10ml水，混合得到悬浊液；

2)将1)所得悬浊液加热至沸腾(约100℃)，使悬浊液变成澄清液；

3)称取3.6mg血红素加入到2)所述沸腾的溶液中混合均匀；

4)待3)所得溶液静置冷却至约40℃，称取1.25mg葡萄糖氧化酶加入其中混合均匀；

5)将上述溶液静置，待冷却至室温，得到半透明的具有g-四链体结构的水凝胶。

(二)参见附图2，给出了水凝胶sem测试结果：

1)将所述形成水凝胶在-20℃冰箱中冷冻24h，

2)放置冻干机中24h，得到白色固体粉末，进行sem测试，即可得到图2所示的sem照片，图中显示出凝胶交联的结构。

(三)参见附图3，给出了水凝胶对具有多重耐药性的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的杀灭效果：

1)参照水凝胶制备方法，制备200μl凝胶并将其均匀平铺于24孔板的底部；

2)培养得到浓度为10⁷cfuml^-1的金黄色葡萄球菌溶液，细菌溶解于胰蛋白胨大豆肉汤中(含有2.5mg/l的葡萄糖)，细菌来源于atcc，名称是staphylococcusaureusxen36，对包括卡那霉素在内的多重抗生素显示出耐药性；

3)实验组取1ml上述金黄色葡萄球菌溶液至铺有水凝胶的24孔板内，对照组则取1ml金黄色葡萄球菌溶液至200μlph为7.4的磷酸盐缓冲液中，37℃下培养；

4)每间隔1h取10μl溶液，用ph为7.4的磷酸盐缓冲液梯度稀释，用琼脂板计数法测定溶液中的活菌数量；

5)数据每组重复三次，取平均值；

(四)参见附图4，给出了水凝胶对具有多重耐药性的革兰氏阴性细菌铜绿假单胞杆菌的杀灭效果：

1)参照水凝胶制备方法，制备200μl凝胶并将其均匀平铺于24孔板的底部；

2)培养得到浓度为10⁷cfuml^-1的铜绿假单胞杆菌溶液，细菌溶解于胰蛋白胨大豆肉汤中(含有2.5mg/l的葡萄糖)，细菌来源于atcc，名称是pseudomonasaeruginosaxen41，对包括四环素在内的多重抗生素显示出耐药性；

3)实验组取1ml上述铜绿假单胞杆菌溶液至铺有水凝胶的24孔板内，对照组则取1ml铜绿假单胞杆菌溶液至200μlph为7.4的磷酸盐缓冲液中，37℃下培养；

4)每间隔1h取10μl溶液，用ph为7.4的磷酸盐缓冲液梯度稀释，用琼脂板计数法测定溶液中的活菌数量；

5)数据每组重复三次，取平均值；

本发明设计具有g-四链体结构的水凝胶作为级联反应器，通过两步级联反应将葡萄糖转化为有强杀菌能力的羟基自由基，其制备及杀菌机理参见附图1。水凝胶内有交联结构，参见附图2。本发明形成的水凝胶能够杀灭具有多重耐药性的金黄色葡萄球菌和绿假单胞杆菌，参见附图3和附图4。