千层纸素在制备治疗银屑病的药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及千层纸素在制备治疗银屑病的药物中的应用。


背景技术：

2.银屑病是一种常见的由多种细胞参与的慢性炎症性疾病，复发率高，无法完全治愈。其病理表现主要为表皮角化过度及角化不全、棘层细胞肥厚、免疫细胞浸润、炎症因子水平升高及血管扩张等。目前，全世界患病率约为1％
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2％，由于其发病机制尚未完全阐明，造成临床治疗较为困难，只能对症治疗，采用相关治疗药物以改善患者症状、提高患者生活质量。
3.银屑病根据病情轻重可以分为轻、中、重度，轻度银屑病一般采用局部用药，包括皮质类固醇、甲氨蝶呤、环孢霉素、维生素d3类似物。而对于面积较大、无法局部给药的银屑病患者则采用nb
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uvb(narrowband ultraviolet b)或者puva(补骨脂素
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紫外线a)光疗法。但puva治疗通过uva将补骨脂与dna交联，具有高度诱变性，长期使用会诱导皮肤癌如黑色素瘤的发生。在更严重的病例中，除基础治疗外还需加入全身性药物，传统的口服药物，如维甲酸类、mtx或环孢菌素，这些小分子药物疗效好、使用方便且价格低廉，但其对肝脏、肾脏和骨髓的高毒性及致畸性限制了其在临床治疗中的应用。
4.目前对于银屑病的发病机制的一种解释是免疫系统细胞(如t细胞、巨噬细胞、dc细胞等)与皮肤角质形成细胞相互作用的结果。而其中，il
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23/th17信号轴对银屑病的发生发展起着关键作用。因此，针对tnfα、il
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17等的抗体类生物制剂目前被批准用于临床治疗银屑病。虽然，生物制剂治疗银屑病的疗效显著，但是由于其价格昂贵且存在潜在未知的风险而限制了其在临床上的应用。因而寻找有效且毒副作用小的小分子化合物，仍然是治疗银屑病的重要方向。
5.千层纸素(oroxylina，oa)是黄芩的有效成分之一，目前已被证实具有广泛的药理作用，包括抗癌、抗炎、神经保护、抗凝血等。近年来多项研究显示，多种黄酮类中药提取物可对组织器官、免疫细胞及免疫分子进行调节，同时千层纸素也被报道对于肠炎、关节炎、吸烟诱导的肺部炎症及哮喘具有一定程度的治疗作用，提示了千层纸素可能具有相对广谱且安全的抗炎作用。
6.目前，还未有千层纸素用于制备银屑病治疗药物的报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供千层纸素的一种新的医药用途。
8.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.千层纸素在制备治疗银屑病的药物中的应用。
10.所述药物为口服给药，药物对小鼠的有效剂量为20
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80mg/kg，优选80mg/kg。阳性药为环孢菌素a(csa)。
11.进一步地，所述千层纸素在细胞水平上的剂量范围为2
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50μm，优选10μm。
12.发明人通过对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型进行千层纸素给药后的研究得知，千层纸素可抑制角质形成细胞的增殖及抑制免疫细胞的浸润，从而实现对咪喹莫特诱导的银屑病的治疗。
13.千层纸素作为治疗银屑病的药物能够明显缓解咪喹莫特诱导的银屑病样皮损局部的鳞屑形成、皮肤增厚，改善银屑病病理评分，抑制血清中il
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23、tnfα和il
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1β等多个促炎因子水平的作用，进而实现对银屑病的治疗。
14.有益效果：本发明首次发现千层纸素的抗银屑病的作用，由于其低毒副作用，因而可作为抗银屑病的潜在药物进行后续开发。
附图说明
15.图1为千层纸素对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的体重及病理评分的影响。(a)造模小鼠图片；(b)小鼠临床评分；(c)小鼠体重变化。
16.图2为千层纸素对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮肤组织的he。(a)皮肤组织he染色；(b)表皮厚度统计。
17.图3为千层纸素对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮肤组织小鼠增殖标记物ki67染色及炎症因子的检测(a)皮肤组织ki67免疫组化染色；(b)ki67阳性面积统计；(c)皮肤组织蛋白提取物中il
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1β、il
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17a、tnf
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α含量。
18.图4为千层纸素对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮肤组织中的免疫细胞浸润情况荧光染色。
具体实施方式
19.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
20.实施例1
21.(1)咪喹莫特(imq)诱导的银屑病小鼠模型
22.以0.1ml/10g 3.5％水合氯醛麻醉小鼠(c57bl/6小鼠，18
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22g，6
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8周)，剃除小鼠背部毛发，使小鼠背部暴露约2cm
×
3cm的皮肤，将imq软膏(62.5mg)连续涂抹于小鼠背部皮肤6d诱导银屑病，对照组给予同等剂量的凡士林软膏(sham)。
23.在造模周期内，灌胃给予阳性药环孢菌素a(csa，30mg/kg/day)或各剂量oa(20、40、80mg/kg/day)。在造模过程中，每天监测小鼠生理指标(体重、皮肤变化)。临床症状采用pasi评分标准，对红斑、鳞屑2等指标进行评价，以0
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4分进行记分，将3者积分相加得到总积分。pasi评分标准如下：0，无症状；1，轻度；2，中度；3，重度；4，极重度。
24.造模第7天处死小鼠，取下小鼠的背部皮肤、脾脏和腹腔巨噬细胞，眼球取血，离心得血清，elisa法检测血清中il
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1β、tnfα等炎症因子。
25.结果如图1所示，千层纸素(oa)能明显缓解咪喹莫特诱导的银屑病样皮损局部的鳞屑形成，改善病理评分，缓解咪喹莫特诱导的小鼠体重的减轻，缓解咪喹莫特诱导的炎症
症状。
26.(2)苏木素
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伊红(he)、免疫组化(ihc)检测
27.组织按常规方法预处理，石蜡包被、切片。石蜡切片脱蜡后进行常规h.e.染色，或抗原修复后，固定、通透、血清封闭，一抗(ki67抗体)孵育过夜，漂洗，生物素标记的二抗常温孵育0.5小时，加入二抗孵育0.5小时，abc复合物常温孵育0.5小时，dab底物常温孵育，镜下控制孵育时间，水中终止反应，苏木素反染，脱水封片(免疫组化法)。
28.结果如图2及图3中(a)、(b)显示，千层纸素能明显降低表皮厚度以及角质细胞ki67阳性细胞染色，其作用与阳性药csa相当。
29.(3)酶联免疫吸附(elisa)法检测炎症因子含量
30.收集样品蛋白，根据elisa试剂盒说明书，检测细胞因子il
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1β、il
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17a和tnf
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α含量。大致流程如下：样品孔中加入100μl样品，50μl/well加入稀释后的biotinylated antibody，混匀后盖上封板膜，37℃温育90min。洗板，100μl/well加入稀释后的streptavidin
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hrp。37℃温育30min，100μl/well加入tmb，37℃避光孵育5
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30min，根据孔内蓝色深浅来判定终止反应。100μl/well加入stop solution终止反应，10min之内检测450nm处吸光值。
31.结果如图3中(c)显示，能明显降低血清中il
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17a及tnf
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α的含量。
32.(4)免疫荧光(if)检测皮肤组织中炎症细胞浸润
33.石蜡切片脱蜡后进行常规免疫荧光染色，切片复苏后封闭1h后，再孵育一抗(1:200)过夜，二抗(1:500)孵育1h。pbs漂洗后，滴加抗荧光猝灭剂，封片拍照分析。
34.结果如图4显示，千层纸素能明显降低t细胞及巨噬细胞的浸润，从而提示千层纸素可以通过抑制免疫细胞的浸润来抑制银屑病的发生发展。