怀特酮在制备肺癌治疗药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及天然化合物怀特酮在制备肺癌治疗药物中的应用。


背景技术：

2.肺癌是全世界死亡率最高的癌症，其中约有80
‑
85%的肺癌为非小细胞肺癌（nsclc），严重威胁人们的生命健康。近年来，随着现代医学的不断发展，靶向治疗由于其对癌细胞的选择性、高效、副作用小等特点，现已成为肿瘤临床治疗的重要手段。表皮生长因子（egfr）是erbb（her）受体酪氨酸激酶家族的一员，在细胞增殖、分化、代谢和凋亡等众多正常生理过程中发挥着关键作用。然而，有研究表明，约有50%的nsclc患者伴有egfr表达异常，egfr在肿瘤细胞的增殖、存活、粘附、迁移和分化中起到十分重要的作用。因此，靶向egfr为对抗肺癌提供了一种有效策略，egfr现已成为治疗肺癌的一个公认的关键靶点。
3.目前，以吉非替尼（gefitinib）为代表的egfr酪氨酸激酶抑制剂（egfr
‑
tkis）开创了精准靶向治疗的先锋。egfr
‑
tkis能够有效地治疗包括第19号外显子缺失型突变（del19突变）和第21号外显子l858r点突变（l858r突变）在内的egfr激活突变肺癌患者。然而在治疗一段时间之后，由于t790m突变的发生，降低了这些抑制剂的效力，从而导致患者产生耐药性。由于能够克服t790m突变所带来的atp亲和力增强，三代egfr
‑
tkis对于这些患者通常是一种有效的选择。其中，奥希替尼（osimertinib）作为三代egfr
‑
tkis已通过美国食品和药品管理局（fda）批准上市。但是临床发现，大多数患者在经过治疗之后会由于c797s、l792h等突变的发生进而对osimertinib产生耐药，以致无药可用。由此可见，耐药的速度永远超过开发药物的速度。因此针对t790m突变肺癌患者，亟需研究开发更多新的治疗策略。
4.近些年来，植物中的天然活性成分越来越受到人们的关注。植物来源的天然小分子化合物种类十分丰富，包括生物碱、酚类化合物、黄酮类化合物、萜类化合物、固醇类化合物等等。这些植物中的天然活性成分不仅在植物的生长、抗逆中发挥着重要作用，而且对人体健康亦会产生重要影响。大量研究表明，植物中某些天然小分子化合物能够作用于肿瘤细胞凋亡和细胞周期通路，抑制肿瘤细胞生长，具有良好的抗肿瘤效果，这对于肿瘤的治疗具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明提供了一种天然化合物怀特酮（wighteone）在制备肺癌治疗药物中的应用。研究表明，wighteone通过靶向egfr进而抑制egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌的活性，实现了抗肿瘤的目的，为egfr
‑
l858r/t790m突变型的肿瘤患者提供了一种新的有效治疗策略。
6.本发明所提供的天然化合物怀特酮（wighteone），其结构式如下：
。
7.上述怀特酮（wighteone）在制备肺癌治疗药物中的应用。
8.作为优选，肺癌为egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌。
9.作为优选，肺癌治疗药物是指靶向结合egfr抑制表达egfr
‑
l858r/t790m突变型的肿瘤细胞活性和增殖能力，或诱导肿瘤细胞凋亡的药物本发明的有益效果：目前，针对表达egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌的治疗药物较为单一，一旦在治疗期间产生新的突变致使耐药，将导致患者无药可医。本发明通过相关研究，提供了一种天然化合物怀特酮（wighteone），该化合物通过特异性地靶向结合egfr，可以显著抑制表达egfr
‑
l858r/t790m突变型的肿瘤细胞的细胞活性和增殖能力，引起细胞周期重排，诱导细胞凋亡发生。本发明提供的怀特酮抑制效果明显，作用靶点明确，为egfr
‑
l858r/t790m突变型肿瘤的治疗提供了一种新的有效药物。
附图说明
10.图1为天然化合物wighteone作用于肺癌细胞nci
‑
h1975后对其细胞活性的影响。
11.图2为天然化合物wighteone的作用于肺癌细胞nci
‑
h1975后对其增殖能力的影响。
12.图3为天然化合物wighteone作用于肺癌细胞nci
‑
h1975后对其egfr信号通路相关蛋白的影响图4为天然化合物wighteone作用于肺癌细胞nci
‑
h1975后流式检测细胞周期结果图。
13.图5为天然化合物wighteone作用于肺癌细胞nci
‑
h1975后对其细胞周期相关蛋白的影响。
14.图6为天然化合物wighteone作用于肺癌细胞nci
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h1975后流式检测细胞凋亡结果图。
15.图7为天然化合物wighteone作用于肺癌细胞nci
‑
h1975后对其细胞凋亡相关蛋白的影响。
16.图8为天然化合物wighteone与egfr
‑
l858r/t790m突变体蛋白的分子对接模拟示意图。
具体实施方式
17.为了方便技术人员理解的更加清楚，下面将结合附图与实施方式对本发明进行详细的说明，这些实例仅用于说明，但不限于本发明。
18.本发明以表达egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞nci
‑
h1975作为研究对象，主要针对天然化合物wighteone作用于egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞的增殖抑制效果进行了阐述，同时明确了产生该效果的作用机制。
19.化合物怀特酮从云南西力生物技术股份有限公司购得，纯度：99.0%，cas no.：51225
‑
30
‑
0。
20.实施例1：天然化合物wighteone对egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞活性的影响取处于对数生长期的nci
‑
h1975细胞，以2
×
104/孔的细胞接种量接种于96孔板后，在5%co2、37℃的细胞孵育箱中培养16h，保证细胞能够稳固贴在96孔板底部。小心吸走上层完全培养基，再用排枪缓慢加入200μl pbs到96孔板中，清洗细胞，小心吸走pbs后开始加药处理。将天然化合物wighteone配置成10mm的储液，用无血清rpmi1640培养基进行稀释，浓度梯度设置为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μm。每个处理设置4次重复，每孔加入200μl配置好的化合物稀释液。将加入处理药物的96孔板置于37℃孵育箱中，处理48小时后，取出96孔板并在每孔加入事先配置好的5mg/ml mtt溶液20μl，用锡箔纸包住避光放入37℃孵育箱中染色4h，染色结束后取出96孔板，小心吸去孔内培养液后，在每孔中加入150μl dmso，96孔板放置于摇床上200rpm振摇10min，以充分溶解板底部的紫色结晶（甲瓚）。然后，使用酶标仪于492nm处检测96孔板各孔吸光值。按照以下公式计算细胞活力：细胞活力（cell viability，%）=（od（样品）/od（对照））
×
100%得出的数据利用graphpad prism v5.0软件做图并计算ic
50
值。结果如图1所示，天然化合物wighteone能够抑制egfr
‑
l858r/t790m突变型肿瘤细胞nci
‑
h1975的细胞活性，呈浓度依赖性，ic
50
值为5.70μm。
21.实施例2：天然化合物wighteone对egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞增殖能力的影响取对数生长的nci
‑
h1975细胞。胰蛋白酶消化后，细胞计数仪进行计数。将细胞混匀以保证各孔之间的误差最小，之后以6
×
102个/孔的细胞接板量接种于6孔板中，并将其置于37℃培养箱中孵育16h，以保证细胞稳定贴在6孔板底部。对细胞进行0、2.5、5、10μm浓度梯度的药物处理，处理时间为24h。处理结束后细胞继续培养14天，每隔1天更换新的培养基，并观察细胞克隆及集落形成情况。待6孔板中形成明显细胞集落后，吸走细胞培养基，并于每孔中加入1ml甲醇固定10min。固定完成后吸走甲醇，在6孔板中加入1ml 0.005%的结晶紫染色15min。用up水洗去多余染料之后，在每孔中加入1ml 10%冰醋酸，轻轻摇晃直至结晶紫全部溶解，使用酶标仪检测560nm下的吸光度值。根据所得吸光值进行统计分析。
22.结果如图2所示，天然化合物wighteone能够显著影响nci
‑
h1975的增殖能力，呈浓度依赖性。
23.实施例3：天然化合物wighteone抑制egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞egfr信号通路相关蛋白的表达取对数生长的细胞接种到60mm培养皿中，接种量为2
×
106个/皿。将培养皿置于37℃孵育箱中培养16h左右。取出培养皿，用预热的pbs洗一遍，20ng/ml egf预处理5分钟后，对细胞进行相应浓度的药物处理16h（wighteone：0、2.5、5、10μm），并设置好对照。处理结束后将培养皿从孵箱中取出，吸走培养皿中的培养基并加入适量通用型蛋白裂解液，使裂解液充分与细胞接触并将培养皿置于冰盒上30min。裂解结束后，将培养皿底部的细胞小心刮下并转移至已标记好的1.5ml离心管中，于4℃下15000g离心10min后，将上清液小心吸出并移至新标记好的1.5ml离心管中。采用bca蛋白定量法对蛋白样品进行定量分析，上样量为60μg/孔，95℃高温10min使蛋白变性后进行sds
‑
page，通过电场强度将不同分子量的蛋白
质分开，随后将分离的蛋白质转移到pvdf膜上，经5%脱脂奶粉封闭后，使用相应的第一抗体孵育过夜。回收第一抗体后，用配置好的1
×
tbst冲洗pvdf膜3次，每次5min，然后在与hrp标记的第二抗体室温结合1小时，再次使用1
×
tbst冲洗pvdf膜3次，最后，经过底物显色可检测到目的蛋白的表达。
24.结果如图3所示，在egf刺激使egfr及其下游蛋白磷酸化表达量增加情况下，wighteone能够显著抑制egfr及其下游蛋白erk和akt的磷酸化。
25.实施例4：天然化合物wighteone导致egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞周期重排取处于对数生长期的nci
‑
h1975细胞，调整细胞悬液浓度后接种于6孔板中，接种量为6
×
105个/孔。待稳定16h后，对细胞进行相应浓度wighteone（0、2.5、5、10μm）的处理。处理24h后，收集各个处理组的细胞于15ml离心管中，1500rpm 3min离心后，用pbs洗一遍，再一次离心后，将pbs吸走并加入70%乙醇，置于4℃中24h固定打孔。然后用冰的pbs洗两遍细胞，随后用含1
µ
g/ml碘化丙啶（propidium iodide）和rnase的染料避光孵育30min，对细胞进行染色。染色结束后加入600μl 冰的pbs终止染色，将细胞用100目滤布过滤之后使用bd jazz流式细胞仪进行检测分析。
26.结果如图4所示，wighteone处理之后，nci
‑
h1975细胞周期发生重排，导致细胞周期在s期阻滞。
27.实施例5：天然化合物wighteone影响egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞的周期相关蛋白表达通过western blot分析不同浓度下wighteone对细胞周期相关蛋白cdk4、cdk2、cyclin d1、cyclin e和cyclin a表达的影响，方法同[030]所述。
[0028]
结果如图5所示，天然化合物wighteone能够显著抑制cdk4、cdk2、cyclin d1和cyclin a的表达，呈浓度依赖性。其中，cdk2和cyclin a能够结合形成cdk2
‑
cyclin a复合物，从而影响细胞周期从s期进入到g2期的进展。药物能够降低细胞cdk2和cyclin a的蛋白表达量进一步验证了天然化合物wighteone能够影响egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞的细胞周期，导致细胞周期s期发生阻滞。
[0029]
实施例6：天然化合物wighteone诱导egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞凋亡取处于对数生长期的nci
‑
h1975细胞调整细胞悬液浓度，随后接种于6孔板中，接种量为6
×
105个/孔。16h细胞稳定后，对nci
‑
h1975细胞进行不同浓度wighteone（0、2.5、5、10μm）的处理。处理24h后，收集各个处理组的细胞于15ml离心管中，1500rpm 3min离心后，用pbs洗两遍。使用anexin v/propidium iodide（pi）检测试剂盒（bd biosciences）对细胞进行避光染色15min，结束后加入600μl 冰的pbs终止染色，随后将细胞用100目滤布过滤到流式管中，使用bd jazz流式细胞仪对样品进行检测分析。
[0030]
结果如图6所示，天然化合物wighteone能够诱导egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞nci
‑
h1975凋亡，呈浓度依赖性。
[0031]
实施例7：天然化合物wighteone影响egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞凋亡相关蛋白的表达通过western blot分析不同浓度下wighteone对caspase3、cleaved
‑
caspase3、caspase9、cleaved
‑
caspase9、parp1、cleaved
‑
parp1、bcl
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2和bax等细胞凋亡相关蛋白表达的影响，方法同[030]所述。
[0032]
结果如图7所示，wighteone能够显著降低抗凋亡蛋白cleaved
‑
caspase3、cleaved
‑
caspase9、cleaved
‑
parp1、bcl
‑
2的表达量，并显著增加促凋亡蛋白bax的表达量，呈浓度依赖性。研究进一步验证了天然化合物wighteone能够诱导egfr
‑
l858r/t790m突变型肺癌细胞的凋亡。
[0033]
实施例8：天然化合物wighteone与egfr
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l858r/t790m突变体蛋白分子对接模拟从蛋白数据库（protein data bank）中下载获得egfr
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l858r/t790m突变体蛋白结构（pdb代码：3w2p），利用discoverystudio v4.0软件准备好配体与受体结构后，通过autodock v1.56软件针对wighteone与egfr
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l858r/t790m突变体蛋白之间进行分子对接，对接参数设置为默认值，ga运行次数设置为20次，最大运行数设置为5000000。运算完毕后，从10个不同构象中选择一个结合能最低的构象进行对接模拟，并进一步分析配体与受体间的相互作用。
[0034]
分子对接模拟结果表明，wighteone能够与egfr
‑
l858r/t790m突变体的atp结合域相结合，wighteone与gln
‑
791的羰基和met
‑
793的氨基形成两个氢键。研究表明，天然化合物wighteone可能能够直接与egfr
‑
l858r/t790m突变体相结合，详见图8。
[0035]
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。