用于制备副猪嗜血杆菌疫苗的组合菌株、八价灭活疫苗及其应用

1.本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌血清1型、2型、4型、5型、7型、12型、13型、14型八价灭活疫苗及应用。


背景技术：

2.副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis, hps）是猪副猪嗜血杆菌病的病原菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。本病在全世界范围内广泛存在。副猪嗜血杆菌可以感染各种年龄段的猪，主要发生在断奶后和保育阶段，主要感染2周龄到4月龄的猪，发病率一般在 10% ～ 15%，严重时死亡率可达 80%，该病已成为近年来断奶、保育仔猪死亡的主要原因之一，是临床混合感染的主要病原之一，给养猪业造成较大的经济损失，严重影响养猪业的健康发展。
3.副猪嗜血杆菌临床血清型较多，标准分型有15个血清型，临床上还有20%以上的不可分型菌株，该病原呈世界性分布，各地流行菌株血清型不一，各血清型之间缺乏免疫交叉保护能力。疫苗免疫接种是防控副猪嗜血杆菌病的最佳途径，国内副猪嗜血杆菌商品化疫苗多为针对血清4型、5型的二价疫苗，与各地区主要流行菌株血清型差异较大，导致防控效果不佳。因此亟需一种新的最大限度包含所有国内不同地区流行优势毒株研制的疫苗，且对所有血清型和不能分型的副猪嗜血杆菌的感染都具有极好保护率的疫苗。
4.

技术实现要素：

5.针对副猪嗜血杆菌各地流行血清型不一，各血清型之间缺少有效交叉保护导致疫苗效果不佳的缺陷和问题，本发明提供一种副猪嗜血杆菌血清1型、2型、4型、5型、7型、12型、13型、14型八价灭活疫苗。本发明解决其技术问题所采用的方案是：提供用于制备副猪嗜血杆菌疫苗的组合菌株，包括副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）1型hn1397株，保藏编号为cgmcc no：16804；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）2型hn1553株，保藏编号为cgmcc no：16801；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）4型hnhps1株，保藏编号为cgmcc no：13335；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）5型hn1570株，保藏编号为cgmcc no：16802；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）7型hn1565株，保藏编号为cgmcc no：16803；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）12型hn486株，保藏编号为cgmcc no：16805；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）13型hn1601株，保藏编号为cgmcc no：16806；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）14型hn1513株，保藏编号为cgmcc no：16807。
6.本发明还提供一种上述组合菌株制备的副猪嗜血杆菌八价灭活疫苗，包括灭活的八种副猪嗜血杆菌菌液和免疫佐剂。
7.上述的副猪嗜血杆菌八价灭活疫苗，副猪嗜血杆菌1型、2型、4型、5型、7型、12型、
13型、14型的血清型抗原比例为1:1:1:1:1:1:1:1。
8.上述的副猪嗜血杆菌八价灭活疫苗，所述副猪嗜血杆菌血清1型、2型、4型、5型、7型、12型、13型、14型抗原的含量均为1
×
10
10 cfu/ml。
9.上述的副猪嗜血杆菌八价灭活疫苗，其特征在于：所述免疫佐剂为畜禽用水包油包水佐剂summit s550。
10.本发明还提供一种副猪嗜血杆菌八价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）增殖：1型hn1397株、2型hn1553株、4型hnhps1株、5型hn1570株、7型hn1565株、12型hn486株、13型hn1601株和14型hn1513株菌株分别繁殖培养，获得8种副猪嗜血杆菌菌液，并分别进行活菌计数；（2）灭活：分别向步骤（1）中获得的副猪嗜血杆菌hn1397株、hn1553株、hnhps1株、hn1570株、hn1565株、hn486株、hn1601株和hn1513株菌液中按照菌液体积的0.2%加入甲醛溶液，于37℃灭活48 h；（3）浓缩：使用超滤装置分别浓缩灭活后检验合格的副猪嗜血杆菌hn1397株、hn1553株、hnhps1株、hn1570株、hn1565株、hn486株、hn1601株和hn1513株菌液，根据灭活前的活菌计数，用无菌生理盐水调整浓缩终浓度；（4）制备疫苗：将增殖、灭活、浓缩后获得的副猪嗜血杆菌hn1397株、hn1553株、hnhps1株、hn1570株、hn1565株、hn486株、hn1601株和hn1513株抗原液，按照比例混匀，加入佐剂，混匀制得副猪嗜血杆菌八价灭活疫苗。
11.上述的副猪嗜血杆菌八价灭活疫苗的制备方法，步骤（4）中将八种菌株灭活抗原液按照1:1:1:1:1:1:1:1的比例混匀，加入终体积30%的畜禽用水包油包水佐剂混合均匀。
12.本发明的有益效果：本发明从临床分离株中筛选出优势流行菌株副猪嗜血杆菌hn1553株、hnhps1株、hn1570株、hn1565株、hn1397株、hn486株、hn1601株和hn1513株菌株，其中菌株hn1397株、hn1553株、hnhps1株、hn1570株、hn486株、hn1601株和hn1513株对保育仔猪具有较强的致病力，引起保育猪发病死亡。本发明中的菌株hn1565株对保育仔猪致病力稍弱，但能引起保育仔猪呼吸道症状，发育迟缓，饲料报酬降低；通过试验发现这八株副猪嗜血杆菌均有良好的免疫原性，用这八株副猪嗜血杆菌作为菌株抗原制备的灭活疫苗对1型、2型、4型、5型、7型、12型、13型、14型的感染具有100%的保护率，对3型、6型、8型、9型、11型、15型及不能分型的副猪嗜血杆菌的感染均具有较好的交叉保护力，疫苗制备工艺简单，无毒副作用，安全性好，免疫期长、免疫效果好。
附图说明
13.图1为副猪嗜血杆菌的pcr分型鉴定结果，图中的marker为dl 2000 bp，从上到下依次为2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp，100 bp；泳道1～15分别为副猪嗜血杆菌1～15血清型标准株的扩增结果。
具体实施方式
14.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
15.实施例1：副猪嗜血杆菌的分离和鉴定1.1 病料来源
2016年1月到2019年12月，共采集来自河南、山西、陕西、山东、湖北、安徽、江苏、河北等省具有疑似副猪嗜血杆菌病临床症状猪的病例的肺脏、心血、淋巴结、脾脏、脑、关节液等病料，发病猪多表现为发热、呼吸困难、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀、站立困难甚至瘫痪、僵猪或死亡。
16.1.2 培养基配制tsb液体培养基：将tsb肉汤粉（tryptic soy broth，胰蛋白胨大豆肉汤，bd公司）30g，溶于1000 ml超纯水中，115℃灭菌15 min，加胎牛血清50 ml（hychone公司）、无菌1%nad（nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶ⅰ，roche公司）1 ml。
17.tsa固体培养基：将tsa琼脂粉（tryptic soy agar，胰蛋白胨大豆琼脂，bd公司）40g，溶于1000ml超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50ml、无菌1%nad 1ml；于4℃保存备用。
18.1.3 副猪嗜血杆菌的分离培养无菌条件下采集发病或死亡猪的肺脏、心血、淋巴结、脾脏、脑、关节液等病料接种于含有nad的tsa固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养36 h，挑取疑似菌落进行传代纯化，再培养24～48 h后观察副猪嗜血杆菌的菌落形态，长出一致的针尖状大小、无色透明、光滑、湿润的，直径大小为1～2毫米的菌落；纯化的同时并接种于不含nad的tsa固体培养基上，在不含nad的tsa培养基上不能生长；挑取纯化的单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征为革兰氏阴性菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到细长致丝状的菌体。
19.1.4副猪嗜血杆菌的鉴定与血清型鉴定通过聚合酶链反应（pcr）技术对临床分离疑似株进行副猪嗜血杆菌鉴定和分型鉴定。副猪嗜血杆菌1～15型的引物序列和扩增片段长度见表1。
20.pcr反应：pcr反应体系为25 μl体系包括10
×
tap pcr master mix 13 μl，上、下游引物各1.0 μl，无菌水5.0 μl，模板5μl。反应条件为： 94 ℃变性5 min后，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min，pcr产物于4 ℃保存。取pcｒ产物10 μl，经1%琼脂糖凝胶100 v电压下电泳45 min后用凝胶成像系统分析观察结果，阳性结果测序比对。
21.通过对采集的疑似样品进行细菌分离、纯化、鉴定，共分离出副猪嗜血杆菌60株，通过基因比对，分离株与标准hps的16srrna序列的同源性均在99%以上。将60株副猪嗜血杆菌河南分离株经pcr分子血清分型鉴定，结果见图1。结果显示：60株副猪嗜血杆菌中血清5型12株，血清13型10株，血清4型9株，血清12型8株，血清2型6株，血清7型5株，血清1型4株，血清型14型有2株，不可分型菌株有4株。结果看出临床上以5型、13型、4型、12型、2型、7型、1型、14型为主要流行血清型。
22.选取以上8种主要流行血清型的副猪嗜血杆菌对其进行命名，并在中国微生物菌
种保藏管理委员会普通微生物中心对其进行保藏，分别为副猪嗜血杆菌1型hn1397株，保藏编号为cgmcc no：16804；副猪嗜血杆菌2型hn1553株，保藏编号为cgmcc no：16801；副猪嗜血杆菌4型hnhps1株，保藏编号为cgmcc no：13335；副猪嗜血杆菌5型hn1570株，保藏编号为cgmcc no：16802；副猪嗜血杆菌7型hn1565株，保藏编号为cgmcc no：16803；副猪嗜血杆菌12型hn486株，保藏编号为cgmcc no：16805；副猪嗜血杆菌13型hn1601株，保藏编号为cgmcc no：16806；副猪嗜血杆菌14型hn1513株，保藏编号为cgmcc no：16807。保藏日期：副猪嗜血杆菌4型hnhps1株于2016年11月22日保藏，其余7株均于2018年11月9日保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
23.实施例2：毒力试验选取9～10周龄断奶健康的保育猪45头为试验动物。将试验动物随机分为9组，1组对照组和8组试验组，每组5头。将副猪嗜血杆菌菌株hn1397株、hn1553株、hnhps1株、hn1570株、hn1565株、hn486株、hn1601株和hn1513株分别接种tsb液体培养基，37℃摇床培养24 h后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，活菌计数，计算原液菌体浓度，调整至10
9 cfu/ml；8组试验组动物分别通过腹腔内接种3 ml hn1397株、hn1553株、hnhps1株、hn1570株、hn1565株、hn486株、hn1601株和hn1513株副猪嗜血杆菌液体培养物，对照组动物通过腹腔内接种3 ml灭菌的tsb液体培养基。注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。
24.观察发现：hn1397株、hn1553株、hnhps1株、hn1570株、hn486株、hn1601株和hn1513株接种组在接种副猪嗜血杆菌24h后表现出喘气、呼吸困难等症状，体温升高，耳部、腹部及臀部发绀，并出现转圈，2天后开始出现死亡。hn1565株接种组在接种后36h出现喘气、咳嗽等呼吸道症状，伴随体温升高，逐渐消瘦，发育迟缓，饲料报酬降低，并未出现死亡情况。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。发病死亡情况见表2。
25.试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀5头对照组动物，采集病料，进行细菌分离。hn1397株、hn1553株、hnhps1株、hn1570株、hn486株、hn1601株和hn1513株接种组剖检肺有大量纤素样渗出，与胸膜粘连，心包积液，绒毛心，脑部出血； hn1565株接种组胸腔有少量纤维素渗出，肺脏出血等肺炎症状，心包积液；对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的5份病料均未分离到副猪嗜血杆菌，8个试验组的每组5份病料中均分离到副猪嗜血杆菌，pcr鉴定结果与接种菌株一致。
26.综合毒力试验结果，确定将猪嗜血杆菌株hn1397株、hn1570株、hn486株、hn1601株
和hn1513株表现为毒力较强的菌株，hn1553株、hnhps1株表现为毒力中等的菌株，hn1565株表现为毒力较弱的菌株。
27.实施例3：疫苗的制备、安全性和效力试验3.1 疫苗的制备3.1.1菌种及菌种繁殖一级种子繁殖将副猪嗜血杆菌1型hn1397株、2型hn1553株、4型hnhps1株、5型hn1570株、7型hn1565株、12型hn486株、13型hn1601株和14型hn1513株冻干菌种分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和nad(终浓度0.01%)的tsa平板上，37℃培养18～24h，挑取符合要求的典型菌落，分别传代接种含胎牛血清(终浓度5％)和nad(终浓度0.01%)的tsa平板，37℃培养24h，检验合格后，作为一级种子。
28.二级种子繁殖将各株一级种子分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和nad(终浓度0.01%)的tsb液体培养基中，37℃，摇床振荡培养18~24h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子。
29.3.1.2 抗原菌液培养将八种菌株的二级种子按1％分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和nad(终浓度0.01%)的tsb液体培养基中，分别于37℃。摇床振荡培养18～24h后收获菌液。
30.3.1.3 活菌计数按现行《中国兽药典》附录方法，使用适宜于本菌生长的含5％新生牛血清和0.01%nad的tsa培养基进行活菌计数。使用摇瓶培养，活菌计数浓度，八种菌株培养活菌含量均在1 .0
×
109cfu/ml以上。
31.3.1.4菌液灭活分别向八种副猪嗜血杆菌菌株的培养液添加体积总量的0.2％甲醛溶液，在37℃灭活48 h。
32.3.1.5 灭活检验分别取八种菌株的灭活菌液0.2ml接种适宜于tsa平板(含5％新生牛血清和0 .01％nad)，置37℃培养48 h，无细菌生长为合格。
33.3.1.6 抗原浓缩将灭活检验合格的八种抗原菌液分别通过超滤系统装置浓缩菌液。根据灭活前活菌计数结果，使用无菌生理盐水将八种菌体抗原浓度调整至1.0
×
10
10
cfu/ml，并将八种抗原液按1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合均匀。
34.3.1.7 佐剂准备将畜禽用水包油包水佐剂summit
‑
s550分装成瓶，经121℃高压灭菌30分钟，室温存放备用。
35.3.1.8 疫苗制备按浓缩混匀的抗原液添加30%的畜禽用水包油包水佐剂summit
‑
s550，搅拌充分混匀，分装得到氢氧化铝胶佐剂的副猪嗜血杆菌病八价灭活疫苗。最终疫苗中含灭活前八种菌株活菌总数为1.0
×
10
10
cfu/ml。
36.3.2 疫苗的安全性试验
选取14日龄健康仔猪10头，分为2组，每组5头。
37.疫苗组：颈部肌肉注射4 ml本疫苗；对照组：颈部肌肉注射4 ml灭菌生理盐水。测定动物体温，观察临床表现，共观察2周。
38.通过观察发现疫苗组和对照组的保育猪在整个观察期间呼吸、食欲、精神状态都正常，平均体温升高不超过1℃，无明显局部或全身不良反应。说明本发明的灭活疫苗安全。
39.3.3 疫苗的效力试验选取15日龄健康仔猪160头，设立疫苗免疫组16组和对照组16组，每组5头。疫苗组每组分别注射该疫苗2ml，疫苗组3周后二免注射同等剂量的疫苗，对照组不接种。二免后14天，16组疫苗免疫组和16组对照组分别用109cfu的副猪嗜血杆菌1型hn1397株、2型hn1553株、4型hnhps1株、5型hn1570株、7型hn1565株、12型hn486株、13型hn1601株和血清14型hn1513株、3型标准株、6型标准株、8型标准株、9型标准株、11型标准株、15型标准株、未能分型毒株菌液采取腹腔内攻毒。观察各组仔猪的临床表现，每日测定体温，共观察2周。
40.计算整个观察周期实验仔猪的发病率和死亡率，测定体温，对死亡猪肺脏等器官进行细菌分离培养。
41.观察发现：疫苗组与对照组组有明显的差异，攻毒后第二天，对照组组的仔猪第二天开始出现临床症状，体温升高，呼吸困难，转圈，2天后开始出现死亡，不同菌株攻毒组猪出现不同程度的发病，死亡。剖检对照组出现不同程度的病变，胸腔和腹腔有积液，并有纤维素性渗出物，心包积液，心包腔内有纤维素性渗出物，心包粘连。肺脏肿大，两侧肺叶淤血或出血，表面纤维素性渗出物。脑膜充血，脑脊液增加。16组疫苗组中，猪没有出现发病死亡。不同血清型菌株免疫攻毒结果分别见表3。
42.由表3的免疫攻毒试验结果可以看出，本疫苗2ml免疫剂量两次免疫临床副猪嗜血杆菌血清1型、2型、4型、5型、7型、12型、13型、14型的感染具有100%的保护率，对3型、6型、8型、9型、11型、15型标准株及不能分型的副猪嗜血杆菌的感染均具有极好的交叉保护力，说明本发明的灭活疫苗对所有的副猪嗜血杆菌感染具有极好的保护效果。
43.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。