BAFF抗体在制备治疗炎症性肠病药物中的应用

本发明涉及生物制药领域，具体为baff抗体在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。

背景技术：

随着经济全球化的发展，人们生活方式及生活环境的改变，中国炎症性肠病发病率逐年上升，其病程迁延不愈，严重影响到患者的生活质量。肠道黏膜免疫系统的持续激活被认为是肠道炎症性疾病反复复发的主要原因。在前期的研究中发现炎症性肠病患者血清、粪便和人结肠组织中b细胞刺激因子(baff，bcellactivatingfactor)水平与临床活动性、c反应蛋白以及血清中各种促炎细胞因子如tnf-α，il-1水平密切相关。且ibd患者粪便中baff浓度高于ibs患者和健康对照组。我们猜想baff在炎症性肠病中的作用可能作为一种促炎因子存在，故使用baff抗体拮抗baff观察其在溃疡性结肠炎中的效应。

目前阻断baff生物学活性的制剂主要有抗baff抗体和baff的可溶型受体两大类，其中baff抗体包括lymphostat-b、egfp/scfvf8、anti-baffscfv、anti-baffscfv-fc等。

目前尚无baff在炎症性肠病及相关疾病治疗药物中的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供baff抗体在制备治疗炎症性肠病药物中的应用，其提供了一种针对炎症性肠病新的治疗药物，能够有效的抑制炎症性肠病引起的如器官损伤、炎症等关联性疾病；也为baff抗体提供了一种新的用途。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：baff抗体在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。

优选的，提供一种治疗炎症性肠病的药物，有效成分为baff抗体。

优选的，baff抗体在制备预防炎症性肠病药物中的应用。

优选的，提供一种预防炎症性肠病的药物，有效成分为baff抗体。

优选的，baff抗体在制备防治炎症性肠病引起的器官损伤药物中的应用。

优选的，提供一种防治炎症性肠病引起的器官损伤的药物，有效成分为baff抗体。

优选的，baff抗体在制备控制炎症性肠病引起的炎症反应药物中的应用。

优选的，一种控制炎症性肠病引起的炎症反应的药物，有效成分为baff抗体。

优选的，baff抗体为lymphostat-b或egfp/scfvf8或anti-baffscfv或anti-baffscfv-fc。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种针对炎症性肠病新的治疗药物，能够有效的抑制炎症性肠病引起的如器官损伤、炎症等关联性疾病；也为baff抗体提供了一种新的用途。

附图说明

图1为本发明中baff抗体干预慢性dss结肠炎模型小鼠baff相关受体的表达情况对比；

图2为本发明中baff抗体对慢性dss结肠炎模型小鼠体重的影响对比图；

图3为本发明中baff抗体改善慢性dss结肠炎模型小鼠结肠长度对比图；

图4为本发明中三组小鼠结肠的病理切片图；

图5为本发明中三组小鼠末端结肠组织炎性细胞因子对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-5，本发明提供的一种实施例：

本发明提供了以下的内容：

baff抗体在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。提供一种治疗炎症性肠病的药物，有效成分为baff抗体。

baff抗体在制备预防炎症性肠病药物中的应用。提供一种预防炎症性肠病的药物，有效成分为baff抗体。

baff抗体在制备防治炎症性肠病引起的器官损伤药物中的应用。提供一种防治炎症性肠病引起的器官损伤的药物，有效成分为baff抗体。

baff抗体在制备控制炎症性肠病引起的炎症反应药物中的应用。一种控制炎症性肠病引起的炎症反应的药物，有效成分为baff抗体。

baff抗体为lymphostat-b或egfp/scfvf8或anti-baffscfv或anti-baffscfv-fc。

以下为baff效果的验证过程：

1.试验材料

1.1实验动物

雄性c57bl/6j小鼠，6-8周龄，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，于spf级动物实验中心进行饲养。

1.2主要设备、试剂

低温及-80℃超低温冰箱(panasonic)，荧光光度计(thermofisherscientific)，光学显微镜(nikon)，mini-cycler热循环仪(roche)，多功能酶标仪(tecan)，pcr仪(roche)，低温离心机(eppendorf)，western显影仪(azurebiosystem)，全自动低温组织匀浆仪(上海豫明仪器有限公司)，全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技公司)，涡旋震荡仪(上海净信科技公司)，摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)；dss购买于美国mp公司；trizol(takara)；逆转录及pcr试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；组织固定液(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

baff中和抗体(sandy-2，adipogen)，(baff(d7i1u)rabbitmab#19944，adipogen)，(humanbaff/tnfsf13b(hbaff)#89628，adipogen)均具有类同的实验结果，结果差异较小，近似为相同结果，由于实验结果相近，为了避免赘述在下述结果中采用(sandy-2，adipogen)作为代表，同时也代表着其他类型抗体结果。

2.方法

2.1构建dss诱导的小鼠慢性炎症性肠病模型及baff中和抗体干预

1)实验分组：雄性c57bl/6小鼠30只，随机分为对照组、dss组、dss+anti-baff组。小鼠于spf级动物房中适应性喂养7天后进行后续实验。

2)实验干预：对照组：自由饮用高压后的蒸馏水30天，于第1、15天腹腔注射200ulpbs溶液；dss组：第1-5、11-15、21-25天自由饮用2.5％dss溶液，于第1、15天腹腔注射对照抗体(2mg/kg和1mg/kg)；dss+anti-baff组：第1-5、11-15、21-25天自由饮用2.5％dss溶液，其余造模时间自由饮用高压后的蒸馏水，于第1、15天腹腔注射baff抗体(2mg/kg和1mg/kg)。

3)小鼠一般情况的记录：造模开始后，每天记录小鼠的体重、大便的性状(正常、糊状便还是稀水样便)及带血情况(无、隐血还是明显肉眼血便)和活动情况(活跃还是倦怠)等。

4)小鼠处死及标本采集：对照组、dss组、dss+anti-baff组于造模第30天处死小鼠，0.5％戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠后进行眼球取血，室温静置2h，3000rpm，4℃低温离心15min后取上层血清储存于-80℃备用。沿腹中线打开腹腔及胸腔，留取结肠、脾脏。取一段结肠组织于组织固定液中常温固定24h后行石蜡切片及h&e染色；其余组织取下并洗净后迅速保存于-80℃冰箱中，用于后续rt-qpcr检测。

2.2苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，h&e)

1)回肠组织在组织固定液中固定24h，经梯度浓度的乙醇脱水，二甲苯中透明后，用石蜡包埋并切片；

2)脱蜡：依次将玻片置于二甲苯、100％乙醇、95％乙醇及80％乙醇中脱蜡；

3)染色：入苏木素染液10分钟，至细胞核为紫红色，再用流水冲洗1min至细胞核为鲜亮的蓝色—0.5％盐酸酒精分色3～10seconds，镜下观察—流水冲洗5～10s—饱和碳酸锂水溶液复蓝15～20s—流水冲洗1min—70％乙醇5min，80％乙醇5min—1％伊红染液1～3min—95％乙醇5min，100％乙醇5min—二甲苯+乙醇(1：1)5min，纯二甲苯5min；

4)封片：滴加一小滴中性树脂并用盖玻片封片，自然风干。

2.3实时定量聚合酶链式反应(realtimequantitativepolymerasechainreaction，rt-qpcr)

2.3.1组织rna的提取

1)用经高压灭菌的眼科剪和镊子剪取小鼠回肠组织约20mg，迅速置入含1mltrizol的高压灭菌的2mlep管中，并加入3颗小磁珠，于研磨仪中65hz、120sec，低温匀浆2次；

2)向组织匀浆液中加入200ul氯仿，用力上下颠倒摇晃ep管15s后室温静置5min，低温离心15min(12000rpm)。离心后液体分为三层，其中上层无色溶液为rna相；

3)用移液器吸取300ul上层无色溶液，加入300ul异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5min，低温离心15min(12000rpm)；

4)使用移液器小心弃除ep管中所有溶液，ep管底部沉淀即为提取的rna沉淀，将1ml预冷的75％乙醇加入ep管中，用移液器轻轻地吹打清洗rna沉淀，低温离心5min(12000rpm)；

5)弃掉上清后倒置ep管于干净的滤纸上，干燥1min，使残留的乙醇挥发。

6)根据rna沉淀量用移液器加入适量的depc水溶解沉淀，并轻轻吹打使沉淀充分溶解。

7)rna浓度检测：使用分光光度计测定rna浓度，首先用高压的清洗比色杯后加入100ulddh2o调零。于比色杯中加入2ul提取的rna溶液和98ulddh2o，于280nm吸光度处测定rna浓度，记录rna的纯度及浓度。

2.3.2逆转录

1)cdna合成根据逆转录试剂盒说明书进行，根据需要合成cdna的量和提取的rna浓度计算所需rna用量。

2)配制反应体系：以10ul反应体系为例

3)逆转录：在minipcr仪中进行逆转录，程序为37℃、15min～85℃，15sec～4℃，即可得到相应的cdna。

2.3.3实时定量pcr

1)配pcr反应体系：10ul扩增体系组成：tbgreen5ul，引物1ul、cdna1ul、ddh2oul；

2)加样：将配好的反应体系加入96孔pcr板中，加样完毕后用封板膜封闭96孔板并离心。

3)扩增程序：95℃10min—95℃30s—60℃30s—72℃1min，40个循环扩增—溶解曲线，95℃0s、65℃15s、95℃0s。

4)结果分析：以β-actin作为内参，采用2^-△△ct方法进行计算和分析。

3.数据统计

使用graphpadprism8.0进行实验数据统计学分析和绘图，统计结果用均数±标准误表示。据实验数据类型，组间差异分析采用单因素方差分析(one-wayanova)或mann–whitney检验。p<0.05时认为组间差异具有统计学意义。

4.结果及分析

1.baff抗体干预慢性dss结肠炎模型小鼠baff相关受体的影响

通过rt-qpcr的方法检测小鼠体内baff相关受体表达情况并用柱形图表示其均值和标准差。如图1所示，与对照组相比，dss组小鼠结肠组织baff相关受体baff-r，taci基因表达水平显著增加，baff抗体干预后baff-r，taci显著下降，差异具有统计学意义，而bcma在慢性结肠炎小鼠结肠组织中基因表达有降低趋势，baff抗体干预后相比dss组有下降趋势，但无明显统计学意义，说明dss诱导的慢性结肠炎模型小鼠与baff导致的炎症baff相关受体主要是baff-r和taci，而非bcma。

2.baff抗体对慢性dss结肠炎模型小鼠体重的影响

如图2所示，空白对照组小鼠体重随鼠龄增长而增长，慢性dss结肠炎小鼠体重下降明显，未饮入dss溶液的清水期小鼠体重亦未能恢复至空白对照组小鼠的水平。dss干预同时给与baff抗体干预，每一个周期饮入dss使得小鼠体重有所下降，但baff抗体干预组体重稍低于dss组，经过清水期的恢复，baff抗体干预组小鼠体重逐渐高于慢性dss结肠炎小鼠(p＜0.05),从体重改变率曲线的分布及趋势仍可提示，baff抗体腹腔注射对于慢性结肠炎小鼠的体重下降及恢复皆有改善作用。

3.baff抗体改善慢性dss结肠炎模型小鼠结肠炎症

在造模完处死小鼠，取出小鼠结肠，肉眼观察结肠大体变化并测量每只小鼠结肠长度，留取结肠组织石蜡包埋后切片做he染色，判定结肠损伤程度。同文献报道相同，dss慢性结肠炎模型小鼠结肠长度较空白对照组明显缩短，差异具有统计学意义(p＜0.01)，而baff抗体腹腔注射干预后，结肠长度较慢性dss结肠炎组显著延长，差异具有统计学意义(p＜0.05)。结果如图3所示。

对小鼠结肠标本he染色后发现相比空白对照组，dss慢性结肠炎组小鼠结肠粘膜可见结肠粘膜明显受损，隐窝结构破坏，粘膜下层有大量炎性细胞浸润，baff抗体干预后小鼠结肠损伤程度较dss慢性结肠炎组小鼠明显减轻。上述结果表明baff单抗可有效缓解dss诱导的结肠炎小鼠中肠道炎症。代表性病理切片见图4。

如图5中，用rt-qpcr的方法检测上述三组小鼠末端结肠组织炎性细胞因子il-1β、tnf-α、il-6、tgf-β。柱高表示mrna水平与内参基因β-actin的比值平均值，柱上方的横线与柱的距离表示标准差。结果显示baff抗体干预组和dss组小鼠相比，il-1β、tnf-α、il-6、tgf-β的mrna表达有不同程度的下降，进一步从基因表达的角度证明baff抗体可减轻小鼠肠道炎症。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。