一种含间充质干细胞培养上清液的生发微针贴片及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种含间充质干细胞培养上清液的生发微针贴片及其制备方法与在雄激素源性脱发治疗中的应用。


背景技术：

2.雄激素源性脱发(androgenetic alopecia,aga)，又称脂溢性脱发，是临床上最为常见的病理性脱发类型，表现为额部发际后退，或顶部头发逐渐稀疏、脱落，头发密度进行性减少。
3.近年来，随着社会的高速发展，竞争愈发激烈，人们精神压力增加，aga的发病率呈逐年上升趋势，且伴有年轻化趋势。虽然脱发可能不会对生理功能产生显著影响，但它会直接影响个人外形美观、社交，对患者的心理产生负面影响，严重影响患者的生活质量。
4.目前缺乏理想的治疗手段，药物治疗(米诺地尔、非那雄胺)疗程长、不良反应多、停药易复发、患者依从性差，而毛发移植存在创伤大、费用高昂、术后毛发密度不理想等问题。基于上述发病和治疗现状，从aga发病机理出发，探索更安全有效的治疗手段是现在的研究热点。
5.研究表明早中期aga患者脱发区域的毛囊干细胞是完整的，但由于缺少信号分子的刺激，毛囊干细胞无法被激活分化成为祖细胞，祖细胞的数量无法得到补充，一系列由祖细胞分化得到的毛囊细胞受到影响，进而导致毛囊的萎缩和毛发微型化。大量研究发现，间充质干细胞培养上清液中富含多种调控毛囊生长的细胞因子，包括血管内皮细胞生长因子(vegf)、肝细胞生长因子(hgf)、胰岛素样生长因子(igf)和角质形成细胞生长因子(kgf)等。而低氧预处理能使间充质干细胞分泌更多的血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子。
6.目前，韩国有一款上市产品其中的主要成分即为低氧处理的脂肪来源的干细胞的培养液，用于脱发治疗。由于这些活性分子都是生物大分子，透皮十分困难，目前用于脱发治疗时，大部分都是皮下注射给药，疼痛感强，需要专业人员操作，病人依从性差，也有一小部分是结合滚轮微针给药，但操作较为繁琐。
7.微针(microneedles,mns)是由硅、金属或其他材料通过微电子制造技术或微铸模技术制成的长度为100μm～2000μm不等的细小的针，通常由大量的微针组成阵列结构，称为微针贴片。微针既可以刺穿角质层在皮肤表面形成微孔道帮助药物进入皮肤，其长度又不足以触及皮下痛觉神经，形成的微孔道也可在数小时内恢复，具有微创微痛性、和使用便捷性。
8.常见的微针包括固体微针、空心微针和可溶性微针等，可溶性微针可以精准剂量载药。


技术实现要素：

9.本发明提供了一种含间充质干细胞培养上清液的生发微针贴片及其制备方法与应用，通过将间充质干细胞培养上清液的浓缩液载于可溶性微针中，为aga的治疗提供一种安全、高效、且微创微痛的治疗手段。
10.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
11.一种含间充质干细胞培养上清液的生发微针贴片，包括背衬和排列在背衬上的含间充质干细胞培养上清液的可溶性微针针体；所述生发微针贴片的制备方法包括如下步骤：
12.将间充质干细胞培养上清液的浓缩液加入到针体聚合物与生物大分子保护剂的混合溶液中得到预混溶液，将所述预混溶液注入微针模具中，离心使预混溶液填满整个微针模具空腔，去除多余的预混溶液后进行第一次干燥；
13.将背衬聚合物溶液注入微针模具中，离心使背衬聚合物溶液填满微针模具的背衬部分后进行第二次干燥至微针自动脱模，即得到所述的生发微针贴片；所述的背衬聚合物和针体聚合物溶液相同或不同。
14.本发明所述的生发微针贴片由两步离心法制备得到，微针针体含间充质干细胞培养上清液，贴片背衬不含间充质干细胞培养上清液，不会引起活性物质的浪费。使用时，微针针体吸收组织液快速溶解，贴片背衬可被移除，给药过程较短(小于5分钟)，无需胶带固定，不影响美观，病人依从性较高。
15.所述针体聚合物为透明质酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(甲基乙烯基醚/马来酸)半酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠中的一种或任意两种以上的混合物。
16.所述生物大分子保护剂为甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘氨酸或精氨酸中的一种或任意两种以上的混合溶液。
17.所述针体聚合物溶液与生物大分子保护剂的混合溶液中针体聚合物的质量分数为10～95％，生物大分子保护剂的质量分数为5～15％。
18.所述预混溶液中间充质干细胞培养上清液的浓缩液的总蛋白量为100～500mg/ml。
19.所述背衬聚合物溶液中的聚合物材料为支链淀粉、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(甲基乙烯基醚/马来酸)半酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠中的一种或任意两种以上的混合物。
20.所述背衬聚合物溶液中的聚合物材料的质量分数为20～80％。
21.所述离心的速度为1000～10000rpm，离心的时间为1～40min。
22.所述间充质干细胞培养上清液的浓缩液的制备方法包括如下步骤：
23.将间充质干细胞培养于细胞培养基中，待间充质干细胞60～75％融合时，换液并移至低氧培养箱进行低氧刺激，移除该间充质干细胞后，离心除去死细胞和细胞碎片，收集上清液，随后用超滤管进行浓缩，得到间充质干细胞培养上清液的浓缩液。
24.在间充质干细胞低氧培养过程中，间充质干细胞会分泌更多与毛发再生有关的细
胞因子至细胞培养基的上清液中，通过采用间充质干细胞培养上清液的浓缩液与聚合物溶液进行混合，使间充质干细胞培养上清液中的活性生物大分子均匀分散在聚合物溶液中，通过两步离心法最后制备得到固态的可溶性微针贴片。该固态的可溶性微针贴片制备过程温和，无需极端条件，制备简便，且可在干燥环境中进行常温保存，有效避免了现有技术中各种干细胞在应用过程中的难以保存问题。
25.所述的间充质干细胞为脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞或脂肪来源间充质干细胞。
26.所述低氧培养箱中氧气浓度为0.1％～2％，低氧刺激的时间为12～48h。
27.所述的超滤管的截留分子量为1～5kda。
28.所述第一次干燥时间为1～12h，温度为4℃～40℃。
29.所述第二次干燥时间为24～72h，温度为4℃～40℃。
30.本发明还提供了所述的生发微针贴片在制备治疗雄激素源性脱发贴剂中的应用。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
32.(1)本发明提供的生发微针贴片可直接刺过皮肤角质层屏障，随着微针针体的溶解逐渐释放出所载的间充质干细胞培养上清液，将上清液中的大分子物质高效递送至毛囊处，通过补充毛囊干细胞激活所需的信号分子而发挥治疗效果，作用安全、高效，使用方便，具有实现临床转化的应用前景。
33.(2)本发明提供的生发微针贴片由两步离心法制备得到，针体含间充质干细胞培养上清液，贴片背衬不含间充质干细胞培养上清液，不会引起活性物质的浪费。使用时，微针针体吸收组织液快速溶解，贴片背衬可被移除，给药过程较短(小于5分钟)，无需胶带固定，不影响美观，患者依从性较高。
34.(3)本发明所述生发微针贴片的制备方法中，间充质干细胞会将多种活性细胞因子分泌至细胞培养基的上清液中，而间充质干细胞经低氧刺激预处理，会分泌更多的活性细胞因子。这些细胞因子发挥协同作用，既可以通过激活毛囊干细胞或者与毛囊干细胞激活有关的信号通路而发挥作用，也可以通过重塑毛囊周围微血管系统为毛囊提供充足的营养，全方位地调控毛囊干细胞的激活，诱导毛发再生。
35.(4)本发明从aga的发病机理出发解决问题，将含间充质干细胞培养上清液的生发微针贴片用于治疗aga，具有实现临床转化的应用前景，为当前aga治疗中无法根治、经常复发的问题提供了解决方案。
附图说明
36.图1为本发明实施例1中生发微针贴片的sem图。
37.图2为模型组、涂抹对照组以及微针组中小鼠毛发再生情况对比图。
38.图3为模型组、涂抹对照组以及微针组中小鼠的新生毛发覆盖率的结果对比图。
39.图4为模型组与微针组中小鼠皮肤中vegf含量对比。
具体实施方式
40.下面结合具体实施例和说明书对本发明作进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通
常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
41.实施例1、可溶性生发微针贴片的制备
42.1、制备低氧间充质干细胞培养上清液的浓缩液：在体外无菌环境中利用细胞培养基培养脐带来源间充质干细胞(由天津长和生物技术有限公司提供，批号od15011401)，当达到细胞70％融合时弃掉培养基，换液。
43.将细胞移至低氧培养箱，在低氧条件下(0.1％o2，37％co2，其余用氮气补足)刺激12h，低氧刺激期间不换液。
44.移除该间充质干细胞后收集上清，离心(3000rpm,30min)除去死细胞和细胞碎片，收集上清液。随后用截留分子量为5k da的超滤管(millipore)对上清液进行浓缩，浓缩倍数为50倍，即得到间充质干细胞培养上清液的浓缩液。
45.2、制备预混溶液：以超纯水为溶剂，制备80％的透明质酸溶液，添加甘露醇，使得甘露醇的质量分数为5％，将根据步骤1得到的人间充质干细胞培养上清液的浓缩液与该透明质酸溶液混合，混合后总蛋白量为100mg/ml，得到预混溶液。
46.3、制备微针贴片：将所述步骤2得到的预混溶液注入二甲基硅氧烷(pdms,sylgard 184)微针阵列模具(购于micropoint technologies pte ltd.,新加坡)中。接着，将该pdms微针阵列模具以3000rpm离心10分钟，使其空腔被完全填满后取出，刮去多余的预混溶液。将该pdms微针阵列模具置于硅胶干燥器内，25℃条件下干燥1h。
47.取出该pdms微针阵列模具，注入50％聚乙烯醇溶液。接着，将该pdms微针阵列模具以3000rpm离心5分钟，形成背衬后取出。将该pdms微针阵列模具置于硅胶干燥器内，25℃条件下干燥24h，即得到含间充质干细胞培养上清液的生发微针贴片，制得的微针贴片的sem图如图1所示。
48.实施例2
49.本实施例提供一种可溶性生发微针贴片的制备方法，包括：
50.1、制备低氧间充质干细胞培养上清液的浓缩液：在体外无菌环境中利用细胞培养基培养脐带来源间充质干细胞(由天津长和生物技术有限公司提供，批号od15011401)，当达到细胞70％融合时弃掉培养基，换液。
51.将细胞移至低氧培养箱，在低氧条件下(0.1％o2，37％co2，其余用氮气补足)刺激12h，低氧刺激期间不换液。
52.移除该间充质干细胞后收集上清，离心(3000rpm,30min)除去死细胞和细胞碎片，收集上清液。随后用截留分子量为3k da的超滤管(millipore)对上清液进行浓缩，浓缩倍数为80倍，即得到间充质干细胞培养上清液的浓缩液。
53.2、制备预混溶液：以水为溶剂，制备40％的透明质酸溶液，添加甘露醇，使得甘露醇的质量份数为10％，将根据步骤1得到的人间充质干细胞培养上清液的浓缩液与该透明质酸溶液混合，混合后总蛋白量为500mg/ml，得到预混溶液。
54.3、制备微针贴片：将所述步骤2得到的预混溶液注入聚二甲基硅氧烷(pdms,sylgard 184)微针阵列模具(购于micropoint technologies pte ltd.,新加坡)中。接着，将该pdms微针阵列模具以3000rpm离心10分钟，使其被完全填满后取出，刮去多余的预混溶液。将该pdms微针阵列模具置于硅胶干燥器内，4℃条件下干燥1h。取出该pdms微针阵列模具，注入50％聚乙烯醇溶液。接着，将该pdms微针阵列模具以3000rpm离心5分钟，形成背衬
后取出。将该pdms微针阵列模具置于硅胶干燥器内，4℃条件下干燥24h，即得到含间充质干细胞培养上清液的生发微针贴片。
55.应用例1、用于雄激素源性脱发治疗功效评价
56.选用实施例1制备得到的生发微针贴片，在aga模型小鼠上以指腹力量按压给微针贴片，用力按压1min，接着使微针在皮肤中保留4min。每3天给1片(微针组)；局部涂抹间充质干细胞培养上清液的浓缩液作为涂抹对照组；未接受任何处理的aga模型小鼠为模型组，治疗结束后，记录小鼠毛发再生情况，并检测新生毛发覆盖率和皮肤中vegf含量，实验结果如图2～4所示。
57.如图2所示，含间充质干细胞培养上清液的生发微针贴片治疗后的aga模型小鼠发生明显的毛发再生，而模型组以及涂抹对照组均未发生毛发再生。
58.如图3所示，含间充质干细胞培养上清液的生发微针贴片治疗后的aga模型小鼠的新生毛发覆盖率在60％以上，与模型组以及涂抹对照组小鼠新生毛发覆盖率有显著性差异(p＜0.05)。
59.如图4所示，微针组治疗后的aga模型小鼠皮肤中的vegf含量比模型组小鼠显著提高(p＜0.001)。