一种包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜及其制备方法

技术领域：

本发明涉及眼用剂型和医用材料技术领域，涉及一种包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜及其制备方法，特别是用伏立康唑和卡拉胶制备的角膜接触镜，药物释放时间长，安全无刺激，与角膜有良好的贴附性，用于治疗真菌性角膜炎。

技术背景：

真菌性角膜炎是致病真菌感染引起的角膜疾病。我国作为以工农业为主要产业的发展中国家，是真菌性角膜炎的高发区，生产活动中角膜外伤尤其是植物性外伤为真菌性角膜炎的发生提供了机会，再加上角膜接触镜佩戴人群不断扩大以及临床仍存在部分抗生素、激素的滥用的情况，近年来真菌性角膜炎发病率明显上升，居感染性角膜炎首位，该病患者多为一线工作的青壮年劳动力，致盲率高。真菌性角膜炎临床治疗较为棘手。目前临床上采用的抗真菌滴眼液多为脂溶性混悬液，存在角膜局部渗透作用差、刺激性强、毒性大、半衰期短、需频繁用药等问题，治疗手段匮乏导致真菌性角膜炎的致盲率居高不下。

伏立康唑是一种新型的第二代三唑类抗真菌化合物，可作用于严重的真菌感染，对念珠菌、曲霉等真菌有杀菌作用，是治疗严重曲霉菌感染的一线药物。由于伏立康唑是脂溶性药物，传统的滴眼液形式给药存在渗透性差、刺激性强、用药频繁等问题。

现有技术对于伏立康唑的眼部给药的研究有：中国专利cn201410507426.6公开了一种伏立康唑眼用纳米结晶制剂及其制备方法，该伏立康唑眼用纳米结晶制剂由伏立康唑、可生物降解的高分子辅料、促渗剂、渗透压调剂剂、ph调节剂和蒸馏水制备而成；伏立康唑眼用纳米结晶制剂的特点在于从纳米结晶技术和眼用渗透促进剂两方面提高难溶性药物伏立康唑的溶解度，增强与角膜的黏附力和渗透性。采用eudragitrs100，pva等为主要载体材料通过沉淀法制备伏立康唑纳米结晶制剂；选择安全性好、刺激性小的新型眼用渗透促进剂增强体系的角膜渗透性；中国专利cn201810654715.7公开了一种伏立康唑眼内药物控释的可注射水凝胶的制备方法，方法：一、制备白色絮状多醛基葡聚糖；二、制备水溶性线型聚环糊精；三、首先制备环糊精分子笼中装载伏立康唑的水溶性线型聚环糊精的pbs溶液，然后将羧甲基壳聚糖溶解到上述pbs溶液中，得到伏立康唑眼内药物控释的可注射水凝胶。但这些现有技术均存在制备工艺复杂，给药方式不便，治疗效果未见提高和患者治疗依从性小等缺点，因此寻找真菌性角膜炎有效的治疗药物新剂型至关重要。

卡拉胶(carrageenan)是一种亲水性胶体，又称为麒麟菜胶、石花菜胶、鹿角菜胶、角叉菜胶，是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐。由于其中硫酸酯结合形态的不同，产生了7种主要类型的卡拉胶：κ-型、ι-型、λ-型、γ-型、ν-型、ξ-型、μ-型。不同类型的卡拉胶的增稠和胶凝性质有很大的不同。例如，κ型卡拉胶与钾离子形成的坚硬的凝胶，而ι和λ只有轻微影响。角膜接触镜，也就是隐形眼镜，直接贴附在角膜的泪液层上，与眼表具有良好的相容性。传统的角膜接触镜用于视力矫正，操作简单。

因此有必要寻求一种能够缓释伏立康唑的卡拉胶材料的角膜接触镜，将伏立康唑包埋在卡拉胶中制得角膜接触镜，并使药物缓慢释放，减少用药次数，安全无刺激，佩戴方便，能够提高患者治疗依从性，提高治疗效果。至今为止，还未见有报道包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜及其制备方法。

技术实现要素：
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本发明针对现有技术存在的缺点，提供一种包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜及其制备方法，利用伏立康唑、银离子和卡拉胶制备角膜接触镜，安全无刺激，能够提高真菌性角膜炎的治疗效果。

为了实现上述目的，本发明提供一种包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜，其组份及其含量为：向卡拉胶水溶液中先后加入银盐水溶液和伏立康唑溶液，卡拉胶水溶液与银盐水溶液和伏立康唑溶液的质量体积比为10克:5-15微升：7-13微升，其中卡拉胶水溶液的质量百分比浓度为0.99-10％，伏立康唑溶液为质量浓度为0.1-5毫克/微升的伏立康唑dmso溶液，银盐水溶液为摩尔浓度为0.1摩尔/升的硝酸银水溶液；具体制备工艺步骤包括：

(1)制备卡拉胶溶液：称取0.099-1克κ-卡拉胶，加入9-9.901克灭菌去离子水，水浴加热至50-90℃，搅拌0.5-3小时，配置成质量百分比浓度为0.99-10％的卡拉胶水溶液；

(2)制备伏立康唑溶液：将1-50毫克伏立康唑溶解在10微升dmso中，制成质量浓度为0.1-5毫克/微升的伏立康唑溶液；

(3)原料混合：向步骤(1)制得的10克卡拉胶水溶液中先加入5-15微升摩尔浓度为0.1摩尔/升的硝酸银水溶液，在65℃下搅拌20-40分钟；再加入步骤(2)制得的伏立康唑溶液，在55℃下搅拌20-40分钟；

(4)制备角膜接触镜：将步骤(3)制得的溶液500微升倒入隐形眼镜模具注塑15分钟，制备得到直径14mm、基弧8.7mm、厚度0.09mm的包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜，将其放置于紫外线下照射30分钟，无菌条件下真空包装后4℃保存。

本发明所述包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜用于治疗真菌性角膜炎。

与现有技术相比，本发明的有益效果有：

1)该角膜接触镜，组织相容性好，无免疫原性，安全无刺激；

2)加入的银离子能够促进卡拉胶凝胶化，由于银单质能杀灭真菌，进而减少了伏立康唑的用量。

3)该角膜接触镜成型性好、韧性好，与角膜具有良好的贴附性，佩戴方便，且完全透明；

4)该角膜接触镜可延长药物释放时间达24小时，减少眼部用药频次，减轻眼局部刺激症状，提高患者治疗依从性，提高真菌性角膜炎的治疗效果；

5)该卡拉胶角膜接触镜制作工艺相对简单，成本低，易于保存。

附图说明：

图1为本发明涉及的包埋伏立康唑的角膜接触镜的外观形状示意图。

图2为本发明涉及的实施例2药物缓释实验结果分析示意图。

图3为本发明涉及的实施例3体外抑菌实验结果示意图。

图4为本发明涉及的实施例4细胞毒性实验结果示意图。

图5为本发明涉及的实施例5拉力弹性模量实验结果示意图。

图6为本发明涉及的实施例6对真菌性角膜炎动物模型治疗效果图片及统计分析结果示意图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

本实施例涉及的包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜的组份和含量为：向卡拉胶水溶液中先后加入银盐水溶液和伏立康唑溶液，卡拉胶水溶液与银盐水溶液和伏立康唑溶液的质量体积比为10克:5-15微升：7-13微升，其中卡拉胶水溶液的质量百分比浓度为0.99-10％，伏立康唑溶液为质量浓度为0.1-5毫克/微升的伏立康唑dmso溶液，银盐水溶液为摩尔浓度为0.1摩尔/升的硝酸银水溶液；具体制备工艺步骤包括：

(1)制备卡拉胶溶液：称取0.099-1克κ-卡拉胶，加入9-9.901克灭菌去离子水，水浴加热至50-90℃，搅拌0.5-3小时，配置成质量百分比浓度为0.99-10％的卡拉胶水溶液；

(2)制备伏立康唑溶液：将1-50毫克伏立康唑溶解在10微升dmso中，制成质量浓度为0.1-5毫克/微升的伏立康唑溶液；

(3)原料混合：向步骤(1)制得的10克卡拉胶水溶液中先加入5-15微升摩尔浓度为0.1摩尔/升的硝酸银水溶液，在65℃下搅拌20-40分钟；再加入步骤(2)制得的伏立康唑溶液，在55℃下搅拌20-40分钟；

(4)制备角膜接触镜：将步骤(3)制得的溶液500微升倒入隐形眼镜模具注塑15分钟，制备得到直径14mm、基弧8.7mm、厚度0.09mm的包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜，将其放置于紫外线下照射30分钟，无菌条件下真空包装后4℃保存。

实施例2：

本实施例涉及的包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜的组份和含量为：向卡拉胶水溶液中先后加入银盐水溶液和伏立康唑溶液，卡拉胶水溶液与银盐水溶液和伏立康唑溶液的质量体积比为10克:5-15微升：7-13微升，其中卡拉胶水溶液的质量百分比浓度为0.99-10％，伏立康唑溶液为质量浓度为0.1-5毫克/微升的伏立康唑dmso溶液，银盐水溶液为摩尔浓度为0.1摩尔/升的硝酸银水溶液；具体制备工艺步骤包括：

(1)制备卡拉胶溶液：称取0.3克κ-卡拉胶，加入9.7克灭菌去离子水，水浴加热至70℃，搅拌1小时，配置成质量百分比浓度为3％的卡拉胶水溶液；

(2)制备伏立康唑溶液：将10毫克伏立康唑溶解在10微升dmso中；

(3)原料混合：向步骤(1)制得的卡拉胶水溶液中先加入10微升摩尔浓度为0.1摩尔/升的硝酸银水溶液，在65℃下搅拌30分钟；再加入步骤(2)制备的伏立康唑溶液，在55℃下搅拌30分钟；

(4)制备角膜接触镜：将步骤(3)制得的溶液500微升倒入隐形眼镜模具注塑15分钟，制备得到直径14mm、基弧8.7mm、厚度0.09mm的包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜，将其放置于紫外线下照射30分钟，无菌条件下真空包装后4℃保存。

实施例3：

本实施例涉及包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜体外释放试验。

步骤1：绘制伏立康唑的吸光度-浓度标准曲线：首先检测波长范围为200-350nm内伏立康唑的紫外吸光谱(如图2a所示)，设定255nm为伏立康唑检测峰，然后对浓度梯度为0至80毫克/升伏立康唑dmso溶液进行255nm紫外吸收峰测定，绘制伏立康唑的吸光度-浓度标准曲线(如图2b所示)。

步骤2：把5个实施例2制备的直径为14mm角膜接触膜片放入透析袋中(mwco1000da)，把透析袋完全浸入100mlpbs缓冲溶液(ph＝7.4)中，然后在转速37转/分钟、温度37℃下振荡，在振荡0、0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、16h、20h和24h时间点进行取样，取出1ml溶液后向原溶液补充等量pbs缓冲溶液，取出的1ml溶液利用紫外分光度计在波长255nm下检测伏立康唑吸光度。通过步骤1的标准曲线计算伏立康唑的释放浓度，由释放浓度计算累计药物释放量，累计释放量与最终完全释放的量的比值即为累计释放率。以累计释放率(％)为纵坐标、时间(h)为横坐标绘制释放曲线(如图2c所示)。

从图2c可以得出，包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜在24小时时伏立康唑的释放量达99.9％，总体来看，伏立康唑的释放速度分三个阶段，第一阶段：0-3小时是快速释放阶段，伏立康唑在此阶段内快速释放，释放率达37.9％，快速达到药物有效浓度；第二阶段：3-6小时缓释5.0％，释放速率减慢；第三阶段：6-24小时缓释速率增快，缓释57％。

实施例4：

本实施例涉及包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜的体外抑菌实验，具体步骤为：

(1)制备仅含卡拉胶的角膜接触镜，制备方法与实施例2不同的是不加入硝酸银溶液和伏立康唑溶液；

(2)制备不添加伏立康唑溶液的卡拉胶+银角膜接触镜，制备方法与实施例2不同的是不加入伏立康唑溶液；

(3)用打孔器将上述制得的卡拉胶角膜接触镜和卡拉胶+银角膜接触镜以及实施例2制成的包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜和滤纸均打成直径6mm的圆片，并将滤纸圆片进行高压蒸汽灭菌；

(4)制备1×10⁶mmol/l的烟曲霉菌孢子悬浊液，编号为3.0772的标准烟曲霉菌菌株(中国普通微生物菌种保藏中心)，将其接种于沙氏琼脂培养基上，在35℃下孵育5天。用0.9％的无菌生理盐水清洗培养基，分生孢子悬浮液通过无菌的40μm孔径尼龙网过滤两次后，用磷酸盐缓冲液稀释分生孢子，光学显微镜下计数将孢子浓度稀释为1×10⁶个/ml，4℃储存。

(5)取50微升孢子悬浊液滴加到沙氏固体培养皿表面，用涂布器将孢子悬浊液均匀的涂布在培养基表面。

(6)将卡拉胶角膜接触镜圆片(简称k)、卡拉胶+银角膜接触镜圆片(简称k+ag)、包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜圆片(简称k+ag+vk)及灭菌滤纸圆片贴于涂布有孢子悬浊液的培养基表面，吸取市售伏立康唑滴眼液7微升，加于滤纸片上；每两个圆片间距不少于25毫米，圆片中心距培养皿边缘不少于15毫米，平行重复3次。

5)将培养皿倒置于37℃培养箱中，24-48小时后观察缓释膜片及纸片周围有无抑菌环，并测量抑菌圈的直径，比较抗菌效力，实验结果如图3所示。

从图3可以看出：48小时后，κ-卡拉胶圆片周围未见抑菌环，κ-卡拉胶+银圆片抑菌环平均直径12±0.2mm，包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜(k+ag+vk)圆片的抑菌环平均直径为15±0.3mm，大于伏立康唑滴眼液纸片的平均抑菌环直径9±0.2mm，差异有统计学差异。

实施例4：

本发明涉及包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜的细胞毒性实验，具体为cck8细胞增殖-毒性检测。在96孔培养板中接种永生化人角膜上皮细胞悬液，将培养板放在培养箱中预培养24小时；将κ-卡拉胶(简称k)、κ-卡拉胶+银(简称k+ag)和包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜(简称k+ag+vk)3组角膜接触镜圆片于10ml细胞培养液浸泡24小时，向培养板加入3组浸泡过角膜接触镜的培养液，每组8个孔，正常细胞培养液为对照组；将培养板在培养箱孵育，向每孔加入10微升cck8溶液；将培养板置于培养箱内孵育4小时；用酶标仪测定在450nm处的吸光度，吸光度越高，表面细胞活性越好，结果如附图4所示。

从图4可以看出：浸泡了包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜(k+ag+vk)的培养液处理角膜上皮细胞24小时后，与对照组相比，细胞活性未见明显异常。

实施例5：

本实施例涉及包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜的拉力弹性模量检测实验。

用厚度测量仪测量角膜接触镜厚度取平均值，用直尺测量角膜接触镜取平均值，用镊子装置夹取待测角膜接触镜，置于测量器的上、下固定器，用滤纸衬垫于夹口。调整上、下固定器间距，使角膜接触镜处于自然平整状态，用直尺测量固定器间距；在wdw-5t微机控制电子万能试验机(济南恒瑞金试验机有限公司)软件界面相应位置输入上述厚度、宽度和固定器间距；选择50测量速，测量前应3次调零，膜断裂时测量自动停止，实验结果如图5所示。

从图5可以看出：角膜接触镜形变可达30％，其应力可达36mpa，达到隐形眼镜结构应力标准。

实施例6：

本实施例涉及包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜在治疗小鼠真菌性角膜炎中的应用。

取8周龄c57bl/6健康雌鼠20只，均以右眼为实验眼，建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型。模型建立后，随机分为四组，每组5只：第一组为空白组，不给予角膜炎模型小鼠任何药物；第二组为κ-卡拉胶+银角膜接触镜(简称k+ag)组，每天在小鼠的角膜溃疡处给予成分为κ-卡拉胶+ag的角膜接触镜1次；第三组为包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜角膜接触镜(简称k+ag+vk)组，每天在小鼠的角膜溃疡处给予成分为κ-卡拉胶+ag+伏立康唑的角膜接触镜1次；第四组为伏立康唑滴眼液组，每天给予伏立康唑滴眼液6次。分组干预时间为5天，根据o’day标准行角膜溃疡评分标准，每天裂隙灯下观察记录小鼠角膜溃疡的评分情况，实验结果如图6所示。

结果表明，本发明的包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜组角膜溃疡评分明显低于空白组、κ-卡拉胶+ag角膜接触镜组和伏立康唑滴眼液组。

实施例7：

本实施例涉及包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜在治疗烟曲霉角膜炎患者中的应用。

收集2017年7月至2020年7月于青岛大学附属医院接受治疗的烟曲霉角膜炎患者40例，其中男性24例，女性16例，年龄为22～63岁，平均(39.25±5.07)岁。随机分为角膜接触镜组和对照组，每组20例，其中角膜接触镜组男性11例，女性9例，年龄为25～63岁，平均(38.96±5.88)岁；对照组男性13例，女性7例，年龄为22～61岁，平均(40.82±4.03)岁。两组性别及年龄差异无统计学意义。

角膜接触镜组接受包埋伏立康唑的卡拉胶角膜接触镜治疗，1次/天；对照组接受伏立康唑滴眼液治疗，6次/天；连续治疗21天。

按照相关标准对患者治疗后临床效果进行评价，治愈：经过治疗后，患者分泌物消失，角膜浸润及水肿情况消退，结膜充血情况消失，真菌培养呈现为阴性，角膜溃疡愈合，经过荧光素钠染色检查后呈现为阴性；显效：经过治疗后，患者相关检查结果呈现阴性，各项指标均得到明显改善，仅存在结膜充血情况；有效：经过治疗后，患者相关检查结果呈现阴性，各项指标中仅1～2项得到改善；无效：治疗前后各项指标均无变化，或者存在加重情况。治疗总有效率＝(治愈+显效+有效)/总例数×100％。按照相关标准对患者各项症状进行评价，每一项症状评分最高为5分，评分越高则代表该症状程度越严重。

经过统计后，角膜接触镜组20例患者接受治疗后，19例患者治疗效果显著，其中治愈5例，显效12例，有效2例，无效1例，治疗有效率为95.0％(19/20)；对照组20例患者接受治疗后，14例患者治疗效果显著，其中治愈3例，显效9例，有效2例，无效6例，治疗有效率为70.0％(14/20)。

角膜接触镜组的治疗效果各项指标统计数据如表1所示。

表1角膜接触镜组的治疗效果各项指标统计结果