一种抗菌促愈合纳米纤维支架及采用该支架制得的纳米纤维支架贴的制作方法

本发明涉及医药学技术领域，尤其涉及一种抗菌促愈合纳米纤维支架及采用该支架制得的纳米纤维支架贴。

背景技术：

慢性创面常见于各临床科室，其病因复杂、病程长久，已成为新世纪一个重大难题，它不仅对患者本人生活质量有显著的负面影响，高昂的换药费用还造成了社会的医疗负担，感染导致创面的更难愈合，难愈合性创面又可并发感染。

医用敷料是医院最常见的产品之一，是用来覆盖创面的材料，主要包括纱布、脱脂棉等传统敷料及新一代的高分子材料敷料，可保护伤口免受外部机械性损伤，防止创面感染，促进创面尽快愈合。然而，创面愈合是一个复杂的过程，在整个愈合过程中会受很多因素影响，如创面微环境的温度、湿度、细菌感染等。当这些局部因素的参数处于一个恰当范围时，才更有利于创面愈合。

现有用于创面的医用敷料难以平衡创面微环境的变化，在使用中虽然可以起到一定程度的保护伤口和消炎作用，但对创面渗液吸收差，创面渗液易结痂，尤其在更换敷料时，由于敷料与创面结合的突然分离，容易对创面造成二次伤害，继而影响创面的愈合，难以在创面完全愈合之前实现阻菌和消炎效果。

此外，为了增加敷料贴与创面的透气性，现也有采用静电纺丝工艺制得的抗菌纤维膜产品，纤维直径一般都小于100nm且追求更小的尺寸，且生产工艺也趋于解决如何将这种纤维膜产品纺的更薄，由此造成的纤维膜产品存在薄脆的缺点便要通过后续化学交联制备步骤弥补，以保证其强度。

技术实现要素：

本发明提供了一种抗菌促愈合纳米纤维支架及采用该纳米纤维支架制得的纳米纤维支架贴，在具备透气性的基础上，可显著提高吸收创面渗液性能，使用中可缓慢形成凝胶层接触于创面上，保证了创面愈合过程中微环境的最小变化，缩短愈合周期，尤其在更换时，不会对创面造成二次伤害；抗菌消炎愈合效果显著；制备简单，纤维膜透气且性能稳定，无需化学交联处理，操作简易，解决了现有技术中存在的问题。

本发明所采用的技术方案是：

一种抗菌促愈合纳米纤维支架，包括以下重量份数的原料：聚乙烯醇7.5-15份、丝素蛋白0.5-1.5份、羧甲基纤维素0.5-1.5份、抗菌中药组合物1.0-1.5份；

上述原料采用静电纺丝法制成纤维直径100nm-500nm的纳米纤维膜并进行物理交联处理制得纳米纤维支架。

进一步的，所述的抗菌促愈合纳米纤维支架，包括以下重量份数的原料：聚乙烯醇15份、丝素蛋白1份、羧甲基纤维素1份、抗菌中药组合物1.2份。

进一步的，所述抗菌中药组合物由以下重量份数的原料制成：黄柏15-25份、连翘35-45份、金银花15-25份、蒲公英15-25份、蜈蚣1-1.5份。

进一步的，所述抗菌中药组合物由以下重量份数的原料制成：黄柏20份、连翘40份、金银花20份、蒲公英20份、蜈蚣1.2份。

进一步的，所述物理交联处理为热交联处理。

进一步的，所述纳米纤维支架的制备过程包括如下操作步骤：

1)经水提法制得抗菌中药组合物的煎液，滤过后浓缩至相对密度1.10-1.15的膏体，然后用70％醇溶液醇沉，收集滤液浓缩蒸干得提取物a，备用；

2)将聚乙烯醇、羧甲基纤维素、丝素蛋白按上述重量份数混合后，水浴溶解、冷却，备用；

3)取步骤2)冷却的溶液，加入适量步骤1)提取物a，搅拌至完全溶解，得纺丝液；

4)将步骤3)纺丝液采用静电纺丝法制备得纤维直径100nm-500nm的纳米纤维膜；

5)将步骤4)的纳米纤维膜置于150℃烘箱中10-30min进行热交联处理。

进一步的，步骤1)的煎液制备过程为：将抗菌中药组合物原料加水煎煮3次，第一次60分钟，第二次45分钟，第三次30分钟，合并煎液，滤过，即得；

步骤2)中聚乙烯醇：羧甲基纤维素：丝素蛋白重量配比优选15:1:1；水浴用水为去离子水；水浴温度为85℃，溶解时间为60min，搅拌速度为60r/min；

步骤3)中提取物a的加量按其与聚乙烯醇的份数比1.2:15添加；

步骤4)中静电纺丝各参数设置为：纺丝距离155mm，电压为32kv，供液速度为0.8ml/min，温度20℃，湿度42％。

一种抗菌促愈合纳米纤维支架贴，采用如上所述的抗菌促愈合纳米纤维支架与背衬、隔离层复合制得。

本发明所用原料抗菌中药液各成分在纳米纤维支架中的作用为：

黄柏：清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮；主要有效成分：小檗碱、木兰花碱、黄柏碱、掌叶防己碱等多种生物碱；药理作用：对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、肺炎球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌等多种细菌有明显的抑菌效果；作用机制：可抑制ifn-γ、il-1、tnf-α、il-2等细胞因子的产生和分泌来抑制免疫反应，减轻炎症损伤，能够清除氧自由基发挥抗氧化作用，此外还能增强单核细胞的吞噬作用，提高机体的非特异性免疫力。

连翘：清热解毒，消肿散结，疏散风热；主要有效成分：连翘酯苷、连翘苷、齐墩果酸、熊果酸等；药理作用：抗氧化及广谱抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等致病菌有抑制作用；作用机制：拮抗内毒素活性，显著抑制内毒素诱发的炎症因子的过度表达，直接或者间接阻止内毒素对机体的损伤。金银花：清热解毒，疏散风热；主要有效成分：有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类；药理作用：对多种致病菌均有抑制作用；作用机制：破坏内毒素的细微结构，外用有显著抗炎作用且随时间逐渐增强，尚能显著促进白细胞的吞噬功能，使受损淋巴细胞抗体产生能力显著增强，同时还具有清除自由基、抗氧化反应的作用。

蒲公英：清热解毒，消肿散结，利尿通淋；主要有效成分：甾醇、蒲公英素；药理作用：抗病原微生物作用和对免疫功能作用；

作用机制：增强机体的巨噬细胞的吞噬系统，提高机体细胞的免疫功能，抑制氧化应激和炎症反应。

蜈蚣：息风镇痉，通络止痛，攻毒散结；主要有效成分：多种氨基酸、小分子肽、甾醇等活性物质；药理作用：抗血栓、保护血管内皮细胞、抑制炎症早期的毛细血管通透性、改善血流动力学，明显具有抗菌活性。

本发明的有益效果：

1、本发明制得的纳米纤维支架的纤维素膜透气性好，性能稳定，与创面渗液接触并可吸收渗液，然后转变为凝胶层敷于创面上，相比现有敷料能起到透气、吸收渗液的作用，本发明产品在更换时可很好的保护创面，凝胶层作为创面防护层可避免结痂造成的创面二次伤害。由于该凝胶层保持了纳米纤维膜类细胞外基质的三维结构，具有阻菌效果同时，有利于创面处细胞的爬附生长。区别于现有透气的纤薄纤维素膜静电纺制备后需要化学交联处理以增强性能，本发明纳米纤维支架在制备中采用热交联的物理交联，制备简单，相比不进行热交联处理，凝胶层形成速度放缓，凝胶层逐渐形成，更有利于药物的缓释，延长药物时效并缩短愈合周期。通过采用特定原料组合制备,使获得的纳米纤维支架在与创面结合后，能显著提高吸收创面渗液性能，且根据渗液多少，逐渐形成一定面积的凝胶层接触创面，更换时，在该凝胶层的保护下，消除了现有医用敷料使用中容易粘着伤口、更换时造成再次机械性损伤的缺陷。

2、本发明纳米纤维支架所用原料生物相容性好，无刺激；纺丝过程所用溶剂为去离子水，减少了有机溶剂用量，经济环保。

3、本发明纳米纤维支架利于创面愈合、消炎抗菌；混纺在纳米纤维中的羧甲基纤维素和抗菌中药液透过形成的凝胶层缓慢释放，共同作用于创面产生抗菌消炎发挥更好的促愈合功效。抗菌中药组合物采用特定配比的黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣，对多种细菌有明显的抑菌效果、消炎的作用，有助于伤口的愈合。本发明纳米纤维支架100nm-500nm的纳米纤维直径，具有较大的比表面积，孔径大小与细胞尺寸相匹配，形成类似于天然细胞外基质的三维网状结构，可以为细胞的黏附提供更多的附着点，使细胞更加舒展，有利于细胞的生长。

附图说明

图1为本发明实施例1的纤维sem图和直径统计图；

图2为本发明实施例2的纤维sem图和直径统计图；

图3为本发明实施例3的纤维sem图和直径统计图；

图4为本发明实施例4的纤维sem图和直径统计图；

图5为本发明实施例5的纤维sem图和直径统计图；

图6为本发明实施例6的纤维sem图和直径统计图；

图7为本发明实施例7的纤维sem图和直径统计图；

图8为加入本发明实施例1样品处理12hr后巨噬细胞吞噬作用检测结果；

图9为加入本发明实施例2样品处理12hr后巨噬细胞吞噬作用检测结果；

图10为加入本发明实施例5样品处理12hr后巨噬细胞吞噬作用检测结果；

图11为本发明各实施例的水接触角试验统计图；

图12为本发明各实施例的机械性能试验统计图；

图13为本发明实施例2的药物溶出曲线图；

图14为本发明实施例3的药物溶出曲线图；

图15为本发明实施例4的药物溶出曲线图；

图16为本发明实施例5的药物溶出曲线图；

图17为本发明实施例6的药物溶出曲线图；

图18为本发明实施例7的药物溶出曲线图。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。

实施例1

一种抗菌促愈合纳米纤维支架贴，采用如下原料制成：聚乙烯醇15g、丝素蛋白1g、羧甲基纤维素1g。

上述抗菌促愈合纳米纤维支架贴的制备方法包括如下步骤：

(1)将上述重量的聚乙烯醇、羧甲基纤维素、丝素蛋白加入双层玻璃反应釜中，采用高温循环油浴锅进行85℃水浴溶解60分钟；过程中，磁力搅拌转速设置60r/min，形成纺丝液；

(2)将上述制备的纺丝液冷却后转移至静电纺丝设备的储液槽中进行静电纺；静电纺丝条件为：纺丝距离155mm，电压为32kv，供液速度为0.8ml/min，得到抗菌、促愈纳米纤维膜；

(3)将静电纺接收板上的纳米纤维膜置于150℃烘箱中10min进行热交联处理；热交联结束后获得纳米纤维膜；

(4)将纳米纤维膜按不同的需求分切为幅宽7.5cm、5cm、1.5cm等不同规格后,在敷料贴自动包装机kc-ff-‖上与背衬，隔离层复合后，包装成产品。

实施例2

一种抗菌促愈合纳米纤维支架贴，采用如下原料制成：聚乙烯醇15g、丝素蛋白1g、羧甲基纤维素1g、由黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣制成的抗菌中药组合物1.2g；

上述抗菌促愈合纳米纤维支架贴的制备方法包括如下步骤：

(1)取黄柏20g、连翘40g、金银花20g、蒲公英20g、蜈蚣1.2g，混合，加水煎煮3次，第一次1小时，第二次45分钟，第三次30分钟，合并煎液，滤过；后将滤过液浓缩至相对密度1.10-1.15(50℃)的清膏；向清膏中加入乙醇，加入乙醇的质量是清膏质量的2-3倍，静置24h，滤过，滤液浓缩至干，即得深红棕色固体；检测得到盐酸小檗碱含量为0.16wt％，连翘苷含量为0.72wt％，得到提取物a；

(2)将上述重量的聚乙烯醇、羧甲基纤维素、丝素蛋白加入双层玻璃反应釜中，采用高温循环油浴锅进行85℃水浴溶解60分钟；过程中，磁力搅拌转速设置60r/min，形成纺丝液；

(3)将上述制备的纺丝液冷却后加入1.2g提取物a,继续搅拌至完全溶解，后将纺丝液转移至静电纺丝设备的储液槽中进行静电纺；静电纺丝条件为：纺丝距离155mm，电压为32kv，供液速度为0.8ml/min，得到抗菌、促愈纳米纤维膜；

(4)将静电纺接收板上的纳米纤维膜置于150℃烘箱中20min进行热交联处理；热交联结束后获得载药纳米纤维膜；

(5)将纳米纤维膜按不同的需求分切为幅宽7.5cm、5cm、1.5cm等不同规格后,在敷料贴自动包装机kc-ff-‖上与背衬，隔离层复合后，包装成产品。

实施例3

一种抗菌促愈合纳米纤维支架贴，同实施2的抗菌促愈合纳米纤维支架贴,所不同的是,去除羧甲基纤维素,采用如下原料制成：聚乙烯醇15g、丝素蛋白1g、由黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣制成的抗菌中药组合物1.2g；

上述抗菌促愈合纳米纤维支架贴的制备方法包括如下步骤：

(1)取黄柏20g、连翘40g、金银花20g、蒲公英20g、蜈蚣1.2g混合，加水煎煮3次，第一次1小时，第二次45分钟，第三次30分钟，合并煎液，滤过；后将滤过液浓缩至相对密度1.10-1.15(50℃)的清膏；向清膏中加入乙醇，加入乙醇的质量是清膏质量的2-3倍，静置24小时，滤过，滤液浓缩至干，即得深红棕色固体；检测得到盐酸小檗碱含量为0.16wt％，连翘苷含量为0.72wt％，得到提取物a；

(2)将上述重量的聚乙烯醇、丝素蛋白加入双层玻璃反应釜中，采用高温循环油浴锅进行85℃水浴溶解60分钟；过程中，磁力搅拌转速设置60r/min，形成纺丝液；

(3)将上述制备的纺丝液冷却后加入1.2g提取物a,继续搅拌至完全溶解，后将纺丝液转移至静电纺丝设备的储液槽中进行静电纺；静电纺丝条件为：纺丝距离155mm，电压为32kv，供液速度为0.8ml/min，得到抗菌、促愈纳米纤维膜；

(4)将静电纺接收板上的纳米纤维膜置于150℃烘箱中25min进行热交联处理；热交联结束后获得载药纳米纤维膜；

(5)将纳米纤维膜按不同的需求分切为幅宽7.5cm、5cm、1.5cm等不同规格后,在敷料贴自动包装机kc-ff-‖上与背衬，隔离层复合后，包装成产品。

实施例4

一种抗菌促愈合纳米纤维支架贴，同实施2的抗菌促愈合纳米纤维支架贴,所不同的是,去除丝素蛋白成分,采用如下原料制成：聚乙烯醇15g、羧甲基纤维素1g、由黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣制成的抗菌中药组合物1.2g；

上述抗菌促愈合纳米纤维支架贴的制备方法包括如下步骤：

(1)取黄柏20g、连翘40g、金银花20g、蒲公英20g、蜈蚣1.2g混合，加水煎煮3次，第一次1小时，第二次45分钟，第三次30分钟，合并煎液，滤过；后将滤过液浓缩至相对密度1.10-1.15(50℃)的清膏；向清膏中加入乙醇，加入乙醇的质量是清膏质量的2-3倍，静置24小时，滤过，滤液浓缩至干，即得深红棕色固体；检测得到盐酸小檗碱含量为0.16wt％，连翘苷含量为0.72wt％，得到提取物a；

(2)将上述重量的聚乙烯醇、羧甲基纤维素加入双层玻璃反应釜中，采用高温循环油浴锅进行85℃水浴溶解60分钟；过程中，磁力搅拌转速设置60r/min，形成纺丝液；

(3)将上述制备的纺丝液冷却后加入1.2g提取物a,继续搅拌至完全溶解，后将纺丝液转移至静电纺丝设备的储液槽中进行静电纺；静电纺丝条件为：纺丝距离155mm，电压为32kv，供液速度为0.8ml/min，得到载药纳米纤维膜；

(4)将静电纺接收板上的纳米纤维膜置于150℃烘箱中20min进行热交联处理；热交联结束后获得载药纳米纤维膜；

(5)将纳米纤维膜按不同的需求分切为幅宽7.5cm、5cm、1.5cm等不同规格后,在敷料贴自动包装机kc-ff-‖上与背衬，隔离层复合后，包装成产品。

实施例5

一种抗菌促愈合纳米纤维支架贴，采用如下原料制成：聚乙烯醇7.5g、丝素蛋白0.5g、羧甲基纤维素0.5g、由黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣制成的抗菌中药组合物1.2g。

上述抗菌促愈合纳米纤维支架贴的制备方法包括如下步骤：

(1)取黄柏20g、连翘40g、金银花20g、蒲公英20g、蜈蚣1.2g混合，加水煎煮3次，第一次1小时，第二次45分钟，第三次30分钟，合并煎液，滤过；后将滤过液浓缩至相对密度1.10(50℃)的清膏；向清膏中加入乙醇，加入乙醇的质量是清膏质量的2-3倍，静置24小时，滤过，滤液浓缩至干，即得深红棕色固体；检测得到盐酸小檗碱含量为0.16wt％，连翘苷含量为0.72wt％，得到提取物a；

(2)将上述重量的聚乙烯醇、羧甲基纤维素、丝素蛋白加入双层玻璃反应釜中，采用高温循环油浴锅进行85℃水浴溶解60分钟；过程中，磁力搅拌转速设置60r/min，形成纺丝液；

(3)将上述制备的纺丝液冷却后加入1.2份提取物a,继续搅拌至完全溶解，后将纺丝液转移至静电纺丝设备的储液槽中进行静电纺；静电纺丝条件为：纺丝距离155mm，电压为32kv，供液速度为0.8ml/min，得到抗菌、促愈纳米纤维膜；

(4)将静电纺接收板上的纳米纤维膜置于150℃烘箱中20min进行热交联处理；热交联结束后获得载药纳米纤维膜；

(5)将纳米纤维膜按不同的需求分切为幅宽7.5cm、5cm、1.5cm等不同规格后,在敷料贴自动包装机kc-ff-‖上与背衬，隔离层复合后，包装成产品。

实施例6

一种抗菌促愈合纳米纤维支架贴，同实施例2的抗菌促愈合纳米纤维支架贴；

该抗菌促愈合纳米纤维支架贴的制备方法不同于实施例2含有热交联,采用如下步骤：

(1)取黄柏20g、连翘40g、金银花20g、蒲公英20g、蜈蚣1.2g，混合，加水煎煮3次，第一次1小时，第二次45分钟，第三次30分钟，合并煎液，滤过；后将滤过液浓缩至相对密度1.10-1.15(50℃)的清膏；向清膏中加入乙醇，加入乙醇的质量是清膏质量的2-3倍，静置24h，滤过，滤液浓缩至干，即得深红棕色固体；检测得到盐酸小檗碱含量为0.16wt％，连翘苷含量为0.72wt％，得到提取物a；

(2)将上述重量的聚乙烯醇、羧甲基纤维素、丝素蛋白加入双层玻璃反应釜中，采用高温循环油浴锅进行85℃水浴溶解60分钟；过程中，磁力搅拌转速设置60r/min，形成纺丝液；

(3)将上述制备的纺丝液冷却后加入1.2g提取物a,继续搅拌至完全溶解，后将纺丝液转移至静电纺丝设备的储液槽中进行静电纺；静电纺丝条件为：纺丝距离155mm，电压为32kv，供液速度为0.8ml/min；得到载药纳米纤维膜；

(4)将载药纳米纤维膜按不同的需求分切为幅宽7.5cm、5cm、1.5cm等不同规格后,在敷料贴自动包装机kc-ff-‖上与背衬，隔离层复合后，包装成产品。

实施例7

该抗菌促愈合纳米纤维支架贴及其制备方法同实施例2的抗菌促愈合纳米纤维支架贴及制备，所不同的是，步骤(4)的热交联采用戊二醛化学交联处理替代。

功效观察：

一、吸水率比较

吸水率测定方法：

仪器

1培养皿:直径为(90±5)mm。

2实验室干燥箱:具有强制空气循环，温度能保持在(37±1)摄氏度。

3试验液a:由氯化钠和氯化钙的溶液组成，该溶液为含142mmol钠离子和2.5mmol的钙离子。该溶液的离子含量相当于人体血清或创面渗出液。在容量瓶中用去离子水溶解8.298g氯化钠和0.3689二水氯化钙并稀释至1l。

4天平:能称量100g，精度为0.0001g。

步骤：

1将已知质量的0.5g样品置于培养皿内；

2加入预热至(37±1)℃的试验液，其质量为供试材料的40倍±0.5g；

3移入干燥箱内，在(37±1)℃下保持30min；

4用镊子夹持样品一角或一端，悬垂30s，称量；

5对其他样品重复1至4步骤。

结果计算

以每克样品吸收溶液的平均质量表示吸收量。各实施例吸收量如下表1。

表1

由表1可知,各实施例的吸水率效果以实施例2最优,其次为实施例5。未添加抗菌中药组合物的实施例1、去除了个别成分的实施例3、4以及采用化学交联处理的实施例7的吸水率效果均劣于本发明抗菌促愈合纳米纤维支架贴。

二、抑菌效果比较

抗菌性能检测：参照fz/t73023-2006《抗菌针织品》，以振荡法测定各实施例的抗菌性能，所用菌种为金黄色葡萄球菌，样品的抗菌性能以抑菌率表示。各实施例抑菌率如下表2。

表2

由表2可知,抑菌效果方面，加入了抑菌中药组合物的各实施例，相较未添加抗菌中药组合物的实施例1，抑菌率大大提升。其中，本发明实施例2抑菌率最高，其中，去除了算甲基纤维素成分的实施例3，相较其他实施例，抑菌率有所下降。

三、促进创面愈合比较，如下表3：

表3

由表3可知,创面愈合率以实施例2效果最优，其次为实施例5。改变热交联方式的实施例7的创面愈合率，相比实施例2-6，出现明显下降，甚至比未采用热交联处理的实施例6效果差。

四、保护创面二次伤害比较

普通创面敷料与创面接触层多为pu隔离膜，在更换敷料时，容易使干燥的创面容易受到二次伤害，新生肉芽组织受损，给患者带来痛苦的同时，延缓了创面恢复时间。

现有纳米纤维膜医用敷料具备透气性和吸湿性，对创面渗液的吸收及时，但接触面干燥后依旧容易在更换敷料时造成一定程度的二次伤害，不利于创面愈合。

本发明中抗菌促愈合纳米纤维支架贴与创面接触后，吸收创面渗液，接触层的静电纺丝膜迅速变为凝胶层，根据吸收渗液的量的不同，形成凝胶的量和凝胶层面积不同。凝胶层敷于创面上，进一步放缓了有效成分的释放，且在更换时，纳米纤维支架贴的被衬层与变为凝胶层的功能层分离，间接保护了创面，确保创面不受到机械损伤。

采用各实施例支架贴的抗菌促愈合纳米纤维支架材料、及现有医用敷料，对人手背部位置的创伤面进行包扎，更换敷料时，对创面影响及创面愈合情况比较如下表4。

表4

上表4中，伤口愈合周期长为相对于实施2和5的愈合周期进行的统计。其中，实施例6的伤口愈合周期长，考虑为制备中未采用物理交联处理，使凝胶层在接触渗液时快速形成并导致药物突释，实施例6的纳米纤维支架贴几小时内药物便失效，导致无法在伤口愈合期内持久发挥作用、影响作用效果。

五、纤维形貌分析

如图1-7的纤维sem图和直径统计图，为实施例1-7的纳米纤维形貌和直径分布情况。其中，实施例1、3、4均有液滴或串珠存在，且实施例3和4尤为明显。加入有丝素蛋白、羧甲基纤维素和抗菌中药提取物的其他实施例2、5、6、7，能明显改善纳米纤维的形貌，纤维sem图中无液滴或串珠。通过直径统计图可以发现，实施例2相比实施例5、6、7直径分布更为集中，是更优的敷料材料。

六、巨噬细胞吞噬试验

1、实验步骤

1.1分离制备骨髓来源的巨噬细胞：

1.提前30min紫外照射生物安全柜。

2.处死小鼠(脱颈)，喷洒75％乙醇溶液消毒。

3.使用消毒后的剪刀、镊子沿一侧大腿环形剪开皮肤，向爪子方向剥离皮肤。

4.用镊子将腿部肌肉分开，露出股骨和胫骨(注意不要损伤骨头)。

5.用无菌剪剪开股骨上下两侧，用1ml注射器吸取预冷的mem-α培养基将骨髓冲出，直到骨髓腔发白为止。

6.对悬液进行离心，1500rpm，5min。

7.弃去上清液，向离心管中加入适量红细胞裂解液，用枪头吹打均匀，混匀后，室温放置2min，迅速加入10倍量的培养基中和，1500rpm，5min，弃上清。

8.用mem完全培养液(只加入10％fbs和1x双抗)重悬细胞，将细胞均匀接种至细胞培养皿中，加入m-csf使其终质量浓度为15-20ng/ml，孵育箱培养3d后即得到分化完全的小鼠骨髓来源的巨噬细胞。

1.2细胞吞噬能力检测：

1.弃去培养皿中的培养基，用pbs洗涤贴壁细胞。

2.提前37度预热0.25％trypsin-edta胰酶消化液15分钟，加入胰酶消化溶液(2ml)，室温放置3-5min，镜下观察消化状态。

3.待消化完全加入5-8ml完全培养液，终止消化，收集细胞于15ml离心管中，1500rpm，5min进行离心。

4.弃去上清液，用完全培养液重悬细胞并计数。

5.调整密度为4-5×105/孔的密度种在6孔板上，3-4h贴壁后,加入同种不同质量的纳米纤维膜分别剪碎，紫外照射30min后分别加入6孔板，培养12h。

6.加入直径2um红色荧光乳胶珠子，6-8ul/孔,37℃培养3小时后，收集细胞(收集时动作要轻，防止细胞损伤)，

7.用预冷的pbs洗3遍，胰酶消化细胞3-5min，facsbuffer中和洗涤，1300rpm，5min收集细胞。流式管过滤收集细胞。

8.上机检测。

2.实验结果如图8-10所示。

体外诱导小鼠骨髓源单核巨噬细胞，加入实施例1、实施例2、实施例5的样品处理12hr后，进行巨噬细胞吞噬作用检测。结果表明，含有提取物a时，可显著提高巨噬细胞的吞噬能力。实施例2效果更加明显，而实施例5中，提取物a含量过高时，对巨噬细胞的吞噬作用有抑制作用。

七、水接触角试验

水接触角小的材料亲水性更好，有利于细胞的爬附和生长。通过图11可以看出，实施例2-7相比实施例1，水接触角变小，其中实施例2、3、5、6亲水性更好。由此可见，水接触角实验可能受到其中加入的抑菌中药组合物的影响，亲水性较好的四个实施例中，由于实施例5中的抑菌中药组合物含量最高，其水接触角最小，相比实施例2，实施例6未进行交联，亲水性没有降低，而实施例7由于采用了化学交联，亲水性产生了较大变化，不利于细胞的爬附和生长。

八、机械性能试验

将实施例1-7的样品切割成1cm×3cm的长条，并测量其厚度，然后将长条置入拉力试验仪中，测试其力学性能，结果如图12。由图12可知，实施例2在所有材料中，综合力学性能最好。相比实施例2，实施例5应力小而应变大，材料稍软。而实施例1应力大而应变小，材料太硬脆；实施例3和4由于缺少丝素蛋白或纤维素的加入，材料强度较差，不能承受较大的力；实施例6未进行交联，材料应力和应变指标都较差；实施例7采用了化学交联，虽然延展性改善，但是应力变差。

九、药物释放试验

试验方案

1)选取实施例2为样品，准确称取取样品0.5g，置于盛有50mlpbs缓冲液(ph＝7.2，0.01m)的容器中；

2)将容器置于37℃恒温水浴中震荡，速度90rpm；

3)分别于30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h和72h时准确量取溶液3ml(量取完成后再向剩余溶液中加入3mlpbs缓冲液)，用高效液相色谱法检测其中连翘苷、盐酸小檗碱的含量。

含量测定

2.1、连翘苷

照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版通则0512)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(25∶75)为流动相；检测波长为278nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取各溶出取样时间点样品作为供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2、盐酸小檗碱

照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版通则0512)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.033mol/l磷酸二氢钾溶液(35∶65)为流动相；检测波长为347nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含8μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取各溶出取样时间点样品作为供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3、试验结果如图13-图18所示。

试验表明，实施例2的纳米纤维中含有的连翘苷4h溶出率达到80％，盐酸小檗碱溶出率达到35％。连翘苷和盐酸小檗碱均达到溶出平台期。

进一步对比其他实施例的试验溶出曲线可以看出，本发明实施例2和实施例5曲线较平缓，说明药物是从纳米纤维膜中缓慢释放出来的，实施例2比实施例5的最终药物溶出率高。实施例6曲线最陡，药物释放最快，由于未进行交联存在药物突释现象；实施例7采用化学交联，药物释放速度比采用热交联的实施例2和实施例5快，而实施例3和实施例4由于纳米纤维中分别缺少纤维素和丝素，药物缓释效果较差。综上所述，在药物释放试验中，实施例2缓释效果最好，实施例5次之，未交联的实施例6最差。