一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的制备及复苏方法与流程

1.本发明涉及干细胞领域，特别涉及一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的制备及复苏方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)是一种来源于发育早期中胚层的多能干细胞，在特定环境下，理论上可以诱导分化为人体任何一种组织细胞，例如脂肪、骨、软骨、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。间充质干细胞主要来源于人体中广泛存在的间质组织，特别是骨髓、脂肪、脐带和胎盘等，由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。间充质干细胞可以分泌多种细胞因子，大量研究表明这些细胞因子能在一定程度上促进皮肤细胞生长、改善细胞生长微环境、促进伤口愈合、延缓衰老、改善皮肤生长状态等作用，因此间充质干细胞已被广泛应用于美容整形等领域，如去疤痕、填皱纹、增肤质、祛色斑、抗衰老和丰胸等，由于具有良好的美容效果和极小的副作用，间充质干细胞受到了人们的重视，是目前研究较多的一种干细胞美容技术。
3.现有技术是用普通培养瓶培养间充质干细胞，并收集合并多代细胞培养上清液，并对上清液进行过滤得到细胞因子。该方法得到的细胞因子含量低，且该方法需要收集多代细胞培养基，效率低，且多代收集的方法制备细胞因子，产品均一性较难保证。此外，该方法制备所得细胞因子为液态，常温下易降解导致保存时间短，需低温保存，加大保存和运输难，这就阻碍了它的推广和应用。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的间充质干细胞培养上清液中的细胞因子含量低以及难以长时间保存的问题，本发明的目的在于提供一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的制备及复苏方法。
5.为实现上述目的，本发明的技术方案为：
6.一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法，包括以下步骤，
7.干细胞的培养，用含有自体血清的dmem培养基培养人间充质干细胞；
8.上清液的收集，收集低传代人间充质干细胞培养上清液；
9.冻干粉的制备，将收集到的上清液离心，在去除离心管上层30％～33％的上清液后，将离心管中剩余的上清液转移至一收集管中，弃沉淀，再对所述收集管中的上清液低温冻存凝固后，再真空冷冻制得冻干粉。
10.作为对本发明的进一步限定，在对所述收集管中的上清液低温冻存凝固之前，在所述收集管中的上清液中加入占总体积18％的甘露醇、占总体积3％的右旋糖酐、占总体积1％的人白蛋白、占总体积0.7％的维生素c和占总体积10％的丙二醇后震荡混匀。
11.作为对本发明的进一步限定，所述低传代指的是人间充质干细胞传代在5代以内，
所述dmem培养基含有10vol％自体血清以及青霉素loou/ml和链霉素loou/ml。
12.作为对本发明的进一步限定，所述低温冻存凝固是在温度为
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80℃的超低温冰箱中进行，所述真空冷冻是在真空度1pa、冷温度
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70℃的真空冷冻机中进行。
13.作为对本发明的进一步限定，所述干细胞的培养包括人间充质干细胞分离制备和人间充质干细胞的传代培养。
14.作为对本发明的进一步限定，所述人间充质干细胞分离制备的步骤为：将足月产的婴儿脐带从保存液中取出，放入含有75vol％酒精的无菌培养皿内，浸泡30s
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1min，再用0.9％的生理盐水洗涤脐带组织，直至无明显血块，剪取脐带使每段2
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3cm；将脐带纵向剖开，剔除1根脐静脉血管和2根脐动脉血管，撕取华通胶；用生理盐水充分洗涤华通胶3次后，将其剪碎成1mm3～3mm3大小的组织块；将组织块接种于培养瓶中，放置于37℃，5vol％的co2的培养箱中贴壁2h，添加15ml无血清完全培养基，置于培养箱中培养，培养最初7d，保持培养瓶绝对静止；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出；12d细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移至新的t175培养瓶中培养以备进行人间充质干细胞的传代培养；
15.作为对本发明的进一步限定，所述人间充质干细胞的传代培养的步骤为：将t175培养瓶中的人脐带间充质干细胞加入40ml dmem培养基，放入37℃，5％co2培养箱中培养，当生长到85
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90％汇合度时，收集培养上清液，将人脐带间充质干细胞与新鲜dmem培养基混合，继续用于细胞的扩大培养，如此反复至细胞传代至5代以内后，所产生的全部细胞培养上清液可供收集。
16.另一方面，本发明提供一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉，根据上述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法制得的人间充质干细胞培养上清液冻干粉。
17.再一方面，本发明提供一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的复苏方法，将上述的离心管上层30％～33％的上清液与上述的冻干粉混合摇匀。
18.所述离心管上层30％～33％的上清液与所述的冻干粉按照3ml：50mg的比例混合。
19.采用上述技术方案，由于人间充质干细胞传代培养是取出上清液之后进行的，因此相同传代数可以得到更多的上清液；另外由于上清液离心后是去除了离心管上层30％～33％部分，再进行冻干制粉的，因此最终得到的冻干粉中细胞因子的浓度更高，而去除的30％～33％部分上清液其中含有的细胞因子较少，同时也可以降低冻干粉冻干制作过程的工作量，而去除的30％～33％部分上清液用于对冻干粉进行复苏，可以利用细胞因子生长环境的上清液更大程度保持细胞因子的活性，提高使用效果。
附图说明
20.图1为本发明第一方面实施例的方法流程图；
21.图2为本发明第一方面实施例中人间充质干细胞培养上清液冻干制粉的流程图。
具体实施方式
22.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
23.本发明第一方面的实施例提供一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法，如图1所示，其具体包括以下步骤，
24.步骤101，干细胞的培养，用含有自体血清的dmem培养基培养人间充质干细胞；
25.其中，所用的dmem培养基具体指的是，含有10vol％自体血清以及青霉素loou/ml和链霉素loou/ml的dmem培养基。而本实施例所称的干细胞的培养包括两个具体步骤，即步骤1011和步骤1012。
26.步骤1011，人间充质干细胞分离制备，其具体为：将足月产的婴儿脐带从保存液中取出，放入含有75vol％酒精的无菌培养皿内，浸泡30s
‑
1min，再用0.9％的生理盐水洗涤脐带组织，直至无明显血块，剪取脐带使每段2
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3cm；将脐带纵向剖开，剔除1根脐静脉血管和2根脐动脉血管，撕取华通胶；用生理盐水充分洗涤华通胶3次后，将其剪碎成1mm3～3mm3大小的组织块；将组织块接种于培养瓶中，放置于37℃，5vol％的co2的培养箱中贴壁2h，添加15ml无血清完全培养基，置于培养箱中培养，培养最初7d，保持培养瓶绝对静止；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出；12d细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移至新的t175培养瓶中培养以备进行人间充质干细胞的传代培养；
27.其中，脐带是符合伦理道德规范下产妇自愿捐献的，产妇hbv抗原、抗hcv抗体、抗hiv抗体、抗梅毒螺旋体抗体、htlv、eb病毒、hcmv等检测项目均为阴性，且无既往病史和家族史。
28.步骤1012，人间充质干细胞的传代培养，其具体为：将步骤1011中t175培养瓶中的人脐带间充质干细胞加入40ml培养液(即上述的dmem培养基)，放入37℃，5vol％co2培养箱中培养，当生长到85
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90％汇合度时，收集培养上清液，将去除上清后收集的人脐带间充质干细胞与新鲜培养基(即上述的dmem培养基)混合，继续进行人间充质干细胞的扩大培养，如此反复至细胞传代至5代以内后，优选进行到第4代，以上多次传代所产生的全部细胞培养上清液可用于收集。
29.步骤102，上清液的收集，收集低传代人间充质干细胞培养上清液；
30.具体指的是，收集步骤1012中人间充质干细胞多次传代培养过程中所产生的全部的人间充质干细胞培养上清液。
31.步骤103，冻干粉的制备，将步骤102中收集到的上清液进行离心，在去除离心管上层30％～33％的上清液后，将离心管中剩余的上清液转移至一收集管中，同时丢弃离心管中的沉淀，再对该收集管中的上清液低温冻存凝固后，再真空冷冻制得冻干粉；步骤103具体包括有步骤1031、步骤1032、步骤1033和步骤1034，如图2所示。
32.其中，步骤1031，上清液离心，具体为：将步骤102中收集到的全部的上清液装入容量500ml的离心管中，每次体积在450ml为宜，在4℃，800g下离心15min。
33.步骤1032，上清液分离，具体为：将离心管上层约占总上清液体积30％～33％部分的上清液用无菌枪头抽取出来转移至一收集管内收集，并标记为a液，该a液在
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20℃环境下低温保存备用；将离心管中剩余的上清液用无菌枪头从抽取出来转移至一收集管内收集，并标记为b液，丢弃离心管中的沉淀。并且可以理解的是，离心管经过离心后，细胞因子经过浓缩会聚集在离心管的下层，而离心管上层的上清液中所含的细胞因子较少，而本实施例优选从离心管上层取出占总上清液体积30％的部分作为a液，而在另一个实施例可以取出更多，但总量不宜超过33％，因为取出过多的上清液容易同时将富含细胞因子的部分一并
取出，从而影响冻干粉中细胞因子的浓度。
34.步骤1033，上清液冻凝，具体为：首先向收集管中的b液中加入终浓度为18vol％甘露醇、3vol％右旋糖酐、1vol％人白蛋白、0.7vol％维生素c和10vol％丙二醇的冻存保护剂后，震荡混匀；其后再对该收集管置于温度为
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80℃的超低温冰箱中保存18h进行低温冻存凝固。
35.步骤1034，上清液冻干，具体为：将冻存凝固的b液，放入真空度1pa、冷温度
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70℃的真空冷冻机中抽真空冷冻20h，再升华干燥，除去冰晶后制得冻干粉，并在
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20℃环境保存。
36.本发明第二方面的实施例提供一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉，该冻干粉是根据上述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法制得的人间充质干细胞培养上清液冻干粉。
37.本发明第三方面的实施例提供一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的复苏方法，具体为：去上述的离心管上层30％的上清液(即a液)与上述的冻干粉混合摇匀。
38.并且本实施例优选离心管上层30％的上清液(即a液)与冻干粉按照3ml：50mg的比例混合。市场上现有的大多数技术使用配好的溶媒或直接用生理盐水来复苏，这些技术对冻干粉中细胞因子的激活非常不利，溶媒配比浓度需要恰到好处，浓度高会损失很多活性因子，浓度低很多活性因子无法被激活，而生理盐水激活的因子激活无法被激活。因此我们使用培养过干细胞的上清液来复苏，培养基可以给干细胞还有其他活性因子创造很好的生长环境，我们在提取完干细胞后及活性因子后将其收集备用来复苏冻干粉，会给其创造一个很好的复苏环境，所以以此方案，复苏率比较高，同时培养基及其活性因子的混合很适宜人身体皮肤环境，也有利于皮肤的吸收。
39.以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。