一种磁性空心蛋白微球及其制备方法和应用

1.本发明涉及药物递送系统技术领域，更具体地，涉及一种磁性空心蛋白微球及其制备方法和应用。


背景技术：

2.动脉粥样硬化是以脂质沉积、单核
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巨噬细胞浸润及斑块形成为主要病理特征的炎症性疾病。动脉粥样硬化斑块会使动脉管壁不断增厚、失去弹性，随着斑块的继续增大，会造成管腔狭窄，这是引起缺血性脑血管疾病的重要病理基础。斑块易损性与缺血事件密切相关，易损斑块破裂，继发形成血栓或溃疡。在高速血流冲击下血栓或相关碎片脱落形成栓塞，是患者发生缺血性脑卒中的重要原因。因此，斑块易损性的准确评估对动脉粥样硬化的防治以及预防缺血脑卒中事件的发生有着重要的意义。
3.随着材料科学的迅速发展，仅用于药物递送的载体已无法满足人们对疾病精准治疗的要求，因此，同时具备临床诊断和治疗功能的诊疗一体化载体受到科研人员的广泛关注。诊疗一体化载体通过对药物载体和疾病组织的实时监控，及时调整治疗方案，增强治疗的高效性和准确性，实现精准治疗。基于此，设计和制备一种具有精确诊断和靶向治疗的诊疗一体化平台十分重要。中国专利cn109498592a公开了一种空心蛋白缓释微球及其制备方法，虽然其弹性外壳可以实现力的缓冲，抗压性强，递送过程不易破裂，可靶向递药，但其粒径较大，无法进行血管给药以用于动脉粥样硬化诊断或治疗，且无法实现诊断和靶向治疗的诊疗一体化。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种磁性空心蛋白微球。
5.本发明的第二个目的在于提供所述磁性空心蛋白微球的制备方法。
6.本发明的第三个目的在于提供所述磁性空心蛋白微球的应用。
7.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
8.一种磁性空心蛋白微球，包括外层结构、中间层结构及空腔结构，所述空腔结构置于中间层结构内部，所述中间层结构外表面设有外层结构；所述外层结构为具有刺激响应特性的交联蛋白膜，所述中间层结构为负载磁性材料和药物的载药层，所述空腔结构由稳定性气体填充形成；所述磁性空心蛋白微球粒径为2～10μm。
9.本发明的磁性空心蛋白微球是以空心蛋白微球为载体，通过在载药层包载磁性材料和药物可形成具有影像诊断和靶向治疗的诊疗一体化载体，具有很好的磁靶向和造影功能，在外部刺激下磁性空心蛋白微球还能够释放药物，所述磁性空心蛋白微球粒径为2～10μm，可血管给药，用于动脉粥样硬化等疾病的的诊断和靶向治疗。
10.优选地，所述磁性材料为fe3o4纳米颗粒、fe2o3纳米颗粒或金属掺杂铁氧体纳米材料中的一种或多种。
11.进一步优选地，所述金属掺杂铁氧体纳米材料为纳米钴铁氧体。
12.优选地，所述药物为小分子药物、大分子药物或纳米药物中的一种或多种。例如药物紫杉醇。
13.本发明还提供上述任一所述磁性空心蛋白微球的制备方法，，包括如下步骤：
14.s1.取浓度为10～20％的蛋白溶液，加入磁性材料和药物，混匀；
15.s2.向步骤s1混合溶液中加入含表面活性剂的有机溶剂，混匀；蛋白溶液和含表面活性剂的有机溶液的体积比为1：3～8；
16.s3.向步骤s2的混合液中持续通入气体并进行均质搅拌以形成乳液；均质搅拌速度为18.0～20.0krpm；
17.s4.在步骤s3的乳液中逐滴加入交联剂溶液以形成稳定的磁性空心蛋白微球溶液；所述交联剂浓度为20％～40％；
18.s5.将步骤s4制备的磁性空心蛋白微球溶液离心，除去上层液体，即可获得负载了磁性材料和药物的磁性空心蛋白微球。
19.本发明以蛋白为材料，利用乳液法将磁性材料和小分子药物包载于蛋白微球中，并采用化学交联法进一步固化，通过控制蛋白溶液的浓度，水相和油相的比例，均质搅拌的速度及交联剂的浓度成功制备了了粒径小于10μm的负载磁性材料和药物的磁性空心蛋白微球。磁性空心蛋白微球具有很好的磁靶向和造影功能，在外部刺激下磁性空心蛋白微球还能够释放药物，磁性空心蛋白微球在体外实验中表现出良好的动脉粥样硬化斑块检测效果，可作为动脉粥样硬化的诊疗一体化平台。
20.优选地，步骤s1所述蛋白溶液浓度为20％。
21.优选地，步骤s1所述磁性材料和药物的终浓度为1～5mg/ml(优选为1mg/ml)；所述磁性材料和药物的质量比例为1：1。
22.优选地，步骤s2所述表面活性剂为司班80。
23.进一步优选地，步骤s2中蛋白溶液和含表面活性剂的有机溶液的体积比为1：6。
24.优选地，步骤s3通入气体为具有生物相容性的气体。
25.进一步优选地，所述气体为六氟化硫气体。
26.优选地，步骤s3中均质搅拌的速度为18.0krpm。
27.优选地，步骤s4所述交联剂为对苯二甲酰氯。
28.进一步优选地，步骤s4所述交联剂浓度为25％。
29.优选地，步骤s5离心速度为0.5krpm～2.0krpm(优选1.0krpm)。
30.本发明的磁性空心蛋白微球具有很好的磁靶向和造影功能，在外部刺激下磁性空心蛋白微球还能够释放药物，磁性空心蛋白微球在体外实验中表现出良好的动脉粥样硬化斑块检测效果，可作为动脉粥样硬化的诊疗一体化平台。因此，本发明还提供上述任一所述磁性空心蛋白微球在制备动脉粥样硬化斑块靶向诊断产品中的应用。
31.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
32.本发明的磁性空心蛋白微球是以空心蛋白微球为载体，通过包载磁性材料和药物可形成具有影像诊断和靶向治疗的诊疗一体化载体，粒径为2～10μm，在外部刺激下磁性空心蛋白微球还能够释放药物，可用于动脉粥样硬化的诊断和靶向治疗，具有较大的应用前景。
附图说明
33.图1为本发明的磁性空心蛋白微球的结构示意图。
34.图2为实施例2制备得到的空心蛋白微球的光学显微镜图。
35.图3为实施例3制备得到的空心蛋白微球的光学显微镜图。
36.图4为实施例4制备得到的空心蛋白微球的光学显微镜图。
37.图5为实施例5制备得到的空心蛋白微球的光学显微镜图。
38.图6为实施例6制备得到的磁性空心蛋白微球的光学显微镜图。
39.图7为空心蛋白磁性微球磁响应特性结果。
40.图8为实施例6制备的磁性空心蛋白微球进行体外动脉粥样硬化斑块的超声成像检测结果。
41.图9为实施例6制备的磁性空心蛋白微球超声刺激释放药物曲线。
具体实施方式
42.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
43.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
44.实施例1
45.如图1所示，一种磁性空心蛋白微球，包括外层结构1、中间层结构2及空腔结构3，所述空腔结构3置于中间层结构内部，所述中间层结构2外表面设有外层结构1；所述外层结构1为具有刺激响应特性的交联蛋白膜，所述中间层结构2为负载磁性材料和药物的载药层2，所述空腔结构3由稳定性气体填充形成。所述具有刺激响应特性的交联蛋白膜由牛血清蛋白与交联剂发生交联反应后形成的外壳结构；所述磁性材料为fe3o4纳米颗粒，所述药物为紫杉醇；所述稳定性气体为六氟化硫气体。
46.实施例2
47.分别将20wt％，30wt％和40wt％bsa溶液加入到10％(v/v)司班80甲苯溶液中，bsa溶液和司班80甲苯溶液的体积比为1：10。在持续通入六氟化硫气体的条件下进行均质搅拌，搅拌速度为10.0krpm，然后缓慢滴加交联剂对苯二甲酰氯溶液，交联剂浓度为25％，使形成稳定的空心蛋白微球。1.0krpm条件下离心、除去上层溶液，即可获得空心蛋白微球。图2为空心蛋白微球的光学显微镜图。(a)显示bsa浓度为20wt％时空心蛋白微球的平均粒径为16.8μm；(b)显示bsa浓度为30wt％时空心蛋白微球的平均粒径为25.3μm；(c)显示bsa浓度为40wt％时空心蛋白微球的平均粒径为35.7μm。选择bsa浓度为20wt％进行后续试验。
48.实施例3
49.将20wt％bsa溶液加入到10％(v/v)司班80甲苯溶液中，bsa溶液和司班80甲苯溶液的体积比为1：10。在持续通入六氟化硫气体的条件下进行均质搅拌，搅拌速度为10.0krpm，然后缓慢滴加交联剂对苯二甲酰氯溶液，交联剂浓度分别为25％和50％，使形成稳定的空心蛋白微球。1.0krpm条件下离心、除去上层溶液，即可获得空心蛋白微球。图3为空心蛋白微球的光学显微镜图。(a)显示交联剂浓度为25wt％时空心蛋白微球的平均粒径为16.8μm；(b)显示交联剂浓度为50wt％时空心蛋白微球的平均粒径为20.5μm。选择交联剂
浓度为25％进行后续试验。
50.实施例4
51.将20％bsa溶液加入到10％(v/v)司班80甲苯溶液中，bsa溶液和司班80甲苯溶液的体积比为1：10。在持续通入六氟化硫气体的条件下进行均质搅拌，搅拌速度分别为4.0krpm，10.0krpm和18.0krpm，然后缓慢滴加交联剂对苯二甲酰氯溶液，交联剂浓度为25％，使形成稳定的空心蛋白微球。1.0krpm条件下离心、除去上层溶液，即可获得空心蛋白微球。图4为空心蛋白微球的光学显微镜图。(a)显示搅拌速度为4.0krpm时空心蛋白微球的平均粒径为28.2μm；(b)显示搅拌速度为10.0krpm时空心蛋白微球的平均粒径为16.8μm；(c)显示搅拌速度为18.0krpm时空心蛋白微球的平均粒径为12.5μm。选择均质搅拌速度为18.0krpm进行后续试验。
52.实施例5
53.将20％bsa溶液加入到10％(v/v)司班80甲苯溶液中，bsa溶液和司班80甲苯溶液的体积比分别为1：10和1：6。在持续通入六氟化硫气体的条件下进行均质搅拌，搅拌速度为18.0krpm，然后缓慢滴加交联剂对苯二甲酰氯溶液，交联剂浓度分别为25％，使形成稳定的空心蛋白微球。1.0krpm条件下离心、除去上层溶液，即可获得空心蛋白微球。图5为空心蛋白微球的光学显微镜图。(a)显示bsa溶液和司班80甲苯溶液的体积比为1：10时空心蛋白微球的平均粒径为12.5μm；(b)显示bsa溶液和司班80甲苯溶液的体积比为1：6时空心蛋白微球的平均粒径为7.0μm。选择蛋白溶液和司班80甲苯溶液的体积比为1：6进行后续试验。
54.实施例6
55.负载磁性材料fe3o4纳米颗粒和药物紫杉醇的磁性空心蛋白微球的制备：在浓度为20％的bsa溶液中加入终浓度为1mg/ml的磁性材料和药物(质量比1:1)，搅拌均匀，继续加入含司班80(10％(v/v))的甲苯溶液，bsa和司班80甲苯溶液的体积比为1：6。在持续通入六氟化硫气体的条件下进行均质搅拌，搅拌速度为18.0krpm，然后缓慢滴加交联剂对苯二甲酰氯溶液，交联剂浓度为25％，使形成稳定的磁性空心蛋白微球；1.0krpm条件下离心、除去上层溶液，即可获得磁性空心蛋白微球。图6为磁性空心蛋白微球的光学显微镜图，结果显示磁性空心蛋白微球具有规则的球形结构，粒径小于10μm。
56.使用磁学性能测量系统在37℃条件下对不同磁颗粒含量的空心蛋白磁性微球粉末进行测试分析，外加磁场为0～10000oe，记录饱和磁化强度数据。结果如图7所示，空心蛋白磁性微球具有磁响应特性。
57.实施例7
58.负载磁性材料fe2o3纳米颗粒和药物紫杉醇的磁性空心蛋白微球的制备：在浓度为10％的bsa溶液中加入终浓度为1mg/ml的磁性材料和药物(质量比1:1)，搅拌均匀，继续加入含司班80(8％(v/v))的甲苯溶液，bsa和司班80甲苯溶液的体积比为1：8。在持续通入六氟化硫气体的条件下进行均质搅拌，搅拌速度为20.0krpm，然后缓慢滴加交联剂对苯二甲酰氯溶液，交联剂浓度为20％，使形成稳定的磁性空心蛋白微球；1.0krpm条件下离心、除去上层溶液，即可获得磁性空心蛋白微球。结果显示磁性空心蛋白微球具有规则的球形结构，粒径小于10μm。
59.实施例8
60.负载磁性纳米材料钴铁氧体和药物紫杉醇的磁性空心蛋白微球的制备：在浓度为
15％的bsa溶液中加入终浓度为1mg/ml的磁性材料和药物(质量比1:1)，搅拌均匀，继续加入含司班80(12％(v/v))的甲苯溶液，bsa和司班80甲苯溶液的体积比为1：4。在持续通入六氟化硫气体的条件下进行均质搅拌，搅拌速度为19.0krpm，然后缓慢滴加交联剂对苯二甲酰氯溶液，交联剂浓度为40％，使形成稳定的磁性空心蛋白微球；1.0krpm条件下离心、除去上层溶液，即可获得磁性空心蛋白微球。结果显示磁性空心蛋白微球具有规则的球形结构，粒径小于10μm。
61.实施例9
62.体外动脉粥样硬化斑块的检测：将1％w/v的琼脂糖溶液倒入容器中，埋入内部固定了凝胶碎片的硅胶管，以模拟动脉粥样硬化斑块，待水凝胶凝固后便形成了模拟血管斑块的假体。向模拟血管的通道内注满实施例6的磁性空心蛋白微球溶液，然后采用便携式超声造影仪进行造影。结果如图8所示，通入磁性空心蛋白微球溶液后，斑块假体呈现高的超声信号，证明磁性空心蛋白微球能够通过超声造影检测动脉粥样硬化斑块。
63.实施例10
64.超声介导磁性空心蛋白微球释放药物：称取0.5克载紫杉醇的磁性空心蛋白微球(实施例6)于离心管中并加入1ml超纯水溶解，然后应用超声(40khz，3.6w/cm2)刺激药物释放，在设定的时间点取上清液进行检测。结果如图9所示，磁性空心蛋白微球经超声刺激可以释放药物。