一种水溶性茯苓三萜的制备方法及应用与流程

本发明属于生物化学领域，更具体地，涉及一种水溶性茯苓三萜的制备方法及应用。

背景技术：

茯苓为多孔菌科真菌poriacocosschw.)wolf的干燥菌核，为药食两用的传统中药。是拟层孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，常寄生在松树根上，形如甘薯，球状，外皮淡棕色或黑褐色，内部粉色或白色，精制后称为白茯苓或者云苓。茯苓主要主产于安徽、江西、江苏、浙江等地。具有渗湿利水，益脾和胃，宁心安神的功效。

茯苓的主要活性成分为多糖、三萜类化合物等。现代研究证明茯苓三萜类成分具有免疫调节、抗炎和抗肿瘤等作用，其主要活性成分有茯苓酸、土莫酸、去氢土莫酸和去氢茯苓酸等。因此，茯苓总三萜的研究开发具有重要的经济效益和社会效益。虽然茯苓三萜类具有极其广泛的药理活性，但由于三萜类化合物强疏水性导致其利用率低。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种水溶性茯苓三萜的制备方法及应用，其目的在于发现有别于其他方法制备的水溶性茯苓三萜，水体系提取水溶性茯苓三萜在炎症预保护方面的效果显著提高，可应用于炎症预保护食品及药品的制备，由此解决现有的茯苓多糖抗炎作用不够明确、效果不理想的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种水溶性茯苓三萜的制备方法，包括以下步骤：

(1)从茯苓皮中提取茯苓三萜精制提取物；

(2)将步骤(1)获取的茯苓皮三萜精致提取物，按照料液比1:10-1:160加入含oh^-0.05-0.25mol/l的强碱的水溶液，超声混合5-10min，维持温度在50-90℃反应直至ph值稳定在7-8之间，获得反应混合物；

(3)将步骤(2)中获得的反应混合物固液分离后保留液相，蒸发溶剂获得所述水溶性茯苓三萜。

优选地，所述水溶性茯苓三萜的制备方法，其步骤(1)所述茯苓三萜精制提取物为茯苓皮浸膏的乙酸乙酯萃取物。

优选地，所述水溶性茯苓三萜的制备方法，其所述茯苓皮浸膏的乙酸乙酯萃取物的制备包括以下步骤：

(1-1)将茯苓皮洗净烘干粉碎得到茯苓皮粉末，将所述茯苓皮粉末按料液比1：20(w/v)加入正丁醇-水两相溶剂于60℃回流提取2h，过滤除去滤渣得滤液，分液得取正丁醇相；所述正丁醇-水两相溶剂中正丁醇和水的体积比例在1：1之间；

(1-2)将步骤(1-1)中获得的正丁醇相在50℃下减压旋蒸浓缩，得到所述茯苓皮采用正丁醇浸提浓缩获得的浸膏；

(1-3)向步骤(1-2)中获得的所述茯苓皮采用正丁醇浸提浓缩获得的浸膏中加入乙酸乙酯萃取，萃取两次，合并乙酸乙酯萃取液；

(1-4)将步骤(1-3)乙酸乙酯萃取液浓缩干燥并粉碎获得所述茯苓皮乙酸乙酯提取物粉末。

优选地，所述水溶性茯苓三萜的制备方法，其步骤(2)所述反应温度为80℃。

优选地，所述水溶性茯苓三萜的制备方法，其步骤(2)所述料液比为1:40。

优选地，所述水溶性茯苓三萜的制备方法，其步骤(2)反应2-10h。

优选地，所述水溶性茯苓三萜的制备方法，其步骤(2)所述反应时间为4h。

优选地，所述水溶性茯苓三萜的制备方法，其步骤(2)所述强碱为氢氧化钠，其浓度为0.15mol/l。

按照本发明的另一个方面，提供了一种水溶性茯苓三萜，其按照本发明提供的制备方法制备。

按照本发明的另一个方面，提供了所述水溶性茯苓三萜的应用，其特征在于，应用于制备炎症预保护食品及药品。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明提供的水溶体系制备的水溶性茯苓三萜，相对于其他方法制备的水溶性茯苓三萜，在炎症预保护应用中，效果提高40％以上，具备明显的验证与保护作用，且细胞毒性显示具有良好的安全性，适合作为炎症预保护药物甚至是食品。

附图说明

图1是实施例1制备水溶性茯苓三萜的含量测定结果；

图2是实施例2制备水溶性茯苓三萜的含量测定结果；

图3是实施例3制备水溶性茯苓三萜的含量测定结果；

图4是实施例4制备水溶性茯苓三萜的含量测定结果；

图5是实施例7测定本发明制备的水溶性茯苓三萜毒性结果；

图6是实施例8测定实施例5制备的水溶性茯苓三萜对lps引起no产生的抑制率效果；

图7是实施例9测定实施例5制备的水溶性茯苓三萜对lps引起炎症因子tnf-α分泌量的抑制率效果；

图8是实施例9测定实施例5制备的水溶性茯苓三萜对lps引起炎症因子il-1β分泌量的抑制率效果；

图9是实施例9测定实施例5制备的水溶性茯苓三萜对lps引起炎症因子il-6分泌量的抑制率效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的水溶性茯苓三萜的制备方法，包括以下步骤：

(1)从茯苓皮中提取茯苓三萜精制提取物；优选所述茯苓三萜精制提取物为茯苓皮浸膏的乙酸乙酯萃取物；具体包括以下步骤：

(1-1)将茯苓皮洗净烘干粉碎得到茯苓皮粉末，将所述茯苓皮粉末按料液比1:10-50(w/v)加入正丁醇-水两相溶剂于40-80℃回流提取0.5-3h，过滤除去滤渣得滤液，分液得取正丁醇相；所述正丁醇-水两相溶剂中正丁醇和水的体积比例在0.3-3:1之间；

(1-2)将步骤(1-1)中获得的正丁醇相在40-60℃下减压旋蒸浓缩，得到所述茯苓皮采用正丁醇浸提浓缩获得的浸膏；

(1-3)向步骤(1-2)中获得的所述茯苓皮采用正丁醇浸提浓缩获得的浸膏中加入乙酸乙酯萃取，萃取两次，合并乙酸乙酯萃取液；

(1-4)将步骤(1-3)乙酸乙酯萃取液浓缩干燥并粉碎获得所述茯苓皮乙酸乙酯提取物粉末；

(2)将步骤(1)获取的茯苓皮三萜精致提取物，按照料液比1:20-1:40加入含oh^-0.1-0.15mol/l的强碱的水溶液，超声混合5-10min，维持温度在70-90℃反应4h，直至ph值稳定在7-8，获得反应混合物，所述强碱为氢氧化钠。

(3)将步骤(2)中获得的反应混合物固液分离后保留液相，蒸发溶剂获得所述水溶性茯苓三萜。

本发明提供的方法，水溶性茯苓三萜的得率高，得到浓度为5-7mg/ml的茯苓三萜水溶液，冻干得到水溶性三萜粉末。

本发明提供的水溶性茯苓三萜，相对于其他方法制备的，例如醇溶体系制备的茯苓三萜化合物，具有良好的炎症预保护的生物活性，能应用于制备炎症预保护食品及药品。

以下为实施例：

本发明实施例采用的茯苓三萜精制提取物，皆为茯苓皮浸膏的乙酸乙酯萃取物，制备方法如下：

(1-1)将茯苓皮洗净烘干粉碎得到茯苓皮粉末，将所述茯苓皮粉末按料液比1:20(w/v)加入正丁醇-水两相溶剂于60℃回流提取2h，过滤除去滤渣得滤液，分液得取正丁醇相；所述正丁醇-水两相溶剂中正丁醇和水的体积比例为1:1；

(1-2)将步骤(1-1)中获得的正丁醇相在50℃下减压旋蒸浓缩，得到所述茯苓皮采用正丁醇浸提浓缩获得的浸膏；

(1-3)向步骤(1-2)中获得的所述茯苓皮采用正丁醇浸提浓缩获得的浸膏中加入乙酸乙酯萃取，萃取两次，合并乙酸乙酯萃取液；

(1-4)将步骤(1-3)乙酸乙酯萃取液浓缩干燥并粉碎获得所述茯苓皮乙酸乙酯提取物粉末。

实施例1

一种水溶性茯苓三萜的制备方法，包括以下步骤：

(1)从茯苓皮中提取茯苓三萜精制提取物；

(2)取步骤(1)获取的茯苓皮三萜精致提取物1g，按照料液比1:40加入40ml、ph值为0.15mol/l的naoh水溶液，超声5-10min混匀，维持温度分别在50、60、70、80、90摄氏度下，水浴反应4h，获得反应混合物；测得ph值分别为7-8之间。

(3)将步骤(2)中获得的反应混合物10000-11000r/min离心取上清液，测定总三萜浓度，结果如图1所示。蒸发溶剂获得所述水溶性茯苓三萜。

在反应温度50、60、70、80、90摄氏度条件下，测得的三萜浓度分别为2.34、2.97、3.31、4.05、3.90mg/ml的三萜水溶液，最佳的反应温度为80℃。

实施例2

一种水溶性茯苓三萜的制备方法，包括以下步骤：

(1)从茯苓皮中提取茯苓三萜精制提取物；

(2)取步骤(1)获取的茯苓皮三萜精致提取物1g，分别加入10、20、40、80、160mlph值为0.15mol/l的naoh水溶液，超声5-10min混匀，维持温度分别在80摄氏度下，水溶反应4h，获得反应混合物；测得ph值分别为7-8之间。

(3)将步骤(2)中获得的反应混合物10000-11000r/min离心取上清液，测定总三萜浓度，结果如图2所示。蒸发溶剂获得所述水溶性茯苓三萜。

在加入10、20、40、80、160ml的0.1mol/l的naoh水溶液条件下分别得到的三萜水溶液的三萜浓度为6.77、5.69、4.05、1.48、0.28mg/ml，根据生产成本与效益选择最佳的料液比为1:40，此条件下三萜含量较高，原料成本低。

实施例3

一种水溶性茯苓三萜的制备方法，包括以下步骤：

(1)从茯苓皮中提取茯苓三萜精制提取物；

(2)取步骤(1)获取的茯苓皮三萜精致提取物1g，按照料液比1:40加入40ml0.15mol/l的naoh水溶液，超声混匀5-10min，维持温度分别在80摄氏度下，分别水浴反应2h、4h、6h、8h、10h，获得反应混合物；测得ph值分别为7-8之间。

(3)将步骤(2)中获得的反应混合物10000-11000r/min离心取上清液，测定总三萜浓度，结果如图3所示。蒸发溶剂获得所述水溶性茯苓三萜。

在水浴反应2h、4h、6h、8h、10h条件下，分别得到的三萜水溶液的三萜浓度为2.28、3.30、3.47、3.55、3.64mg/ml，根据生成成本与效益选择最佳的反应时间为4h，此条件下三萜浓度较高，耗时较短。

实施例4

一种水溶性茯苓三萜的制备方法，包括以下步骤：

(1)从茯苓皮中提取茯苓三萜精制提取物；

(2)取步骤(1)获取的茯苓皮三萜精致提取物1g，按照料液比1:40加入40ml0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol/l的naoh水溶液，超声混匀5-10min,维持温度分别在80摄氏度下反应4h，获得反应混合物；测得ph值分别为7-8之间。

(3)将步骤(2)中获得的反应混合物10000-11000r/min离心取上清液，测定总三萜浓度，结果如图4所示。蒸发溶剂获得所述水溶性茯苓三萜。

在加入0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol/l的naoh水溶液的条件下，分别得到的三萜水溶液的三萜浓度为1.81、2.80、3.62、3.66、3.74mg/ml,根据生成成本与效益及naoh的残余，选择最佳的naoh的浓度为0.15mol/l，此条件下三萜浓度较高，且ph值在7-8之间。

实施例5

一种水体系水溶性茯苓三萜的制备方法，包括以下步骤：

(1)从茯苓皮中提取茯苓三萜精制提取物；

(2)取步骤(1)获取的茯苓皮三萜精致提取物1g，按照料液比1:40加入40ml0.15mol/l的naoh水溶液，超声混匀5-10min，分别超声混合4h，获得反应混合物；测得ph值在7-8之间

(3)将步骤(2)中获得的反应混合物10000-11000转/min离心取上清液，测定总三萜浓度5.91mg/ml。蒸发溶剂获得所述水溶性茯苓三萜。

实施例6

按照如下方法制备醇体系水溶性茯苓三萜：

用乙醇作为溶剂体系，取250ml的95％的乙醇于500ml的烧杯中，加入0.15mol/l的naoh,超声溶解。再加入10g90％的茯苓皮三萜精制提取物，80℃下反应120min，减压旋蒸掉大部分溶剂，取出在通风橱挥干，在80℃烘箱中烘24h得水溶性茯苓三萜粗制品，100倍水沉降两次，10000转/min离心15min，取上清液减压旋转掉大部分溶剂，冻干得水溶性三萜的精制品。

实施例7细胞毒性实验

将raw264.7细胞培养至对数生长期，倒出培养瓶的培养基，用pbs清洗两次后加入完全培养基，用细胞刮刀小心将细胞刮下，转移至离心管中吹散稀释，于倒置显微镜下计数。将细胞浓度稀释至1×10⁵个/ml，稀释后的细胞悬液转入至96孔板中，每孔加0.1ml，将96孔培养板置于37℃含有5％co2细胞的培养箱中培养24h；待细胞培养24h贴壁后，吸出培养液，加入用基础培养基稀释的不同浓度的实施例5制备的水溶性茯苓三萜处理组，并设置浓度为1μg/mllps组，空白组只加基础培养基，继续在37℃含有5％co2的细胞培养箱中培养24h；待药物处理24h后，小心吸出孔板中的培养液，每孔加入100μl0.5mg/mlmtt，继续在培养箱中培养4h；小心吸出96孔板中的液体，每孔中加入150μldmso，在酶标仪中中速间隔振荡5min后测定490nm处的吸光值，细胞存活率的计算：

细胞存活率(％)＝(实验组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)×100％

结果如图5所示，体外细胞实验显示，在5-200μg/ml实施例5制备的水溶性茯苓三萜浓度处理条件下，细胞存活率在90％-150％之间，对细胞无明显毒性。

实施例8预保护模式下水溶性茯苓三萜反应物对lps诱导raw264.7产生no的影响

将raw264.7细胞培养至对数期，小心将细胞刮下，转移至离心管中吹散，于倒置显微镜下技术，将细胞稀释至8×10⁵个/ml，稀释后的细胞悬液转入24孔板中，待raw264.7细胞培养24h贴壁后，小心吸出培养液，加入用无酚红基础培养基稀释的不同浓度实施例5、实施例6，置于培养箱中培养2h后，吸出孔板中液体，每孔中加入0.5ml1μg/mllps，继续在培养箱中培养24h；

对于水溶性茯苓三萜预保护处理将raw264.7细胞，将其小心将24孔板中的培养液转入1.5ml离心管中，在离心机中2400r/min离心5min得上清液。取细胞培养液上清液100μl于酶标条中，加入1:1混合的griessa和griessb试剂100μl，避光反应5min，在酶标仪上测定540nm处的吸光值。将吸光值带入标准曲线中，计算得到细胞培养液上清液中no含量。

结果显示，如图6所示，预保护作用下，20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml实施例5制备的水溶性茯苓三萜处理，与lps处理组相比，no的产生量显著下降，对于no产生的抑制率分别为29.4％，42.4％，73.9％，90.2％；预保护作用下，20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml实施例6水溶性茯苓三萜处理，与lps组相比，no的产生量显著下降，对于no产生的抑制率分别为24.5％，40.9％，52.1％，73.6％；在预保护作用下，通过水体系反应得到的水溶性茯苓三萜对lps诱导raw264.7产生no的影响效果明显好于实施例6醇体系反应得到的水溶性茯苓三萜，抑制率提高最高达到40％。

实施例9预保护模式下水溶性茯苓三萜反应物对lps诱导raw264.7产生no的影响

将raw264.7细胞培养至对数期，小心将细胞刮下，转移至离心管中吹散，于倒置显微镜下技术，将细胞稀释至8×10⁵个/ml，稀释后的细胞悬液转入24孔板中，待raw264.7细胞培养24h贴壁后，小心吸出培养液，加入用无酚红基础培养基稀释的不同浓度实施例5与实例6，置于培养箱中培养2h后，吸出孔板中液体，每孔中加入0.5ml1μg/mllps，继续在培养箱中培养24h；

elisa法测定细胞中tnf-α、il-1β、il-6分泌量。

elisa测定的方法按试剂盒说明操作。

结果显示，如图7、8、9所示，在预保护作用下，分别用20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml实施例5和实施例6处理，与lps组相比，对炎症因子tnf-α、il-1β、il-6都有较好的抑制效果，抑制率见表1表1预保护模式下水溶性茯苓三萜炎症因子抑制效果

在预保护作用下，实施例5水体系得到的水溶性茯苓三萜对炎症因子tnf-α、il-1β、il-6抑制效果，明显好于实施例6醇体系得到的水溶性茯苓三萜。

实验结果显示，在mtt法确定安全剂量0-200μg/ml内，在20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml浓度处理时，实施例5水体系制备的水溶性茯苓三萜对于预防no产生的抑制率分别为29.4％，42.4％，73.9％，90.2％，对炎症因子tnf-α、il-1β、il-6都有较好的抑制效果，与实施例6醇体系制备的水溶性茯苓三萜相比，验证预保护的效果具备统计性差异，且呈现量效关系，即处理剂量越大，二者的抑制效果差异越明显。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。