神经鞘氨醇磷酸胆碱在诱导肿瘤细胞焦亡中的应用

1.本发明涉及一种神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，spc)在诱导肿瘤细胞焦亡中的应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.焦亡(pyroptosis)是近年来新发现的一种程序性坏死方式，主要依赖于半胱天冬酶(caspase)家族对gsdm家族切割，其氮端gsdm
‑
n具有细胞膜打孔作用，使细胞膜通透性增强，内容物外泄，进而诱发炎症，最终使细胞死亡。其中包括免疫反应中如细菌脂多糖(lps)引起caspas
‑
1对gsdmd的切割和化疗药物如顺铂(cisplatin)caspase
‑
3对gsdme的切割，分别产生gsdmd
‑
n和gsdme
‑
n打孔蛋白等不同通路。
3.神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，spc)是一种动物体内天然存在的具有多种生物学活性的鞘脂类，在各种组织中广泛分布，在脑和心脏中含量较高。作为一种内源性脂类物质，spc更容易进入细胞发挥功能，激活各种通路，参与细胞自噬、凋亡、分化、迁移和增殖等多个生物学过程。但已经报道的关于spc的生物学功能研究以保护心血管细胞居多，在肿瘤细胞中的应用报道较少。经检索，有关神经鞘氨醇磷酸胆碱在诱导肿瘤细胞焦亡中的应用还未见报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种神经鞘氨醇磷酸胆碱在诱导肿瘤细胞焦亡中的应用。
5.本发明所述神经鞘氨醇磷酸胆碱在诱导肿瘤细胞焦亡中的应用，其中所述的细胞焦亡是由caspase
‑
3切割gsdme介导的细胞焦亡。
6.上述应用中，所述肿瘤细胞优选是表达gsdme的非小细胞肺癌细胞a549。
7.上述应用中，能够使肿瘤细胞焦亡的神经鞘氨醇磷酸胆碱的浓度为10um，处理时间为3到12小时。
8.上述应用中，所述鞘氨醇磷酸胆碱在浓度为10um时对正常细胞不具有杀伤作用，仅对表达gsdme的肿瘤细胞具有杀伤作用。其中：所述正常细胞优选是心肌细胞h9c2，所述肿瘤细胞优选是非小细胞肺癌细胞a549。
9.神经鞘氨醇磷酸胆碱作为细胞焦亡激动剂在制备抗肺癌药物中的应用。
10.本发明公开了神经鞘氨醇磷酸胆碱(spc)在诱导肿瘤细胞焦亡中的应用；并首次发现内源性神经鞘氨醇磷酸胆碱可以作为一种焦亡激动剂诱导肿瘤细胞发生焦亡，其有效浓度为10um，有效处理时间为3至12小时。本发明提供的焦亡激动剂对于研究肿瘤细胞焦亡相关机制具有重要意义，并且其对肿瘤细胞的杀伤作用为新型肿瘤治疗药物的研发开辟了新的途径。
附图说明
11.图1为细胞死亡形态图。
12.高浓度浓度spc(5/10um)处理a549细胞，细胞死亡形态图。当10umspc处理6h时，细胞内容物泄露，说明细胞膜打孔，发生焦亡。
13.其中：5um
‑
6h：5um spc处理6小时组；10um
‑
6h：10um spc处理6小时组。
14.图2为ldh检测统计。
15.5/10um spc处理细胞6/12h，提取细胞上清，进行ldh检测。6小时ldh稍有升高，12h达到最高值，证明细胞发生坏死。其中：nor：正常组；ctr：1％血清对照组；spc：spc处理组。
16.5um：5um spc处理；10um：10um spc处理。
17.6h：spc处理6小时；12h：spc处理12小时。
18.图3为tunel染色检测细胞死亡方式。
19.高浓度spc(5/10um)处理a549细胞6/12小时，将细胞通过多聚甲醛固定后，tunel染色，显示：5um spc处理6h时，阳性细胞数量较多，说明细胞发生凋亡；12h时发生部分坏死。10um spc处理6h时，大量细胞发生坏死，直至12h。
20.其中：dapi：染色细胞核；tunel：染色降解的dna末端，即凋亡阳性细胞。
21.图4为高浓度spc处理a549细胞同时加凋亡抑制剂，tunel染色结果。
22.5um spc处理6h时，细胞发生凋亡，加入凋亡抑制剂后阳性细胞明显减少；10um spc处理6h时，大量细胞发生坏死，凋亡抑制剂对其没有影响。
23.其中：dapi：染色细胞核；tunel：染色降解的dna末端，即凋亡阳性细胞。
24.图5为western blot方法检测焦亡相关蛋白水平的变化。
25.高浓度spc处理a549细胞12小时后，提取蛋白，通过western blot方法检测焦亡相关蛋白水平的变化。其中caspase
‑
1几乎没有变化，il
‑
β增加说明发生炎症，caspase
‑
3表达增加说明可能发生了caspase
‑
3介导的gsdme切割诱导的细胞焦亡。
26.其中：nor：正常培养组；ctr：1％血清对照组；5um：5um spc处理组；10um：10um spc处理组。
27.图6为western blot方法检测高浓度spc促进a549细胞焦亡相关marker。
28.高浓度spc处理a549细胞12小时后，提取蛋白，通关western blot方法检测spc促进a549细胞焦亡相关marker蛋白水平的变化。当10um spc处理a549细胞12小时时，gsdme发生切割产生gsdme
‑
n，证明焦亡发生。
29.其中：nor：正常培养组；ctr：1％血清对照组；5um：5um spc处理组；10um：10um spc处理组。
30.图7为高浓度spc处理h9c2细胞后普通光学显微镜观察细胞形态图。
31.高浓度spc(5/10um)处理h9c2细胞6h，普通光学显微镜观察细胞形态变化。显示：细胞形态良好，呈长梭形，没有死亡细胞，说明高浓度spc作为一种内源脂类对正常细胞没有杀伤力。
具体实施方式
32.下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细、明确的说明，但下述说明仅仅是仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，不能限制本发
明的保护范围。
33.下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。实验方法若未特殊说明，均按照常规实验条件和方法操作。
34.实施例1：
35.1实验方法：
36.1.1细胞培养及传代：
37.培养a549细胞使用rpmi1640培养液，加入5％血清，0.1％青链霉素双抗。使用0.25％的胰酶置于37℃二氧化碳培养箱消化至细胞全部悬浮，加入等体积的培养液终止消化，使用离心机2000转离心3分钟使细胞沉淀至管底。弃去上清后加入培养液，吹打细胞至重新悬浮后移至培养皿中，“井”字法摇匀细胞，传代完毕。
38.1.2spc储液的配制
39.将从sigma公司购入的spc粉末用甲醇溶解为5mg/ml的储液，分装至1.5ml的ep管中，液氮吹干后，置于
‑
80℃冰箱存储。
40.1.3 spc处理细胞
41.将80ul无水乙醇加入分装后的ep管中吹打重溶，用培养液稀释500/1000倍后，配置成5/10um的含spc的1640培养液后，加入孔板中处理细胞。
42.1.4倒置显微镜拍摄细胞死亡形态图
43.将a549细胞种植至24孔板中，培养至70
‑
80％密度时，加入5/10um spc，处理6/12小时，观察细胞形态。使用研究级倒置荧光显微镜(nikon ti
‑
e)明场进行活细胞拍摄，观察细胞死亡形态。
44.1.5 ldh检测
45.5/10um spc处理a549细胞6/12小时后，提取细胞上清。使用ldh检测试剂盒(购于南京建成)，按照说明书向1.5ul ep管中加入标准液、基质缓冲液、待测上清、辅酶ⅰ后，将所有管混匀离心，37℃水浴15分钟。每管加入50ul 2,4
‑
二硝基苯肼，37℃水浴15分钟。每管加入500ul的0.4mol/l氢氧化钠，室温静置3分钟，于酶标仪在440nm波长处检测吸光度。
46.1.6凋亡抑制剂使用
47.凋亡抑制剂选用z
‑
vad
‑
fmk(购于apexbio)，储液浓度为10mm，作用浓度为100nm(用1％培养液稀释100倍)，待细胞密度长至70
‑
80％时，加入z
‑
vad
‑
fmk预处理24小时后，再加入5/10um spc，处理6/12小时。
48.1.7 tunel染色
49.将a549细胞种植于用于共聚焦拍摄的小圆片上，待细胞密度长至70
‑
80％时，加入5/10um spc，处理6/12小时，观察细胞形态。用细胞固定液在冰上固定细胞15分钟。用含0.5％triton x
‑
100的pbs溶液在室温下透化细胞10分钟。5％bsa室温封闭30分钟。使用tunel凋亡检测试剂盒(购于翊圣生物)，按1:5的比例用去离子水稀释5
×
equilibration buffer，每个样本滴加100μl 1
×
equilibration buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10
‑
30min平衡细胞。再根据说明书加入ddh2o、5
×
equilibration buffer、fitc
‑
12
‑
dutp labling mix、recombinant tdt enzyme配置tdt孵育缓冲液。在平衡后的区域周围用吸水纸洗掉100μl1
×
equilibration buffer中的大部分，然后在小圆片上加入50μl tdt孵育缓冲液。把塑料盖玻片盖在细胞上以保证试剂的平均分布，在湿盒的底部放上用水浸湿
的纸巾。将载玻片置于湿盒内，在37℃孵育60分钟。将湿盒用铝箔纸包裹以避光，将dapi溶液(2μg/ml，用pbs新鲜配制并稀释)染料滴加至小圆片上，室温放置5min。在共聚焦显微镜下分析样本，在460nm波长激发光下观察蓝色的dapi，在488nm波长激发光下观察红色的fitc。
50.1.8 westernblot检测
51.将a549细胞种植于6孔板中，5/10um spc处理a549细胞6/12小时后，倒掉培养液，pbs清洗3遍，加入ripa裂解液(加入pmsf1:100)，用枪尖粗头刮下细胞，于冰上放置10
‑
15分钟，将裂解液打入1.5ml ep管，瞬时离心后放入
‑
20℃冰箱保存。配置12％分离胶，加无水乙醇液封，凝固后配置浓缩胶。使用bca法测定蛋白浓度后，绘制标准曲线，计算上样体积。取计算后所得体积的蛋白样品，加入1/4体积的5xsds
‑
page loading buffer，混匀离心后，100℃金属浴加热变性5min，离心后上样。80v电压进胶，约30min后(观察到蛋白marker已经跑开)，换120v电压跑胶，约1.5h。配湿转缓冲液，取出胶后切掉浓缩胶及多余部分，根据胶的大小切pvdf膜，将胶和膜放入湿转夹中放入湿转槽中，冰水浴恒流转膜160ma 2h。将湿转完成的膜置于5％的牛奶中，封闭1h。根据目的蛋白的分子量大小及marker的位置裁出目的条带，放入对应的一抗中，4℃孵育过夜。放入对应的二抗中室温孵育1小时。pbs清洗3遍，使用ecl显影液显影。
52.上述实验结果见图1至图7，相关解释见附图说明。