一种靶向药物共递送纳米系统及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及药物制剂技术领域，涉及一种靶向药物共递送纳米系统及其制备方法和应用。


背景技术：

2.卵巢癌是危害妇女生命健康最严重的癌症之一，其发病率和死亡率高居妇科恶性肿瘤之首。目前临床治疗卵巢癌的主要策略是以紫杉醇(ptx)、铂等化疗药物为基础，联合手术进行治疗。但是化疗过程中，癌细胞常常会对化疗药物产生多药耐药性(mdr)，从而导致患者对治疗药物不在敏感，化疗效果不佳，最终导致化疗失败甚至疾病复发。据统计，其中50％
‑
75％的卵巢癌患者最终因mdr导致疾病复发。卵巢肿瘤细胞中多药耐药相关基因的高表达是卵巢癌多药耐药的主要原因。p
‑
糖蛋白(p
‑
glycoprotein,p
‑
gp)是由多药耐药基因家族编码的一种分子量为170kda的跨膜糖蛋白，又称p
‑
170，p
‑
gp能不断从癌细胞中排除药物，降低癌细胞内的药物浓度，从而导致多药耐药性。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,atp)提供能量迅速将化疗药物泵出癌细胞，降低抗癌药物的细胞毒性，导致耐药性。之前的研究表明mdr1抑制剂可以抑制癌细胞中mdr1的表达，逆转mdr。尽管mdr1抑制剂的应用已有几十年的历史，但是其临床疗效尚不足以有效地逆转卵巢癌的mdr以及改善预后。
3.近年来，基于纳米技术的靶向给药系统被广泛应用于各种癌症的预防、诊断和治疗。其中将特异性micrornas(mirs)与化疗药物联合应用以克服癌症的多药耐药性是为了实现癌症的有效治疗的新策略。micrornas(mirs)是一种长度约为20
‑
24个核苷酸的小内源性单链非编码rna，其调节机体内若干基因的表达，参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等几乎所有生命过程，在研究卵巢癌的病理中发挥着重要作用。有研究发现一些mirs具有抗卵巢癌的作用，如lethal(let
‑
7)和mir
‑
199a
‑
3p。然而，mirs存在在卵巢癌细胞中表达不足，不能有效抑制肿瘤生长和抗凋亡、减弱化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用等问题。因此，寻找一种更加有效的逆转卵巢癌多药耐药的方法是目前研究的重点，其对卵巢癌以及其他癌症的治疗具有重要而深远的意义。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种靶向药物共递送纳米系统，该共递送纳米系统能够对药物运输提供保护，并且维持化疗药物和基因药物结合的稳定性，有助于共递送药物发挥协同作用有效地抑制卵巢肿瘤的生长。
5.本发明的目的之二在于提供一种靶向药物共递送纳米系统的制备方法。
6.本发明的目的之三在于提供靶向药物共递送系统在制备治疗卵巢癌药物中的应用。
7.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
8.一种靶向药物共递送纳米系统，包括金纳米棒，所述金纳米棒表面包覆氨基修饰
的介孔二氧化硅，所述氨基修饰的介孔二氧化硅与金纳米棒构成共载体负载靶向药物，所述氨基修饰的介孔二氧化硅依次经peg和透明质酸修饰；
9.所述靶向药物为化疗药物和基因药物。
10.进一步地，所述化疗药物为紫杉醇，基因药物为microrna lethal
‑
7α。
11.进一步地，所述microrna lethal
‑
7α的核苷酸序列为ugagguaguagguuguauaguu。
12.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
13.靶向药物共递送纳米系统的制备方法，包括以下步骤：
14.1)采用种子生长法制备得到金纳米棒溶液，即gnr溶液；
15.2)调节步骤1)得到的gnr溶液的ph为10
‑
11，加入teos反应得到介孔二氧化硅纳米粒子包覆金纳米棒复合物，即gnr@msn；
16.3)将重复两次步骤2)得到的gnr@msn与3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷溶液混合，反应得到氨基修饰的gnr@msn复合物，即gnr@msn
‑
nh2；
17.4)配制含紫杉醇的混合溶液，随后添加至步骤3)得到的gnr@msn
‑
nh2溶液中，反应得到负载紫杉醇的gnr@msn
‑
nh2，即ptx
‑
gnr@msn；
18.5)将步骤4)得到的ptx
‑
gnr@msn配制得到溶液，随后向其中加入盐酸胍和microrna lethal
‑
7α(mir let
‑
7α)，反应得到负载紫杉醇和microrna lethal
‑
7α的gnr@msn，即ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
gnr@msn(记为ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn)；
19.6)溶解nh2‑
peg
‑
cooh，然后向其中添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于2
‑
(n
‑
吗啉基)乙磺酸缓冲液得到的混合溶液，反应即得活化的peg，随后将其添加至步骤5)制备得到的ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
gnr@msn中，反应即得peg修饰的ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
gnr@msn，即ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn(记为ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn)；
20.7)向含有n
‑
羟基琥珀酰亚胺、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的2
‑
(n
‑
吗啉基)乙磺酸缓冲液中添加水合透明质酸得到混合物，调节混合物的ph得到活化的透明质酸，将活化的透明质酸与步骤6)得到的ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn混合，反应得到透明质酸修饰的ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn，即ha
‑
ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn(记为ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn)。
21.进一步地，步骤2)中gnr溶液中所含au与teos的质量比为5.28:1。
22.进一步地，步骤3)中3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷与gnr@msn中所含au的质量比为0.125:1。
23.进一步地，步骤4)中ptx与gnr@msn
‑
nh2的质量比为1:1，步骤5)microrna lethal
‑
7α与ptx
‑
gnr@msn的比例为80μmol/l:1mg。
24.进一步地，步骤6)ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn中peg与ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
gnr@msn的质量比为1:1，步骤7)中ha与ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn的质量比为1:1，上述多余的高分子peg和ha均通过透析和离心除去。
25.进一步地，所述步骤1)种子生长法制备金纳米棒的步骤为：
26.分别向ctab溶液中添加haucl4和nabh4制备得到种子溶液，向ctab溶液中添加haucl4、agno3和对苯二酚制备得到生长溶液，将种子溶液和生长溶液混合，反应得到金纳米棒。
27.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
28.靶向药物共递送纳米系统在制备治疗卵巢癌药物中的应用。
29.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
30.本发明提供了一种靶向药物共递送纳米系统ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn，该共递送纳米系统可有效逆转卵巢癌的多药耐药性。该共递送纳米系统由金纳米棒和氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子构成共载体，具有较大的比表面积，有助于提高药物的负载量；且该共载体具有良好的稳定性和生物相容性，对生物体的毒性较小。共载体载药后由peg进行修饰，提高了共递送系统在血液的循环时间，对药物输送起到了良好的保护作用，并维持了ptx与mir let
‑
7α的稳定结合，有助于癌细胞对共递送系统的摄取；以透明质酸进一步修饰该共递送纳米系统，ha修饰后可与卵巢癌skov3/skov3
tr
细胞中高表达的cd44受体特异性结合，能够实现更加有效的细胞摄取，并且提高了药物在肿瘤部位的通透性，有助于药效最大程度的发挥。
31.本发明的共递送纳米系统包括化疗药物、基因药物和共载体纳米系统，实现了化疗药物ptx和基因药物mir let
‑
7α的共递送，达到协同治疗的目的。本发明采用外源性补充基因药物mir let
‑
7α，促进了肿瘤细胞的凋亡，有效增强化疗药物ptx对卵巢癌发挥药效，减弱卵巢癌对ptx的耐药性，以达到治疗卵巢癌的目的。
32.本发明还提供了靶向药物共递送纳米系统的制备方法，该方法制备过程简单，合成得到的纳米复合物尺寸可控，有助于降低纳米递送系统因尺寸过大影癌细胞吞噬或尺寸过小被肾小球的滤过作用从体内清除，从而保证了药效的发挥。
33.本发明还提供了靶向药物共递送纳米系统在制备治疗卵巢癌药物中的应用，该靶向药物共递送纳米系统实现了化疗药物与基因药物的有效传递，可靶向肿瘤组织，增加了肿瘤部位的通透性，促进了癌细胞对药物的摄取，有助于提高药效的发挥，逆转卵巢癌组织的多药耐药性，增强ptx的治疗效果，从而提高治疗效率。为治疗卵巢癌提供了一种新思路。
附图说明
34.图1为本发明金纳米棒的xrd图谱；
35.图2为本发明金纳米棒的透射电镜图，其中图2a为gnrs的tem图像，图2b为gnrs的hrtem图像；
36.图3为本发明gnr@msn的tem、haadf和eds
‑
mapping图，其中图3a为gnr@msn的tem，图3b为gnr@msn的tem的局部放大图，图3c为gnr@msn的tem的haadf和eds
‑
mapping图；
37.图4为本发明gnrs、gnr@msn、gnr@msn
‑
nh2、pgnr@msn和ha
‑
pgnr@msn的ft
‑
ir光谱；
38.图5为本发明gnr@msn的n2吸收
‑
解吸等温线和相应的孔径分布曲线；
39.图6为本发明各纳米材料的粒径分布(图6a)和zeta电位图(图6b)；
40.图7为本发明ha
‑
pgnr@msn共载体纳米系统的生物安全性：不同浓度ha
‑
pgnr@msn处理24小时后的细胞活力；
41.图8为本发明ha
‑
pgnr@msn共载体纳米系统的生物安全性：ha
‑
pgnr@msn的溶血性图(图8a)，不同浓度ha
‑
pgnr@msn孵育2小时前后的rbcs的数码照片(图8b)；
42.图9为本发明ha
‑
pgnr@msn共载体纳米系统的荧光特性标记：荧光rbitc标记的ha
‑
pgnr@msn(图9a)，荧光rbitc标记的pgnr@msn(图9b)，用image
‑
pro plus软件分析相应的荧
光rbitc标记的ha
‑
pgnr@msn、pgnr@msn的荧光图谱(图9c)；
43.图10为本发明细胞摄取实验结构图：其中图10a为用
rbitc
pgnr@msn和
rbitc
ha
‑
pgnr@msn处理skov3细胞12h后(浓度50μg/ml)的荧光图像；图10b为用
rbitc
pgnr@msn和
rbitc
ha
‑
pgnr@msn处理skov3细胞12h后(浓度50μg/ml)的荧光图像的相应定量数据分析；图10c为用ha
‑
fam
mir let
‑
7α
‑
rbitc
pgnr@msn处理6、12和24小时后的skov3/skov3
tr
细胞的荧光图像：fam(绿色)、rbitc(红色)和dapi(蓝色)；
44.图11为本发明ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn共递送纳米系统的载药量分析图，其中图11a为高效液相色谱法测试得到的实验组ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn中ptx特异峰面积，图11b为高效液相色谱法测试ptx标准溶液得到的标准曲线方程；
45.图12为本发明ha
‑
pgnr@msn与mir let
‑
7α在不同质量比率条件下的凝胶阻滞电泳图；
46.图13为本发明ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn共递送纳米系统的体外抗增殖能力和治疗作用结果图(其中图13a为靶向ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn和非靶向ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn处理的skov3细胞的细胞活性；图13b为靶向ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn和非靶向ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn处理的skov3
tr
细胞的细胞活性；图13c为不同治疗性纳米复合物对skov3
tr
细胞增殖的治疗作用；图13d为pi和fda双重染色法进行细胞活力测定；图13e是对图13d的相应定量分析图；其中a，对照组；b，ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；c，ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn；d，ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；e，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn)；
47.图14为本发明p
‑
gp在skov3
tr
细胞中的表达水平分析图：图14a为蛋白印迹法测定p
‑
gp的表达图，图14b为蛋白印迹法测定p
‑
gp的表达后的相应的定量分析图；
48.图15为本发明p
‑
gp在不同浓度ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn处理的skov3
tr
细胞中的表达水平分析图；
49.图16为本发明凋亡细胞的核分裂过程图：图16a为使用hoechst h33258染色的skov3和skov3
tr
细胞荧光图像；图16b为用各种治疗性纳米复合物处理的skov3和skov3
tr
细胞凋亡率的相应定量分析；图16c是使用不同浓度的ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn处理的skov3和skov3
tr
的hoechst 33258相应的定量分析图；
50.图17为本发明用不同治疗性纳米复合物处理的skov3
tr
细胞凋亡相关蛋白的蛋白印迹图：其中图17a为蛋白印迹图，图17b为蛋白水平的统计分析(a，对照组；b，ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；c，ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn；d，ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；e，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn)；图17c和17d是使用不同浓度的ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn处理的skov3和skov3
tr
的蛋白印迹图和相应的定量分析图；
51.图18为本发明细胞凋亡分析图：图18a1
‑
a5、b1
‑
b5为skov3和skov3
tr
细胞经a
‑
e组治疗性纳米复合物处理后，利用annexin v
–
fitc/pi染色进行细胞凋亡的流式细胞术分析图；
52.图18c、18d分别为各种治疗性纳米复合物处理skov3和skov3
tr
细胞后的活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞百分比的相应定量分析图；
53.图19为本发明吖啶橙(ao)染色剂对经过各种治疗性纳米复合物处理的skov3和skov3
tr
细胞进行染色后的荧光效果图(a，对照组；b，ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；c，ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn；d，ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；e，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn)；
54.图20为本发明用各种治疗性纳米复合物处理后的skov3和skov3
tr
细胞进行罗丹明123染色，其中图20a为荧光效果图，图20b为定量分析图；a，对照组；b，ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；c，ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn；d，ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；e，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；
55.图21为本发明用各种治疗性纳米复合物处理后的skov3和skov3
tr
细胞的ros分析图，其中图21a1
‑
a5、b1
‑
b5为skov3和skov3
tr
细胞的胞内ros水平的流式细胞术分析图，图21c为skov3和skov3
tr
细胞的胞内ros水平的流式细胞术定量分析图；a，对照组；b，ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；c，ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn；d，ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；e，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn；
56.图22为本发明用各种治疗性纳米复合物处理后的skov3和skov3
tr
细胞的不同因子相关蛋白表达水平图，其中图22a为mtor、stat3、ezh2因子相关蛋白表达水平电泳图，图22b为mtor、stat3、ezh2因子相关蛋白表达水平定量分析图；
57.图23为本发明各治疗性纳米复合物的体内治疗效果图：其中图23a为各治疗性纳米复合物体内治疗的实验流程图，图23b为各治疗性纳米复合物体内治疗后小鼠和解剖肿瘤图；
58.图24为本发明各治疗性纳米复合物的体内治疗效果图：其中图24a为各治疗性纳米复合物体内治疗后时间依赖性肿瘤生长曲线，图24b为各治疗性纳米复合物体内治疗15天后肿瘤重量；
59.图25为本发明各治疗性纳米复合物的体内治疗病理分析：图25a为p
‑
gp免疫组化染色和tunel染色用于病理改变分析图，图25b为h&e染色和ki
‑
67免疫组化染色用于治疗15天后肿瘤组织细胞增殖分析图；
60.图26为本发明各治疗性纳米复合物的体内治疗15天后小鼠主要器官(心、肝、脾、肺和肾)h&e染色的代表性图像；
61.图27为本发明ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn靶向药物共递送纳米系统在卵巢癌skov3/skov3
tr
细胞系和肿瘤组织中的靶向给药及治疗机制示意图。
具体实施方式
62.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
63.实施例1
64.一种靶向药物共递送纳米系统，包括金纳米棒，金纳米棒表面包覆氨基修饰的介孔二氧化硅，氨基修饰的介孔二氧化硅与金纳米棒构成共载体负载靶向药物，且氨基修饰的介孔二氧化硅依次通过peg和透明质酸修饰。
65.靶向药物共递送纳米系统的制备过程包括如下步骤：
66.1)取5ml 0.1m十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，向其中添加125μl质量分数1％的haucl4，充分搅拌后添加300μl浓度为0.01m的nabh4，溶液颜色由金黄色变为棕色后，在30℃下放置2h得到种子溶液；将7ml的0.1m的ctab和300μl的1％的hacl4溶液混合，在混合液中添加10μl的0.1m的agno3。然后，在混合液中加入120μl的0.33m的对苯二酚，溶液很快变为
无色，即得生长溶液；在生长溶液中添加100μl的种子溶液，混合均匀后在30℃下反应12h即得金纳米棒，以5000转离心3min，将沉淀分散于去离子水中得到金纳米棒gnr分散液，于4℃保存至使用。
67.2)采用100μl 28wt％的nh3·
h2o调节步骤1)得到的gnr溶液的ph为10
‑
11，每30min加入17μl teos，共加入4次，使得gnr溶液中所含au与teos的质量比为5.28:1。然后在30℃水浴中反应12h。用去离子水和甲醇洗涤，5000转5min离心前述反应产物，得到介孔二氧化硅纳米粒子包覆金纳米棒复合物，即gnr@msn；
68.3)将重复两次步骤2)得到的gnr@msn按照3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷与gnr@msn中所含au的质量比为0.125:1的添加比例与15μl的3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)和85μl的甲醇混合，在甲醇溶液中75℃回流6h，然后热甲醇5000转离心10min洗涤，得到氨基修饰的gnr@msn复合物，即gnr@msn
‑
nh2；
69.4)将1mg紫杉醇溶于于1ml二甲基亚砜中得到混合溶液，随后添加至步骤3)得到的gnr@msn
‑
nh2溶液中，按照质量比为1:1通过连续震荡使其反应过夜，10000转离心10分钟收集得到负载紫杉醇的gnr@msn，即ptx
‑
gnr@msn；
70.5)将步骤4)得到的ptx
‑
gnr@msn 0.25mg溶解于40μl乙醇中得到溶液，随后向其中加入10μl的4mol/l盐酸胍和20μmol/l microrna lethal
‑
7α(品牌：上海吉玛制药技术有限公司)。常温震荡2h，10000转/min离心10min得到负载紫杉醇和microrna lethal
‑
7α的gnr@msn，即ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
gnr@msn；
71.6)将10mg nh2‑
peg
‑
cooh溶解于8ml dmso中，然后向其中添加38mg n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)、68mg 1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解于2
‑
(n
‑
吗啉基)乙磺酸(mes)缓冲液得到的混合溶液(ph＝6.0)，室温下搅拌并活化24h即得活化的peg，随后按照peg与ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
gnr@msn的质量比为1:1将其添加至步骤5)制备得到的ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
gnr@msn中得到混合物，在室温下将混合物搅拌24h，10000转/分离心10min得到peg修饰的ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
gnr@msn溶液，即ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn；
72.7)向mes缓冲液(ph＝6.0)中添加20mg水合ha，其中含有10ml的10mg/ml的edc/nhs用于活化，并使用tris缓冲液将混合物的ph调节至8.3，得到活化的透明质酸；将活化的透明质酸与步骤6)得到的ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn按照ha与ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn的质量比为1:1混合，室温下搅拌反应24h，反应结束后以10000转/min离心10min，得到透明质酸修饰的ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn，即ha
‑
ptx/microrna lethal
‑
7α
‑
pgnr@msn。
73.对比例1
74.对比例1与实施例1的区别在于：合成过程未添加ptx，其余与实施例1相同。最终得到ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn。
75.对比例2
76.对比例2与实施例1的区别在于：合成过程中未添加基因药物mir let
‑
7α，其余与实施例1相同，最终得到ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn。
77.对比例3
78.对比例3与实施例1的区别在于：合成过程中未添加ha进行修饰，其余与实施例1相
同，最终得到ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn。
79.实验例1
80.将实施例1各步骤得到的产物经xrd、haadf
‑
stem、hrtem、ftir、zeta、bet等现代纳米测试分析技术对其形貌、成分、化学键和微结构进行系统的研究，结果如下：
81.本发明采用带单色x射线束以及镍过滤cu
‑
ka辐射的x射线衍射(xrd；x'pert
‑
pro
‑
mpd，hol
‑
land
‑
panalytical)分析了实施例得到gnrs的晶体结构，结果如图1所示，xrd图谱中清晰的显示出金纳米棒的衍射出现在2θ为38.2
°
、44.4
°
、64.6
°
、77.6
°
和81.7
°
处，分别对应(111)、(200)、(220)、(311)、(222)晶面，表明本发明成功合成得到金纳米棒。
82.本发明采用高角环形暗场扫描透射电子显微镜(haadf
‑
stem)和jem
‑
2100分析电子显微镜(日本东京jeol有限公司)的高分辨透射电子显微镜(hrtem)对实施例得到的gnrs和gnr@msn进行表征，结果如图2和图3所示。图2a(图2a右上角为金纳米棒的示意图)显示本发明实施例制备得到的gnrs的平均长度和宽度分别为75nm
±
5nm和5nm
±
5nm，长宽比约7:1。可知本发明制备金纳米棒大小均匀，尺寸可控。图2b为通过hrtem对gnrs进一步放大，金纳米棒表面晶格间距的明暗条纹清晰可见。图3a、3b显示介孔二氧化硅均匀包覆在金纳米棒表面，gnr@msn的平均粒径为135nm
±
5nm。图3c显示在haadf模式下利用暗场探测器和eds
‑
mapping的元素映射对gnr@msn分析，显示gnrs主要分布在亮区。au和si元素均匀分布，且二者的位置分布表明中间为金纳米棒，介孔二氧化硅包被在金纳米棒表面。
83.本发明采用傅里叶变换红外光谱仪(ftir spectrometer)(nicolet is 50continuum；thermo fisher scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)检测本发明实施例各步骤得到的gnrs、gnr@msn、gnr@msn
‑
nh2、pgnr@msn和ha
‑
pgnr@msn的化学结构，其中pgnr@msn、ha
‑
pgnr@msn与ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn、ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn的区别在于制备过程省略了ptx和mir
‑
let
‑
7，其余相同。检测结果如图4所示，在1081cm
‑1和798cm
‑1的位置处出现的特征吸收峰为si
‑
o
‑
si的振动吸收峰，表明介孔二氧化硅的成功包裹，gnr@msn
‑
nh2的fitr光谱在1560cm
‑1有吸收峰，表明gnr@msn
‑
nh2中存在n
‑
h键，证明了氨基对gnr@msn的成功修饰。ha
‑
pgnr@msn的的pitr光谱中显示酰胺键的特征带出现在酰胺n
‑
h拉伸(3680cm
–1)和酰胺c＝o拉伸(1690cm
–1)处，表明ha对pgnr@msn的成功修饰。
84.本发明barrett
–
joyner
–
halenda(bjh)和brunauer
–
emmett
–
teller(bet)方法通过n2吸收
‑
解吸技术(tristar ii 3020系统(micromeritics，美国))测定实施例得到的gnr@msn的孔径和比表面积。结果如图5所示，由图可知gnr@msn的比表面积较高为77.00m2/g，平均孔径为34.22nm，较高的比表面积和孔径有助于介孔二氧化硅实现对ptx和mir let
‑
7α药物的有效吸附。
85.本发明采用zetasizer nano zs90分析仪(malvern panalytical，malvern，netherland)测定实施例各步骤得到的样品的zeta电位和粒径。结果如图6所示，图6a表明gnrs、gnr@msn、gnr@msn
‑
nh2、pgnr@msn和ha
‑
pgnr@msn水合粒径分布分别为255.7、398.7、488.9、802.2和929.7nm，图6b表明gnrs、gnr@msn、gnr@msn
‑
nh2、pgnr@msn和ha
‑
pgnr@msn的电位分别为+13.00、
‑
6.94、+21.70、
‑
3.55和
‑
37.33mv。由此可知本发明实施例合成过程各组分的成功修饰。
86.上述表征分析结果表明，本发明首先合成得到氨基修饰的介孔二氧化硅包覆金纳米棒为共载体纳米系统，金纳米棒具有较大的比表面积，有利于在其表面进行功能修饰和
靶向配体的进一步偶联。再在金纳米棒表面包被一层介孔二氧化硅，介孔二氧化硅具有大孔径、强吸引力和良好的形态特性，其与金纳米棒结合得到纳米复合物构成共载体纳米系统，有助于提高载体的载药量。然后通过edc/nhs交联方法在其表面修饰聚乙二醇，增强了该纳米系统的生物相容性，靶向分子透明质酸通过酰胺键接枝于表面，经与肿瘤表面过表达的cd44受体特异性结合而提高增强载体靶向性。
87.实验例2
88.ha
‑
pgnr@msn共载体纳米系统的生物安全性和荧光性能评估
89.2.1体外细胞毒性实验
90.细胞培养：本发明选用的是卵巢癌skov3细胞系，购买自中国科学院上海细胞库(中国上海)。skov3细胞在含有10％fbs、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi 1640培养基中培养，培养环境为37℃、5％co2增湿空气中。skov3
tr
细胞系(ptx耐药的skov3细胞)在rpmi 1640培养基中保持在以dmso为溶剂、浓度为2mg/ml的10μl ptx溶液中。
91.低细胞毒性对构建靶向药物共递送纳米系统是至关重要的。本发明采用3
‑
(4,5
‑
二甲基噻唑
‑2‑
基)
‑
2,5
‑
二苯基四唑溴化铵(mtt)法检测了ha
‑
pgnr@msn(ha
‑
pgnr@msn与本发明实施例1的区别在于制备过程省略了ptx和mir
‑
let
‑
7，其余相同)的细胞毒性。具体过程为：将skov3细胞接种在一个密度为3000cell/孔的96孔板上，培养12h。接着将不同浓度的ha
‑
pgnr@msn溶液注入上述96孔板中，ha
‑
pgnr@msn的浓度分别为0、25、50、100、200和400μg/ml。在37℃下孵育24h后，取出培养基，每孔加入200μl浓度为0.5mg/ml的mtt溶液，继续孵育4h，每孔加入150μl dmso，涡旋得到待测试样品。最后，使用微孔板分光光度计(biotek instruments inc.，winooski，vt，usa)测量待测试样品在570nm波长处的吸光度。
92.结果如图7所示，用0、25、50、100、200和400μg/ml的ha
‑
pgnr@msn处理24小时后，skov3细胞没有显示出明显的细胞毒性。
93.2.2溶血实验
94.本发明通过溶血实验评估了ha
‑
pgnr@msn血液相溶性。具体过程为：将新鲜人血以3000转/分的速度离心15min，除去上清液，用0.9％的盐水洗涤沉淀以获得红细胞(red blood cells，rbcs)。接着用适量的0.9％生理盐水稀释红细胞，添加1ml的浓度为2％的红细胞悬浮液到不同浓度的ha pgnr@msn溶液中，浓度分别为50、100、200和400μg/ml。分别使用盐水和去离子水作为阴性(
‑
)和阳性对照(+)。样品在室温下稳定2h后以3000转/min离心，收集上清液并在540nm波长处测量吸光度，根据获得混合物的图像，并计算溶血率。
95.结果如图8所示，图8a显示红细胞在不同浓度的ha
‑
pgnr@msn溶液中溶血性均表现出较低的水平，即使在最大浓度400μg/ml处，其溶血率仅为4.85％(＜5％)。图8b为不同浓度ha
‑
pgnr@msn孵育2小时前后的rbcs的数码照片。以上结果表明ha
‑
pgnr@msn可用于后续的体内和体外实验。
96.2.3细胞摄取分析
97.本发明采用荧光rbitc标记的ha
‑
pgnr@msn及pgnr@msn(pgnr@msn与本发明实施例1的区别在于制备过程省略了ptx和mir
‑
let
‑
7、ha，其余相同)进行细胞摄取分析。具体步骤为：首先用荧光rbitc标记ha
‑
pgnr@msn及pgnr@msn，分别取10mg载体溶于ph为8.5的硼酸缓冲液中，之后加入20μl浓度为1mg/ml的rbitc(溶解在dmso中)，常温震荡4h，pbs洗3次后在荧光显微镜下观察。结果如图9所示，图9a、9b分别为荧光rbitc标记的ha
‑
pgnr@msn、pgnr@
msn，图9c为用image
‑
pro plus软件分析相应的荧光图谱，结果表明rbitc标记的ha
‑
pgnr@msn与pgnr@msn相比显示出较强的红色荧光，表明rbitc标记法可以有效地用于靶向药物共递送系统的细胞摄取分析。
98.细胞摄取实验过程为：将skov3细胞接种于24孔板上，孵育48h后，加入荧光rbitc标记的ha
‑
pgnr@msn及pgnr@msn，再次在黑暗环境中培养4h。培养完毕后用磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph＝7.4)冲洗细胞3次，并在倒置eclipsete2000
‑
u荧光显微镜下(尼康，日本)拍摄。本发明还通过羧基荧光素(fam)标记的mir let
‑
7α检测rna的转染效率，fam标记的mir let
‑
7α的细胞摄取与荧光rbitc标记ha
‑
pgnr@msn及pgnr@msn过程相同。其中fam标记的mir let
‑
7α载体购买自上海吉玛制药技术有限公司，按照实施例1的制备方法，首先制备得到ha
‑
fam mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn，然后再用rbitc标记，即可制得荧光双标ha
‑
fam mir let
‑
7α
‑
rbitc pgnr@msn。
99.结果如图10所示，图10a、10b显示rbitc标记的nps可通过靶向ha实现有效内吞，有效识别和结合skov3/skov3
tr
细胞中高表达的cd44受体，提高细胞摄取效率，其中ha
‑
pgnr@msn的细胞摄取效率约为150％。图10c表明荧光双标ha
‑
fam mir let
‑
7α
‑
rbitc pgnr@msn进一步证实ha
‑
pgnr@msn与skov3/skov3
tr
细胞共孵育6、12、24h后的转染效果，ha
‑
pgnr@msn能够更有效地将mir let
‑
7α输送到skov3/skov3
tr
细胞，并且在处理12小时后达到最大转染率。
100.实验例3
101.ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn共递送纳米系统的载药量
102.众所周知，紫杉醇作为临床经典抗肿瘤药物，可使微管蛋白的合成和解聚失去动态平衡，诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚，从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂和触发细胞凋亡，进而有效阻止癌细胞的增殖，起到抗卵巢癌的作用。将紫杉醇作为抗卵巢癌的化疗药物制备共递送纳米系统存在以下问题：1.疏水性药物很难与金纳米离子结合；2.基因药物rna存在易降解、很难有效地将其输送到作用靶点。因此，本发明利用具有超大孔隙的介孔二氧化硅包覆在金纳米棒表面，以达到增强药物吸附的目的。pgnr@msn为peg修饰后复合物纳米粒子，peg可以延长药物的血液循环时间。靶向配体ha能够特异性识别在卵巢癌skov3/skov3
tr
细胞系中高表达的cd44受体，从而提高药物的释放效率，进一步提高治疗效果。
103.本发明通过高效液相色谱(high
‑
performance liquid chromatography，hplc)和琼脂糖凝胶电泳分别测定ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn共递送纳米系统中ptx和mir let
‑
7α的载药量，具体步骤如下：首先过滤流动相(水和甲醇)，对流动相进行超声0.5h以除去气泡。用流动相配制紫杉醇的标准溶液分别为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml，另取1mg ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn溶于流动相中，超声至药物完全释放，取上清，然后上机进行检测。检测参数设置波长为227nm；进样量为10μl；柱温为25℃；流动相比例为50:50；流速为1ml/min。调平基线，进样检测，根据标准溶液峰面积与浓度所绘制的标准曲线，求得纳米材料吸附药物质量。计算公式如下：
[0104][0105]
[0106]
式中，wt是ptx在ha
‑
ptx/let
‑
7α
‑
gnr@msn中的重量，ws是ha
‑
ptx/let
‑
7α
‑
gnr@msn的重量，w0是ptx投入的初始重量。
[0107]
结果如图11所示，图11a显示为高效液相色谱分析法测试得到的实验组ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn中ptx的特异峰面积，图11b为根据紫杉醇标准溶液得到的标准曲线，以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积为纵坐标得到标准曲线方程为y＝
‑
7.8
×
105+5.1
×
105×
x(r＝0.9909)，将实验组中测得的紫杉醇的峰面积带入标准曲线方程中，即得ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn中紫杉醇的载药量为3.82％，包封率为38.2％。
[0108]
为了获得mir let
‑
7α与共载体系统的最佳结合率，本发明以20μm为mir let
‑
7α的最终浓度，设置了一系列gnr@msn
‑
nh2和mir let
‑
7α的比例梯度，采用凝胶阻滞法确定gnr@msn
‑
nh2和mir let
‑
7α的最佳比例。其中比例梯度分别为0、40:1、80:1、120:1、160:1、200:1、240:1和280:1(w/w)，从小到大依次为a组至h组。
[0109]
结果如图12所示，随着gnr@msn
‑
nh2和mir let
‑
7α比例的增大，琼脂糖凝胶电泳图谱中条带越模糊，甚至于消失。在比例为200:1时，上清液中未发现游离的mir let
‑
7α，表明在此比例下，mir let
‑
7α与gnr@msn
‑
nh2结合完全。
[0110]
实验例4
[0111]
ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn共递送纳米系统的体外抗增殖能力和治疗作用
[0112]
4.1mtt法检测ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn共递送纳米系统的体外抗增殖能力
[0113]
本发明采用mtt法检测各种治疗性纳米复合物的抗增殖能力，实验过程与实验例2中2.1部分mtt法相同。结果如图13所示，图13a、13b显示靶向ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn对skov3和skov3
tr
细胞的治疗效果优于非靶向ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn，但是与skov3细胞相比，经ptx处理的skov3
tr
细胞对靶向药物和非靶向药物的敏感程度都较低，skov3
tr
细胞生存率较skov3细胞略高。其原因可能是skov3
tr
细胞中p
‑
gp(p
‑
糖蛋白)高表达，可诱导部分药物的主动排出。图13c显示靶向ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr处理的skov3
tr
细胞的增殖能力明显低于无靶向ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn处理的skov3
tr
细胞，表明ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn共递送纳米系统可有效增强治疗的效果。
[0114]
4.2双重染色法评估ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn共递送纳米系统转染细胞的活力
[0115]
本发明还采用fda(荧光素二乙酸酯)和pi(碘化丙啶)双重染色法评估细胞活力。具体过程为：用pbs洗涤过的各种治疗性纳米复合物处理skov3和skov3
tr
细胞，并分别用1μg/ml的fda和20μg/ml的pi孵育5分钟。然后用pbs洗涤细胞并在倒置eclipse te2000
‑
u荧光显微镜下拍摄。实验设置a组添加等量生理盐水为对照组，所述各种治疗性纳米复合物指实施例1与对比例1至3得到的产物ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn(b组)、ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn(c组)、ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn(d组)、ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn(e组)。fda/pi双染色结果显示(图13d、13e)，与无靶向ptx/let
‑
7α
‑
pgnr@msn相比，靶向ha
‑
ptx/let
‑
7α
‑
pgnr@msn具有更好的治疗效果。
[0116]
4.3蛋白印迹法检测p
‑
gp在skov3
tr
细胞中的表达分析
[0117]
本发明还采用蛋白印迹法检测p
‑
gp在skov3
tr
细胞中的表达，蛋白印迹法处理的过程为：本实验中除了浓度梯度以外实验均选用100μg/ml的纳米颗粒浓度作为实验浓度，本申请实施例1与对比例1至3制备得到的各种治疗性纳米复合物处理的skov3和skov3
tr
细胞
在裂解缓冲液裂解，然后在100℃恒温金属浴中煮沸5min得到总蛋白提取物。接着采用12％的十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)分离10μg总蛋白提取物，并转移至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(merck millipore，burlington，ma，usa)上，在含8％(w/v)脱脂牛奶的0.05％的磷酸盐缓冲盐水
‑
吐温20(pbst)缓冲液中封闭1h。用pbst缓冲液洗涤pvdf膜，然后在4℃下与一级抗体(与一抗稀释液以1:5000或1:10000比例稀释)和保证pvdf膜完全浸没的辣根过氧化物酶(hrp)结合的二级抗体(与二抗稀释液以1:10000或1:20000比例稀释)在室温下孵育1h。最后，利用pierce
‑
ecl免疫印迹底物(thermo
‑
fisher
‑
scientific)产生免疫反应条带，并将相对蛋白量标准化为甘油醛3
‑
磷酸脱氢酶(gadph)水平。
[0118]
其中各种治疗性纳米复合物为本发明实施例1与对比例1至3得到的产物：c组ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn，d组ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn，e组ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn，f组ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn。缓冲液成分为：50mm ph为7.4的tris
‑
hcl溶液，150mm的nacl，1％的np
‑
40，0.5％的右乙胆酸钠，0.1％的十二烷基硫酸钠(sds)，2mm的苯甲基磺酰氟(pmsf)。
[0119]
结果如图14所示，和ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn组相比，p
‑
gp在靶向ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组的表达较低(图14a)，表明let
‑
7α能有效降低p
‑
gp的表达，从而进一步降低skov3
tr
细胞的ptx的耐药性。p
‑
gp在靶向共递送ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组中的表达最低(图14a)，表明mir let
‑
7α进一步增强ptx的化疗效果并促进skov3
tr
细胞凋亡。图14b为与图14a对应的各组别中p
‑
gp蛋白相对含量柱状图。
[0120]
此外，在上述结论的基础上，本发明分别配制25、50、100、200、400μg/ml的ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn溶液处理skov3
tr
细胞，探究了添加不同浓度ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn时skov3
tr
细胞中p
‑
gp的表达情况。结果如图15所示，其中图15a为p
‑
gp表达水平电泳图，可知随着添加ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn浓度的升高，p
‑
gp表达量降低。图15b为与图15a对应的各组别中p
‑
gp蛋白相对含量柱状图。由此可知本发明提供的ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn靶向药物共递送纳米系统有效逆转了skov3
tr
细胞的mdr。
[0121]
实验例5
[0122]
细胞凋亡机制分析
[0123]
5.1凋亡细胞的核分裂过程
[0124]
为了观察凋亡细胞的核分裂过程，本发明采用hoechst 33258检测了不同纳米复合治疗剂对skov3和skov3
tr
细胞凋亡的影响。具体实验过程如下：将skov3和skov3
tr
细胞在24孔板上培养12h，接着分别加入100μg/ml本申请实施例1与对比例1至3得到的ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn(b组)、ha
‑
ptx
‑
pgnr@msn(c组)、ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn(d组)和ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn(e组)，a组设置为添加等量的生理盐水作对照组。处理24h后，去除药物和原培养液，用pbs清洗一次处理过的细胞。然后向每个孔中添加500μl的0.5mg/ml的hoechst 33258染液，在黑暗中培养20min。用pbs洗涤细胞两次，除去未反应的染色液，即得待检测样品。将待检测样品放置在倒置eclipse
‑
te2000
‑
u荧光显微镜下进行观察。
[0125]
结果如图16所示，经过hoechst 33258染色处理的skov3和skov3
tr
凋亡细胞的典型变化为染色质凝聚、核周聚集和核碎裂(图16a、图16b)，且随着本发明实施例1得到的ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn添加浓度的增加，skov3和skov3
tr
细胞的核碎裂和染色质凝聚显著增加，细胞凋亡率增加(图16c)。
[0126]
5.2不同治疗性纳米复合物处理的skov3
tr
细胞凋亡相关蛋白的蛋白印迹和相对蛋
白水平的统计分析
[0127]
髓系白血病因子
‑
1(myeloid leukemia factor
‑
1，mcl
‑
1)是b细胞淋巴瘤2(b
‑
cell lymphoma 2，bcl
‑
2)家族的抗凋亡成员，在癌细胞中高表达。mcl
‑
1的表达不仅促进肿瘤的发生和发展，而且可以使癌细胞对化疗药物产生耐药性。本实验不同治疗性纳米复合物处理的skov3
tr
细胞的过程除了不进行hoechst 33258染色处理外，其余与实验例5.1过程相同。
[0128]
结果如图17所示，mcl
‑
1在靶向共递送ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组中的表达显著降低，表明skov3
tr
细胞对ptx的敏感性显著增加，并进一步诱导细胞凋亡图(17a)。图17b为不同治疗性纳米复合物处理的skov3
tr
细胞凋亡相关蛋白的相对蛋白水平的统计分析，结论与图17a相同。
[0129]
与实验例4.3相同，本发明探究了添加不同浓度25、50、100、200、400μg/ml的ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn溶液对skov3
tr
细胞中的mcl
‑
1的表达水平的影响。结果如图17所示，mcl
‑
1的表达也随着ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn浓度的增加而降低(图17c和17d)。和其他组相比，在靶向共递送ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组的skov3
tr
细胞中，促凋亡bcl
‑
2相关x蛋白(bcl
‑2‑
associated x protein，bax)表达增加，而抗凋亡特大型b细胞淋巴瘤(bcl
‑
xl)表达降低，表明本发明得到的ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn靶向药物共递送系统可以实现skov3
tr
细胞的mdr的逆转。
[0130]
5.3v
–
fitc/pi染色法流式细胞术检测细胞凋亡
[0131]
本发明采用annexin v
‑
fitc和pi双染色法检测skov3和skov3
tr
细胞凋亡。具体实验过程为：首先用0.25％胰蛋白酶消化处理skov3和skov3
tr
细胞，然后1000转离心5分钟，弃去上清收集处理后的细胞。将细胞重新悬浮在500μl的pbs中，然后分别添加5μl膜联蛋白v
–
fitc和pi。在室温下将混合物在黑暗中培养10min，得到待检测样品细胞。使用facs calibur流式细胞仪(bd biosciences，san jose，ca，usa)和cell quest软件(bd biosciences)对待检测细胞进行分析。
[0132]
利用annexin v
‑
fitc和pi染色进一步检测mdr逆转的机制。结果如图18所示，根据荧光强度将处理后的细胞分为四个象限：活细胞(live)、早期凋亡细胞(early apoptosis)、晚期凋亡细胞(late apoptosis)和坏死细胞(necrotize)(图18a1
‑
a5、b1
‑
b5)。图18c、18d分别对各组四个象限中细胞群做了定量分析，结果表明ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn作用24h后，skov3和skov3
tr
细胞存活率分别为29.1％和42.8％，表明ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn靶向药物共递送纳米系统明显促进细胞凋亡。且早期凋亡细胞的数量明显高于晚期凋亡细胞，这可能是由于磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)从细胞膜内部到表面的逆转以及暴露于细胞外环境所致。
[0133]
实验例6
[0134]
治疗性纳米复合物对相关细胞器和mtor介导的信号通路的影响
[0135]
6.1各种治疗性纳米复合物对囊泡的影响
[0136]
为了确定本发明实施例1与对比例1至3得到的各种治疗性纳米复合物对囊泡的影响，采用吖啶橙(ao)染色液对skov3和skov3
tr
细胞进行染色。实验过程为：用实施例1与对比例1至3得到的各种治疗性纳米复合物处理skov3和skov3
tr
细胞24h，然后用pbs洗涤细胞两次，再悬浮在300μl的pbs中。接着向其中加入300μl的0.01％的ao染色液，在室温黑暗中处
理15min。处理完成后再次用pbs洗涤细胞两次，并在倒置荧光eclipse te2000
‑
u显微镜下成像。
[0137]
结果如图19所示，与其他组相比，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn靶向药物共递送系统处理的skov3和skov3
tr
细胞的细胞质中诱导的红色荧光点数量显著增加，表明酸性小室如溶酶体和自噬溶酶体减少。
[0138]
6.2线粒体膜电位检测
[0139]
电化学势能储存在线粒体内膜中。如果质子和其他离子浓度在膜两侧不对称分布，线粒体膜电位呈上升趋势，称为“mmp”。本发明采用罗丹明123染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，mmp)，具体过程为：用实施例1、对比例1至对比例3得到的各种治疗性纳米复合物处理skov3和skov3t细胞24小时，用pbs洗涤两次，用50μg/ml罗丹明123染色，并在黑暗中培养30min。接下来，用pbs再次洗涤细胞两次，并在倒置的eclipsete2000
‑
u荧光显微镜下成像。
[0140]
结果如图20所示，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn诱导细胞内绿色荧光聚集体增加，表明线粒体内膜去极化(图20a和20b)，线粒体膜电位的去极化过程会导致线粒体释放大量细胞色素c到胞浆中，引起细胞凋亡过程。与对照组及其他治疗性纳米复合物相比，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组细胞的凋亡率更加显著。
[0141]
6.3活性氧分析
[0142]
采用实施例1、对比例1至3得到的不同纳米复合材料处理的skov3和skov3
tr
细胞用pbs洗涤两次，在无fbs培养基中用50μm的dcfh
‑
da染料处理，并在黑暗中培养15min。接下来，用pbs再次洗涤细胞两次，并用流式细胞仪分析活性氧(ros)。
[0143]
结果如图21所示，与对照组相比及其他治疗性纳米复合物相比，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组细胞内ros水平显著升高，表明由线粒体功能改变引起的ros产生更显著，与癌细胞凋亡率呈正相关。
[0144]
6.4治疗性纳米复合物对mtor介导的信号通路的影响
[0145]
雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mtor)是一种重要的细胞生长和增殖调节因子。mtor信号通路的异常调控与细胞增殖密切相关。信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，stat)是一个高度保守的转录因子家族，细胞外信号可刺激其在细胞质中发生完全磷酸化和易位。stat3是stat家族的七个成员之一，参与着细胞周期、凋亡调控、肿瘤血管生成、肿瘤细胞侵袭、转移和免疫逃逸。ezh2(enhancer of zeste homolog 2)在肿瘤耐药细胞中高表达，具有组蛋白甲基转移酶活性，参与着x染色体失活、细胞分化和胚胎发育调控。
[0146]
用各种治疗性纳米复合物处理24h后，对skov3和skov3
tr
细胞中的mtor相关蛋白进行蛋白印迹分析和相应的定量分析。结果如图22所示，mtor表达降低，导致stat3水平迅速下降，并降低其调节蛋白的磷酸化水平，降低ezh2的组蛋白甲基转移酶活性(图22a、22b)。这些级联反应有助于证明ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn具有能够逆转mdr并抑制skov3
tr
细胞的细胞增殖的能力。
[0147]
实验例7
[0148]
卵巢癌mdr逆转的体内研究
[0149]
7.1skov3
tr
肿瘤异种移植模型的建立
[0150]
本发明实验所用小鼠来源为武汉实验动物有限公司(武汉，中国)获得了4周龄的雄性balb/c
‑
nu小鼠，并将其置于无特定病原体(specific pathogen
‑
free，spf)条件下。所有动物实验均按照郑州大学动物护理与使用委员会(中国郑州)的指导方针进行。
[0151]
本发明采用指数生长期的skov3
tr
细胞制备了100μl细胞悬液(密度为8
×
106个细胞)。将细胞悬浮液皮下接种到小鼠背部皮下。每天观察小鼠的健康状况和行为，每2天记录肿瘤体积和体重。肿瘤体积计算公式为v＝1/2
×
a
×
b2,其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。肿瘤抑制率计算公式为r(％)＝(1
–
v
t
/v0)
×
100,其中vt和v0分别为治疗组和对照组的肿瘤体积。当肿瘤平均体积达到30mm3时，注射本发明实施例1、对比例1至对比例3制备得到的各种治疗性纳米复合物。
[0152]
7.2药物干预和组织病理学分析
[0153]
将成功建立的skov3
tr
肿瘤异种移植模型中的balb/c
‑
nu小鼠随机分为5组，分别用以下本发明实施例1、对比例1至对比例3制备得到的治疗性纳米复合材料进行处理：ha
‑
mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn、ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn、ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn和ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn。对照组注射等量的生理盐水。按照每2天15mg/kg(200μl)的注射量将上述纳米复合物分别进行瘤内注射。药物处理完成后(第15天)处死小鼠，取肿瘤及主要脏器(肝、心、肺、肾、脾)进行苏木精
‑
伊红(hematoxylin and eosin,h&e)染色、末端脱氧核苷酸转移dutp缺口末端标记(tunel)染色和抗原ki
‑
67染色进行组织病理学分析。最后通过蛋白印迹试验分析相应的肿瘤部位并检测p
‑
gp的表达水平。
[0154]
结果如图23所示，图23a为纳米复合治疗的实验流程示意图。处理15天后，处死小鼠，收集主要器官和肿瘤组织。结果发现所有小鼠的体重没有显著变化(图23b)，表明ha
‑
pgnr@msn纳米载体在治疗过程中不会产生明显的体内毒性。但是与非靶向ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组相比，靶向共传递ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组小鼠体内肿瘤的体积更小，具有有更好的治疗效果。此外，使用ha
‑
pgnr@msn作为纳米载体的ptx/mir的共递送能够在瘤内给药后有效抑制skov3
tr
细胞的生长，并对肿瘤生长具有协同抑制作用(图24a
–
24b)。
[0155]
在ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn治疗后，癌组织中的p
‑
gp水平显著降低，这与体外实验一致(图25a)。与其他组相比，靶向共传递ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组的tunel染色结果显示染色信号减弱，提示其癌细胞凋亡增加。在靶向共传递ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组中，h&e染色清楚地显示出明显的实体瘤破坏(图25b)。肿瘤组织中的ki
‑
67水平的降低也表明ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn治疗后肿瘤的增殖能力和恶性程度降低(图25b)。此外，靶向共递送ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn组对主要器官无明显损伤，进一步说明了纳米载体的低毒性和良好的安全性(图26)。
[0156]
图27所示为本发明ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
gnr@msn靶向药物共递送纳米系统在卵巢癌肿瘤组织中的靶向给药及治疗机制示意图，图中显示小鼠体内形成卵巢癌肿瘤后给药，共递送纳米系统可以与cd44受体特异性结合靶向肿瘤细胞，释放化疗药物ptx和基因药物mir let
‑
7α。药物发挥作用后，肿瘤细胞内的相关影响因子变化与实验例6、实验例7结果描述一致，最终p
‑
gp表达水平降低，达到治疗卵巢癌的目的。
[0157]
综上，本发明提供了一种靶向药物共递送纳米系统，ha
‑
ptx/mir let
‑
7α
‑
pgnr@msn，该共递送纳米系统可有效逆转卵巢癌的多药耐药性。该共递送纳米系统由金纳米棒和氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子构成共载体纳米系统，具有较大的比表面积，有助于提
高药物的负载量；且该共载体纳米系统具有良好的稳定性和生物相容性，对生物体的毒性较小。
[0158]
该纳米系统实现了mir let
‑
7α和ptx的共递送：共载体纳米系统载药后由peg进行修饰，提高了共递送系统在血液的停留时间，对药物输送起到了良好的保护作用，mir let
‑
7α/ptx复合物可通过该纳米系统有效地共传递到skov3/skov3
tr
细胞和卵巢癌组织中，ha修饰后可与skov3/skov3
tr
细胞中高表达的cd44受体特异性结合，能够实现更加有效的细胞摄取，并且使肿瘤部位的通透性。并且，mir let
‑
7α可以降低p
‑
gp表达，逆转skov3
tr
细胞和卵巢癌组织的耐药性，增强ptx的治疗效果，从而提高治疗效率。
[0159]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。