一种金樱子三萜类化合物抗阿尔茨海默症的方法

本发明涉及一种生物医药化合物抗阿尔茨海默症的方法，特别是涉及一种金樱子三萜类化合物抗阿尔茨海默症的方法，具体为一种基于网络药理学分析金樱子中三萜类化合物抗阿尔茨海默症作用机制的方法。

背景技术：

阿尔茨海默病(ad),是以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的原发性中枢神经系统退行性疾病,主要发生于老年前期和老年期,严重影响老年人的生活质量与独立性。ad的病理学特征主要为脑内有大量的老年斑(sp)神经元纤维缠结(nfts)及特定脑区选择性神经元和突触丢失"。目前,国内外尚无根治ad的药物,中医药通过辨证论治与运用复方，从不同靶点、不同途径。不同环节进行整体调节,在治疗中起到越来越重要的作用。众多针对单一靶点的抗ad药物在i期临床试验中遭遇失败,表明药物研究的思路应向多成分、多靶点、多通路的方向转变。天然产物多靶点的药理.学活性特点，使其较西药而言,具有得天独厚的优势。

金樱子（rosalaevigatamichx.）是一种经常使用的中草药材。

具有抗氧化、调节免疫、抗菌、抗炎、降糖降脂等相关的功效。金樱子酒还能产生一种活性物质，而这些物质是可以帮助我们消除人体自由基，能够减少老年痴呆症的发病率，有延缓衰老的作用。

网络药理学,突破了传统“单药物,单靶点”药物研发模式的瓶颈，并提供了一种基于“多药物，多靶点”相互作用关系的药物研发新模式和新思路,这与中药的多成分、多靶点、多途径等特点正好吻合。

因此,借鉴网络药理学的理念和方法进行中药研发,有可能为中药药效物质基础研究和相应靶点发现等带来前所未有的机遇。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种金樱子三萜类化合物抗阿尔茨海默症的方法，该方法基于网络药理学分析金樱子中三萜类化合物抗阿尔茨海默症作用机制，通过结合多个网络药理学数据库，进行大数据分析，在阿尔兹海默症背景下对可能具有潜在治疗功能的金樱子三萜类化合物靶点进行全面筛查，并预测了金樱子三萜类化合物在阿尔茨海默症发生发展中具有的调控潜力。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种金樱子三萜类化合物抗阿尔茨海默症的方法，所述方法包括以下步骤:：

s1、金樱子中三萜类化合物库的建立

运用在线数据库（tcmsp和知网）筛选金樱子中分离得到的三萜类化合物名称和结构，利用画图软件画出所有化合物的2d结构，同时将筛选出的所有金樱子中分离出的三萜类化合物结构转化为对应的3d结构；

s2、阿尔茨海默症蛋白的准备

在drugbank、uniport、rcsbpdb、omim数据库中，以“阿尔茨海默症”作为关键词检索查找，确定筛选条件，对蛋白进一步筛选，最后将满足条件的蛋白下载保存；

s3、分子对接

依次将s2中得到的阿尔兹海默症蛋白与s1中得到的所有小分子化合物进行对接，打分；将对接活性高的化合物予以保存；

s4、构建成分靶点-疾病靶点网络及筛选核心靶点

将运用string数据库分析s3中选中的化合物，得到靶点蛋白网络关系图（ppi网络）；用软件分析网络节点的拓扑结构特征参数，建立金樱子三萜类化合物-阿尔茨海默症核心靶点图，筛选核心靶点并进行后续筛选分析；

s5、对核心靶点富集分析以探讨药物成分作用机制

利用r语言相关包对核心靶点进行go生物过程和kegg通路注释富集分析，输出相应图表，对照解析金樱子三萜类化合物-阿尔茨海默症的作用机制；

s6、“成分-靶点-疾病通路”网络构建

根据s5结果构建“药物-靶点-疾病通路”可视化图形；具体应用r语言中“pathview”包将kegg富集通路的相关靶点映射到通路图，便于进行后续分析；

s7、进行体外活性验证

将网络药理学得到的金樱子三萜类化合物抗阿尔茨海默症的核心靶点以及相关化合物进行直接靶标实验，神经细胞保护活性验证，分子动力学模拟。

所述的一种金樱子三萜类化合物抗阿尔茨海默症的方法，所述s3中分子对接筛选打分为score>5。

所述的一种金樱子三萜类化合物抗阿尔茨海默症的方法，所述s2中筛选条件为选择分辨率在3.00å以下，阿尔兹海默症，人源，含有配体。

所述的一种金樱子三萜类化合物抗阿尔茨海默症的方法，所述配体不能是离子。

本发明的优点与效果是：

1.本发明利用网络药理学技术首次构建了金樱子三萜类化合物-阿尔茨海默症的“药物成分—靶点—疾病通路”网络图，揭示了活性成分金樱子三萜类化合物如何通过“多靶点、多通路、多途径”联合调控，发挥其药效。本发明方法为阐释金樱子三萜类化合物发挥抗阿尔茨海默症作用研究机制提供了新思路，这些系统生物学信息将在未来的研究中得到验证，进一步为金樱子三萜类化合物用于阿尔茨海默症的防治提供了前期研究基础。

2.本发明将药物作用疾病的研究方法网络化、系统化，传统研究方法相比，将研发范围缩小化，研发目的精确化从而节省了药物研发费用。同时大幅度提高了药物筛选和预测的效率，这给金樱子三萜类化合物等其他天然活性成分研发提供了新参考，对我国丰富中药资源的开发与产业化具有突破性意义。

附图说明

图1为金樱子三萜类化合物抗阿尔茨海默症靶点蛋白ppi图；

图2为金樱子三萜类化合物-阿尔茨海默症核心靶点图（c-t网络）；

图3为金樱子三萜类化合物-阿尔茨海默症go生物过程柱状图；

图4为金樱子三萜类化合物-阿尔茨海默症kegg通路富集气泡；

图5为金樱子三萜类化合物-阿尔茨海默症-疾病通路图；

图6为ache和bche直接靶标实验；

图7为金樱子三萜类化合物神经细胞保护活性图；

图8为化合物28与bace1的结合相互作用模式图；

图9为化合物28与bace2的结合相互作用模式图。

具体实施方式

下面结合附图所示实施例对本发明进行详细说明。为使本发明的目的、技术方案和优点更清晰明了，下面将通过具体实施例结合附图表对本发明进一步说明与描述。

1、基于网络药理学分析金樱子三萜类化合物-阿尔茨海默症作用机制的方法

1.1金樱子三萜类化合物筛选

以“金樱子三萜类化合物”为关键词于tcmsp数据库并在知网等平台查阅文献参阅搜索，筛选出三萜类化合物并得到金樱子中分离出的化合物结构，利用软件画出所有化合物的2d结构，让后将从金樱子中分离得到的化合物复制粘贴到3d软件中，将其转化为3d结构并保存为mol2格式。

1.2阿尔兹海默症候选靶点筛选

以“阿尔兹海默症”为关键词，应用在drugbank、uniport、rcsbpdb、omim数据库进行检索，选择选择分辨率在3.00å以下，阿尔兹海默症，人源，含有配体（配体不能是离子）条件对这个蛋白进一步筛选，最后将满足这些条件的进行下载并予以保存。

1.3分子对接

利用开源软件，依次将s2中得到的阿尔兹海默症蛋白与s1中得到的所有小分子化合物进行对接，打分；本次实验将score>5为结合具有显著性。并且将筛选后的化合物分别保存到相应文档。

1.4构建金樱子三萜类化合物靶点-阿尔兹海默症靶点网络及筛选核心靶点

运用string数据库分析s3筛选出的化合物，得到靶点蛋白网络关系图（ppi网络）。运用cytoscape软件导入交集靶点，得到c-t网络，筛选符合条件的核心靶点将进行下一步分析。

1.5对核心靶点富集分析以探讨药物成分作用机制

应用r语言的“clusterprofiler”、“reactomepa”等相关r包对1.4的核心靶点进行基因本体go生物过程和kegg通路富集注释分析，输出其相应的气泡图和柱状图，预测靶点的功能分布，并根据富集因子分析核心通路富集程度，得到关键核心靶点参与的关键通路信息，从而解析金樱子三萜类化合物-阿尔茨海默症的作用机制。

1.6采用cytoscape软件构件金樱子三萜类化合物抗ad的“成分-靶点-疾病”网络图，以呈现金樱子如何通过“多靶点、多途径、多层次”整合调控发挥药效。

1.7进行体外活性验证

通过直接靶标实验，细胞水平，分子动力学模拟进一步验证通过网络药理学筛选出金樱子抗阿尔兹海默症的关键化合物和核心靶蛋白的真实性。

2、结果

2.1金樱子中三萜类活性化合物筛选

通过tcmsp数据库，查找相关文献等检索阿尔茨海默症作用靶点，经重复筛除及矫正得到69种三萜皂苷。部分成分见表1。

表1部分金樱子三萜类化合物活性成分

2.2阿尔兹海默症候选靶点筛选

以”阿尔茨海默症“为关键词，应用数据库在drugbank、uniport、rcsbpdb、omim数据库进行检索得到66种潜在的阿尔兹海默症信息，具体见表2

表2潜在的ad靶蛋白的信息

2.3分子对接

利用开源软件，依次将以上操作中得到的阿尔兹海默症蛋白与小分子化合物进行对接，打分；本次实验将score>5的成分和化合物保存（部分打分结果见表3）。共筛选出55个靶蛋白（附表1）和69的有效成分（附表2）。

表3部分ad潜在蛋白和化合物的对接分数

2.4构建金樱子三萜类化合物靶点-ad靶点网络及筛选核心靶点

运用string数据库构建金樱子治疗阿尔茨海默症的靶点及其功能相关蛋白作用网络，结果见图1。运用cytoscape软件导入交集靶点，得到c-t网络，它由124个“节点”（69个成分，55个靶点）和872条“边”构成：结果见图2（菱形形状的节点表示对化合物和目标蛋白质之间的交集有影响的化合物，圆形节点对应于目标蛋白质，更大和较暗的节点表示更紧密的关联。）并从中获得12个核心靶点，分别为bace2bchekmobace2gapdhshsd17b10maptacenckap1gabbr1achecfh,具体见表4

表4表示金樱子三萜类化合物-阿阿尔兹海默症的核心靶点信息

2.5生物功能与通路分析

2.5.1go富集分析

为进一步明确核心靶点生物学过程，通过r语言相关包对55个核心靶点进行基因本体go富集分析，获取生物学过程(biologicalprocess)、细胞组分(cellularcomponent)和分子功能(molecularfunction)富集结果，选取最具有统计学意义的前20条结果做成柱状图，结果见图3。可得生物学过程中的多细胞有机体过程（multicellularorganismalprocess）、生物质量的调节（regulationofbiologicalquality）、压力反应（respondstostress）、蛋白质代谢过程的调节（regulationofproteinmetabolicprocess）、本地化的调节（regulationoflocalization）、细胞死亡的调节等作用突出（regulationofcelldeath）。细胞组分中质膜（plasmamembrane）、细胞外围（cellperiphery）、囊泡（vesicle）、细胞外围（cellperiphery）、内膜系统（endomembranesystem）、胞外区（extracellularregion）等较重要。分子功能中与酶结合和相同的蛋白质结合等相关，而蛋白结合功效尤为显著。

2.5.2kegg通路注释分析

对筛选出来的靶点进行kegg通路富集分析，根据p-value值，可得有7条通路相关性较高，见图4。如图4所示：纵坐标代表通路的名称，横坐标代表富集基因的比率，图中点颜色代表富集的程度，越红富集程度越高，而点的大小的代表富集的基因数目，点越大代表位于该通路的基因数目越多。

kegg通路富集结果显示金樱子三萜类化合物防治ad的kegg通路富集与阿尔茨海默病（alzheimer’sdisease）、（hif-1信号通路hif-1signalingpathway）、钙信号通路查加斯病（美国锥虫病）（calciumsignalingpathwaychagasdisease(americantrypanosomiasis)）、notch信号通路（notchsignalingpathway）等通路密切相关。

2.6构建金樱子三萜类化合物成分-靶点-疾病网络

分析金樱子三萜类化合物成分-靶点-疾病网络图，见图5，它由131个“节点”（69个成分，55个靶点，7种与ad相关的疾病）和908条“边”构成：左边的菱形形状的节点表示对化合物和目标蛋白质之间的交集有影响的化合物，中间的圆形节点对应于目标蛋白质，右边的三角节点对应于有关疾病的标识。更大和较暗的节点表示更紧密的关联。边表示化合物、靶点和通路之间的关系。结果显示金樱子治疗阿尔茨海默症的活性成分有55种，关键成分有47、35、54、34、55、30、28、31、29、40、56、68、66等（化合物编号见附表2），关键靶点有bace1、bche、bace2、kmo、gapdhs、hsd17b10、mapt、ace、nckapi、gabbr1、ache、cfh等，主要涉及通路有阿尔茨海默病、hif-1信号通路、钙信号通路查加斯病（美国锥虫病）等。每种活性成分对应多个靶点，每个靶点又联系多种成分，体现了金樱子多成分、多靶点镇痛作用机理，同时通路间又通过共有靶点连接且非独立，进一步说明通路间是协同发挥相互作用。

综上所述，基于网络药理学分析金樱子活性成分抗阿尔兹海默症作用的方法选出与金樱子三萜类化合物抗阿尔兹海默症相关的13个关键活性成分及12核心靶点，结果表明bace1、bche、bace2、kmo、gapdhs、hsd17b10、mapt、ace、nckapi、gabbr1、ache、cfh是关键靶蛋白。

据报道，乙酰胆碱酯酶（ache）是一种丝氨酸蛋白酶，丁酰胆碱酯酶（bche）是丝氨酸酯酶家族成员。乙酰胆碱酯酶主要功能是将作为神经递质的乙酰胆碱水解，起着终止神经传导的作用。另外ache也参与了神经细胞的成熟和发育，能促进神经元的再生和发育。基于ad发病机制的胆碱能假说，抑制ache的活性可显著增加中枢乙酰胆碱的含量，使乙酰胆碱得以在突触处积累。bche同ache一样,与a-β蛋白共存于老年斑和神经纤维缠结中。bche能促使乙酰胆碱分解增加、表达下调，从而引起胆碱能神经递质传递障碍，导致并加重阿尔茨海默病。据有关研究还发现bche出现在老年斑形成前期,参与了a-β淀粉样蛋白沉积从良性到恶性转变的传递过程，而可能导致过多分泌型a-β淀粉样蛋白在ache启动及bche协助下与载脂蛋白e结合沉积脑内,使此部位胆碱能神经原损毁以至死亡,中枢及整个脑组织中ach减少,出现智能障碍,形成痴呆。bace1通过蛋白裂解app起始aβ生成。bace1基因表达在app处理过程中具有至关重要的作用。已有大量研究表明bace1基因删除或表达抑制后,aβ生成显著减少甚至消失,能有效抑制或改善ad样表现和病理。当受细胞外界刺激时，可以激活一些关键信号级联反应，如nf-κb信号通路。本发明在生物信息学数据和富集分析的共同作用下，揭示了金樱子抗阿尔兹海默症所涉及到的基因靶点、生物过程和药理学途径，其特点是对细胞坏死和炎症相关的信号通路具有特异性抑制作用。

2.7、体外活性验证

2.7.1直接靶标实验

2.7.1.1抑制ache和bche活性实验

将上述筛选出来的化合物（8,9,11,23,18,20,24,28,50and51）分别与ache和bche进行直接靶标实验，具体见图6。图6.a显示化合物（8,9,11,23,18,20,24,28,50and51）均随着量的增大而对ache的活性抑制效果增强，其中化合物8在150μg/ml时对ache的抑制活性最强。图6.b显示化合物（8,9,11,23,18,20,24,28,50and51）均随着量的增大而对ache的活性抑制效果增强，其中化合物23在150μg/ml时对bche的抑制活性最强。

2.7.1.2bace1和bace2抑制活性实验

化合物（8,9,11,23,18,20,24,28,50and51）分别与ache和bche进行直接靶标实验，具体见表5.

表5金樱子三萜类化合物对bace1和bace2抑制率

通过表a得到化合物28对bace1和bace2都具有很好的抑制活性。

2.7.2神经细胞保护活性验证

使用mtt分析化合物（8、9、11、23、18、20、24、28、50和51）对sh-sy5y细胞中h2o2诱导的损伤的神经保护作用，具体见图7（注：与h2o2处理的细胞组相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001）。与h2o2处理的细胞组相比，化合物8，9，11，20，23，28，50，51组的存活率明显提高（^*p<0.05），提示这些化合物对sh-sy5y细胞的氧自由基损伤具有保护作用。

2.7.3分子动力学模拟

由直接靶标实验得到的结果分析化合物28对bace1和bace2都具有很好的抑制活性。将此4组进行分子动力学模拟如图8和9。

利用分子动力学模拟工具，将以上2组进行分子动力学模拟分析，通过对rmsd值、活性口袋处结构对比已经整体构想分析等确定化合物28对bace1或bace2有稳定的结合。也再次确定了分子对接的准确性和网路药理学的准确性。

3、结论

网络药理学技术可用于研究茯苓聚糖抗腺性膀胱炎的候选及核心靶点、生物学过程、分子作用机制。本发明结果显示金樱子三萜类化合物“多成分-多靶点-多通路”抗ad作用特点，并通过体外活性验证进一步确认了网络药理学的准确性。

应理解以上具体实施例仅是对本发明的技术方案及核心原理的理解，并不是对本发明范围的限制。对于本领域技术人员，依据本发明的核心原理，可对本实施例各条件和参数根据需要而变动，但这些等价变化与修饰，仍均属于本发明的保护范围。

附表1

附表2