一种高取向高强度的细菌纤维素复合膜及制备与应用

1.本发明属于生物制造技术领域，更具体地，涉及一种高取向高强度的细菌纤维素复合膜及制备与应用。


背景技术：

2.伤口愈合是一个复杂但有序进行的生物过程，包括炎症、肉芽组织形成、组织重塑和再上皮化这四个过程，在这一系列过程中细胞迁移发挥了重要作用。在伤口愈合过程中，成纤维细胞向胶原排列的方向迁移，有助于细胞外基质(ecm)的产生和基质的重建，从而促进伤口愈合。相反，细胞运动能力的丧失和紊乱的细胞迁移可能会导致生理异常，最终导致伤口愈合失败。因此，建立一个伤口治疗的方法，用来调节细胞迁移，从而促进伤口愈合具有重要意义。目前，伤口敷料是最广泛使用的伤口护理方法。然而，传统的伤口敷料，如纱布、橡胶和泡沫，不能调节内源性细胞行为，从而导致被动的伤口修复过程以及炎症反应。因此，开发一种能够主动调控细胞迁移，加速皮肤创伤愈合过程的新的伤口治疗策略是非常有必要的。
3.为了解决上述问题，具有取向纳米纤维的生物材料引起研究人员的极大关注。这种材料可以模拟自然界中的许多软组织，并且可以诱导细胞迁移，细胞定向排列，以及促进伤口愈合。在这些纳米纤维材料中，细菌纤维素(bc)由于其高吸水能力、机械强度、柔韧性和无毒性，近年来作为伤口敷料受到广泛关注。然而，由于缺乏取向的纳米纤维结构，原始bc无法诱导细胞定向行为以促进伤口愈合。基于此，cn109384952b公开了一种图案化的细菌纤维素膜，具体公开了将聚二甲基硅氧烷的预聚物a与固化剂b混合均匀后加入有机溶剂，然后逐滴滴加水，同时进行搅拌，然后静置使其初步固化；并进行加热固化，去除有机溶剂和水，得到水乳化聚二甲基硅氧烷功能海绵；将图案化的聚二甲基硅氧烷(pdms)模板漂浮在能产生细菌纤维素的培养液的表面，经过发酵培养12
‑
48小时即可得到图案化的细菌纤维膜。这种图案化bc膜被证实可以在体外诱导细胞迁移、取向和极化，并在体内促进伤口愈合。然而，这种方法存在两个缺点。首先，向培养基中添加模板限制了细菌生长所需的氧气，从而降低了细菌分泌纤维的能力。其次，通过该方法产生的精确排列的图案通常不同于ecm的排列，因为ecm在其图案、含量和纤维厚度上存在多尺度差异，从而限制了该方法在组织工程中的应用。因此，为了获得bc的多尺度差异的图案化，机械拉伸法以其简单、低成本和多尺度纤维排列的优点而受到特别关注。然而，拉伸取向的bc基生物材料是否具有良好的伤口愈合应用前景尚不清楚。
4.此外，大量研究表明皮肤受损后会自然产生内源电场(ef)，其产生的电信号可以调节细胞行为(细胞迁移，细胞增殖等)，从而促进伤口愈合和组织再生。因此，为了模拟和延长内源ef，利用外源ef来诱导细胞迁移，加速伤口愈合引起了越来越多的关注。该方法还有很多优点，例如安全、有效和低成本。然而，单独的ef刺激无法覆盖整个伤口区域和保护伤口免受外界环境刺激，因此可能会造成伤口感染。
5.基于以上两点，开发了一种新的伤口护理系统，将具有纤维取向结构的bc基伤口
敷料耦合ef来达到加快细胞迁移以促进伤口愈合将会成为一个发展的趋势。尽管目前人们已经开发出多种bc基伤口敷料，但这些技术仍存在一定缺陷，如制备的bc基材料无纤维的定向排列，机械强度不强，不能协同电刺激作用，从而限制限制了其在伤口敷料方面的应用。


技术实现要素：

6.本发明解决了现有技术中图案化的细菌纤维素膜无纤维的定向排列，机械强度不高，生物相容性不好的技术问题。本发明的目的在于提供一种高取向高强度的细菌纤维素复合膜及其制备与应用，制备方法为将细菌纤维素膜进行机械拉伸，得到具有拉伸应变的细菌纤维素膜；将具有拉伸应变的细菌纤维素膜浸泡在天然高分子溶液中，再加入交联剂，使所述具有拉伸应变的细菌纤维素膜与天然高分子交联得到细菌纤维素复合膜。由本发明的制备方法得到细菌纤维素复合膜材料不仅具有优异的纤维取向度，机械性能和生物相容性，而且可以诱导细胞定向排列和细胞迁移。进一步地，该复合膜材料能耦合电刺激促进细胞定向迁移，进而促进伤口愈合，因此其在制备皮肤伤口敷料方面具有良好的应用前景。
7.本发明的第一方面，提供了一种细菌纤维素复合膜的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)将细菌纤维素膜进行机械拉伸，得到具有拉伸应变的细菌纤维素膜；
9.(2)将步骤(1)得到的具有拉伸应变的细菌纤维素膜浸泡在天然高分子溶液中，再加入交联剂，使所述具有拉伸应变的细菌纤维素膜与天然高分子交联得到细菌纤维素复合膜。
10.优选地，所述具有拉伸应变的细菌纤维素膜在拉伸方向上的长度相比于原始的细菌纤维素膜增加了40％以下。
11.优选地，所述具有拉伸应变的细菌纤维素膜在拉伸方向上的长度相比于原始的细菌纤维素膜增加了20％
‑
40％。
12.优选地，所述天然高分子为明胶、丝素蛋白、胶原蛋白和透明质酸中的任意一种；
13.优选地，所述浸泡的时间为3h
‑
24h，温度为30℃
‑
50℃；
14.优选地，所述交联剂为1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐与n
‑
羟基琥珀酰亚胺的混合物、二甲基亚砜和戊二醛中的任意一种。
15.优选地，所述步骤(2)之后还包括将细菌纤维素复合膜进行热压的步骤。
16.优选地，所述热压的应力为50n
‑
200n，热压的温度为50℃
‑
150℃，热压的时间为6h
‑
48h；
17.优选地，所述热压的应力为100n
‑
200n，热压的温度为60℃
‑
150℃，热压的时间为24h
‑
48h。
18.按照本发明的另一方面，提供了任一所述方法制备得到的细菌纤维素复合膜。
19.优选地，所述细菌纤维素复合膜的纳米纤维的取向与机械拉伸的方向的夹角小于等于10
°
的占9％
‑
91％。
20.优选地，所述细菌纤维素复合膜的厚度20μm
‑
50μm。
21.按照本发明的另一方面，提供了任一所述的细菌纤维素复合膜用于制备伤口敷料的应用；
22.优选地，所述伤口敷料用于促进细胞迁移、定向排列和粘附。
23.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
24.(1)本发明方法制备的高取向高强度的细菌纤维素复合膜在其表面和内部都有很好的纤维取向结构，并且随着拉伸应力的改变，取向度可调。
25.(2)本发明方法制备的高取向高强度的细菌纤维素复合膜中的天然高分子沿着纤维取向方向附着，并没有影响纤维的取向度。
26.(3)本发明方法制备的高取向高强度的细菌纤维素复合膜具有很好的机械强度，生物活性和生物相容性，能够诱导细胞迁移、定向排列和黏附，从而促进伤口愈合。
27.(4)本发明方法制备的高取向高强度的细菌纤维素复合膜能与电刺激耦合，协同提高细胞定向迁移，进一步加速伤口愈合。
28.(5)本发明制备工艺简单、易于控制、绿色环保、成本低廉，可以规模化生产。
附图说明
29.图1是本发明制备的不同拉伸应变的bc/gelatin膜fesem图。其中a、b、c和d分别为0％(未拉伸)，20％，30％和40％拉伸的bc/gelatin膜表面的fesem图像。其中e、f、g和h分别是0％，20％，30％和40％拉伸的bc/gelatin膜的纤维取向分布图，0
°
对应于拉伸方向。
30.图2是本发明制备的不同拉伸应变的bc/gelatin膜的机械性能测试图。
31.其中a、b和c分别为0％，20％，30％和40％拉伸的bc/gelatin膜的应力
‑
应变，拉伸强度和杨氏模量曲线(
*
p<0.05，
**
p<0.01，
***
p<0.005)。其中d所示为40％拉伸的bc/gelatin膜制成的折纸船，表明其可折叠特性。
32.图3是本发明制备的0％，20％，30％和40％拉伸的bc/gelatin膜的细胞增殖活力(cck
‑
8)检测结果图。其中tcp代表细胞培养板。
33.图4是本发明制备的0％，20％，30％和40％拉伸的bc/gelatin膜的血液相容性(溶血率)检测结果图，其中pc代表蒸馏水和nc代表生理盐水，分别用于阳性与阴性对照组。
34.图5是nih3t3细胞的激光共聚焦显微镜图，其中a、b、c和d分别为在本发明制备的0％，20％，30％和40％拉伸的bc/gelatin膜上培养5天后的激光共聚焦显微镜图。
35.图6是本发明制备的0％和40％拉伸的bc/gelatin膜上的nih3t3细胞在ef分别为0、50和150mv/mm时的3小时细胞迁移轨迹。
36.图7是细胞迁移取向度和细胞迁移速度图，其中a和b分别为本发明制备的0％和40％拉伸的bc/gelatin膜上的nih3t3细胞在ef分别为0、50和150mv/mm时的细胞迁移取向度和细胞迁移速度。
*
p<0.05，
**
p<0.01，
***
p<0.005，*是在相同ef刺激下各组之间比较的结果；
#
p<0.05，
##
p<0.01，
###
p<0.005，#是与40％上的细胞在没有ef下的比较；
&
p<0.05，
&&
p<0.01和
&&&
p<0.005，&是与0％上的细胞在没有ef下的比较。
37.图8是本发明制备的0％和40％拉伸的bc/gelatin膜，以及商业膜(tegaderm
tm film)耦合ef(150mv/mm)时修复大鼠皮肤损伤的数码照片。
38.图9是伤口宽度和高度的定量测试结果，其中a和b分别为本发明制备的0％和40％拉伸的bc/gelatin膜，以及商业膜(tegaderm
tm film)耦合ef(150mv/mm)时修复大鼠皮肤损伤的伤口宽度和高度的定量测试结果。
具体实施方式
39.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
40.本发明一种高取向高强度的细菌纤维素复合膜的制备方法，包括以下步骤：
41.(1)通过采用机械拉伸的方法，将长度为8cm
‑
15cm(优选长度为12cm)，宽度为1cm
‑
8cm(优选宽度为4cm)的细菌纤维素制备不同拉伸应变的细菌纤维素(bc)；拉伸应变小于等于40％(优选为40％)；
42.(2)将步骤(1)制备得到的细菌纤维素(bc)膜浸泡到一定浓度的天然高分子溶液中，浸泡时间为3h
‑
24h(优选为6h)，温度为30
‑
50℃(优选为37℃)，并在摇床充分震荡，震荡速度为50
‑
200rpm(优选为150rpm)，之后在交联剂作用下形成细菌纤维素复合膜。具体反应为在交联剂作用下，天然高分子上的羧基被活化，与氨基反应生成酰胺交联，同时结合细菌纤维素上的羟基，得到交联后的复合膜。
43.一些实施例中，天然高分子优选为明胶、丝素蛋白、胶原蛋白和透明质酸中的任意一种，明胶溶液的质量分数为0.5％
‑
5％(优选为1％)。
44.一些实施例中，还包括热压的步骤，将步骤(2)制备得到的细菌纤维素复合膜进行热压，获得高取向、高强度的细菌纤维素复合膜。热压提高纤维结构规整度，致密度，从而进一步提高复合膜的机械强度。热压应力为50
‑
200n，优选为100n；热压温度为50
‑
150℃，优选为60℃；热压时间为6h
‑
48h，优选为24h；以形成厚度20
‑
50μm的bc/gelatin复合薄膜，优选为30μm。
45.一些实施例中，交联剂为1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)/n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)、二甲基亚砜或戊二醛，交联的时间为1h
‑
6h(优选为4h)。
46.本发明制备得到的细菌纤维素复合膜在促进细胞迁移和组织再生的伤口敷料中的应用。该复合膜耦合电刺激能够协同促进细胞迁移和皮肤组织再生，实现了取向诱导和电刺激诱导的双重结合，为伤口愈合敷料提供了新的途径，也拓宽了细菌纤维素的生物医学应用。
47.实施例1
48.(1)将原始bc膜剪裁成长12cm，宽为4cm；通过采用机械拉伸的方法制备拉伸应变为20％的bc；
49.(2)将步骤(1)制备得到的bc膜浸泡到1％的明胶(gelatin)溶液中，在摇床充分震荡6h，温度为37℃，震荡速度为150rpm，之后在edc/nhs交联剂作用下交联4h形成bc/gelatin复合膜，用去离子水清洗三次。
50.(3)将步骤(2)制备得到的bc/gelatin复合膜进行热压，热压应力为100n；热压温度为60℃；热压时间为24h；以形成厚度为30μm的20％拉伸的bc/gelatin的复合薄膜。
51.实施例2
52.本实施例与实施例1不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为30％。
53.实施例3
54.本实施例与实施例1不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为40％。
55.实施例4
56.(1)将原始bc膜剪裁成长12cm，宽为4cm；通过采用机械拉伸的方法制备拉伸应变为20％的bc；
57.(2)将步骤(1)制备得到的bc膜浸泡到1％的明胶(gelatin)溶液中，在摇床充分震荡6h，温度为37℃，震荡速度为150rpm，之后在edc/nhs交联剂作用下交联4h形成bc/gelatin复合膜，用去离子水清洗三次后得到20％拉伸的bc/gelatin复合膜。
58.实施例5
59.本实施例与实施例4不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为30％。
60.实施例6
61.本实施例与实施例4不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为40％。
62.实施例7
63.(1)将原始bc膜剪裁成长12cm，宽为4cm；通过采用机械拉伸的方法制备拉伸应变为20％的bc；
64.(2)将步骤(1)制备得到的bc膜浸泡到1％的丝素蛋白溶液中，在摇床充分震荡6h，温度为37℃，震荡速度为150rpm，之后在edc/nhs交联剂作用下交联4h形成bc/丝素蛋白复合膜，用去离子水清洗三次后得到20％拉伸的bc/丝素蛋白复合膜。
65.实施例8
66.本实施例与实施例7不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为30％。
67.实施例9
68.本实施例与实施例7不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为40％。
69.实施例10
70.(1)将原始bc膜剪裁成长12cm，宽为4cm；通过采用机械拉伸的方法制备拉伸应变为20％的bc；
71.(2)将步骤(1)制备得到的bc膜浸泡到1％的胶原蛋白溶液中，在摇床充分震荡6h，温度为37℃，震荡速度为150rpm，之后在edc/nhs交联剂作用下交联4h形成bc/胶原蛋白复合膜，用去离子水清洗三次后得到20％拉伸的bc/胶原蛋白复合膜。
72.实施例11
73.本实施例与实施例10不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为30％。
74.实施例12
75.本实施例与实施例10不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为40％。
76.实施例13
77.(1)将原始bc膜剪裁成长12cm，宽为4cm；通过采用机械拉伸的方法制备拉伸应变为20％的bc；
78.(2)将步骤(1)制备得到的bc膜浸泡到1g/l的透明质酸溶液中，在摇床充分震荡6h，温度为37℃，震荡速度为150rpm，之后在edc/nhs交联剂作用下交联4h形成bc/透明质酸复合膜，用去离子水清洗三次后得到20％拉伸的bc/透明质酸复合膜。
79.实施例14
80.本实施例与实施例13不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为30％。
81.实施例15
82.本实施例与实施例13不同之处在于bc的拉伸应变不同，本实施例拉伸应变为40％。
83.对比例1
84.本对比例与实施例1不同之处在于bc的拉伸应变不同，本对比例拉伸应变为0％。
85.测试结果
86.1、高取向高强度的bc/gelatin的复合薄膜的形貌表征。
87.将实施例1
‑
3和对比例1得到的bc/gelatin的复合薄膜喷金120s后，用场发射扫描电子显微镜(fesem)对bc/gelatin表面(图1中的a、b、c和d)进行表征。显然，未拉伸(0％)的bc/gelatin膜上的纳米纤维随机分布(图1中的a)，而不同拉伸应变的bc/gelatin膜随着拉伸应变的增加，纤维取向排列越来越明显(图1中的b、c和d)。进一步对纳米纤维取向分布的量化(图1中的e、f、g和h)也证实了这一观察结果。其中40％拉伸的bc/gelatin膜沿拉伸方向表现出显著的取向(10
°
内有90.1％，图1中的h)。相反，拉伸20％和30％的bc/gelatin膜显示较少的纤维排列(在10
°
内分别有35.5％和64％，图1中的f和g)。此外，在未拉伸的bc/gelatin上可以清楚地观察到明胶的覆盖，而所有拉伸的bc/gelatin都保持其原本的纤维排列，这表明取向的bc纤维对明胶排列的指导。这些结果表明，bc/gelatin的表面和内部结构均有很高的取向，并且40％拉伸的bc/gelatin具有最高的取向度。
88.2、高取向高强度的bc/gelatin的复合薄膜的机械性能测试。
89.将实施例1
‑
3和对比例1得到的bc/gelatin的复合薄膜进行机械性能测试(图2中的a、b和c)。结果表面，随着拉伸应变从0％增加到40％，bc/gelatin膜的拉伸强度和模量显著增加。特别是40％拉伸的bc/gelatin膜的拉伸强度达到784.15mpa，杨氏模量达到35.42gpa，显著高于未拉伸的bc/gelatin膜(p<0.005，111.21mpa；p<0.01，19.86gpa)。更进一步将40％拉伸的bc/gelatin膜折叠成纸船(图2d)，证明该膜可折叠特性，表明其坚韧性和柔韧性。以上结果表明，40％拉伸的bc/gelatin膜表现出最优异的机械性能，确保了其在伤口愈合中的进一步使用。
90.3、高取向高强度的bc/gelatin的复合薄膜的生物相容性测试。
91.将实施例1
‑
3和对比例1得到的bc/gelatin的复合薄膜用cck
‑
8细胞增殖实验(图3)来评价不同拉伸应变下bc/gelatin的复合薄膜对nih3t3(小鼠胚胎成纤维细胞系)细胞毒性。nih3t3作为本实验模型细胞(购自中国科学院细胞库)，培养条件为37℃，5％co2，dmem细胞培养基(10％v/v血清(fbs)，1％v/v青霉素/链霉素(p/s))。将细胞以4
×
104/ml
‑5×
104/ml种植至各组材料上，培养1、3、5天后，用cck
‑
8分别进行细胞活力测定，每个样品重复三次，计算细胞相对增殖率。由图3可知，所有不同拉伸应变的bc/gelatin膜和对照组(细胞培养板)之间未观察到显著性差异，表明bc/gelatin膜均是无毒、生物安全的。
92.为了更进一步评价bc/gelatin的复合薄膜的生物安全性，通过溶血率测试评估了其血液相容性。由图4可知，实施例1
‑
3和对比例1得到的0％，20％，30％和40％拉伸的bc/gelatin的复合薄膜溶血率分别为0.29％，0.43％，0.74％和1.13％，都在国际安全标准范围之内(<5％)，说明本发明制备的bc/gelatin的复合薄膜具有良好的血液相容性。
93.4、高取向高强度的bc/gelatin的复合薄膜诱导细胞的定向排列。
94.将上述实施例1
‑
3和对比例1得到的bc/gelatin的复合薄膜上培养至第5天的nih3t3细胞用fitc(invitrogen)和dapi(invitrogen)分别对细胞骨架和细胞核进行荧光染色，进一步观察bc/gelatin的复合薄膜对细胞的定向诱导排列。如图5中的a、b、c和d所示，随着拉伸应变越来越大，bc/gelatin的复合薄膜上的细胞沿着拉伸的方向取向排列越来越明显。其中40％拉伸的bc/gelatin复合薄膜上的取向细胞最多，且细胞生长和铺展最好。
95.5、高取向高强度的bc/gelatin的复合薄膜耦合电场诱导细胞迁移
96.为了对比对比例1和实施例3的bc/gelatin的复合薄膜耦合电场对细胞迁移的作用，将nih3t3细胞接种在制备的复合薄膜上，生长一天后，用0至150mv/mm的电场场强分别电刺激3h。同时在显微镜下记录细胞的延时图像。使用imagej软件确定细胞迁移的轨迹(图6)，取向度(图7中的a)和速度(图7中的b)。结果发现，在没有电场的情况下，未拉伸的bc/gelatin膜上的nih3t3细胞呈无序运动状态，而40％拉伸的bc/gelatin膜上的细胞沿纤维取向方向迁移，且具有更高的细胞迁移取向度和迁移速度(图7中的a和b)。这些结果表明，取向的纤维有效地促进了细胞的定向迁移。当电场强度从0增加到150mv/mm，细胞的迁移取向度逐步提高，且向阴极(x正方向)方向迁移。其中，nih3t3细胞在40％拉伸的bc/gelatin膜上的迁移取向度显著高于未拉伸的bc/gelatin膜上的取向度(图7a，150mv/mm；p<0.05)。此外，电场作用下的nih3t3细胞在40％拉伸的bc/gelatin膜上的迁移速度比未拉伸的bc/gelatin膜上的迁移速度大(图7b，p<0.005)。因此，40％拉伸的bc/gelatin膜耦合ef显著地增强了细胞迁移的取向度和速度。
97.6、高取向高强度的bc/gelatin的复合薄膜耦合电场诱导伤口愈合
98.经华中科技大学动物实验伦理委员会批准，使用平均重量为350
‑
400g的正常8周雄性sprague
‑
dawley(sd)大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行伤口愈合评估。为了确定bc/gelatin膜和电场对伤口愈合的协同作用，将大鼠进行麻醉，在每只sd大鼠的背部制作了六个正方形伤口(0.8cm
×
0.8cm)。这些伤口分为六个不同的组：tegaderm
tm
‑
ef，未拉伸的bc/gelatin
‑
ef(0％
‑
ef)，40％拉伸的bc/gelatin
‑
ef(40％
‑
ef)，tegaderm
tm
+ef，未拉伸的bc/gelatin+ef(0％+ef)，40％拉伸的bc/gelatin+ef(40％+ef)。在电刺激组(+ef)中，将两个铜电极一端连接到直流电流源，另一端固定在伤口边缘附近(垂直于小鼠体轴)，然后将bc/gelatin膜覆盖伤口上。每两天电刺激1小时，共5次。在第0、4、7和14天对伤口拍照(图8)，然后测量伤口的宽度(垂直于小鼠身体轴线的长度；图9中的a)和高度(平行于身体轴线的长度；图9中的b)。结果表明，在第14天，40％+ef组表现出完全闭合并且伤口宽度明显减少。同时40％+ef比0％+ef和0％
‑
ef组的伤口宽度显著减小。这些结果表明，40％拉伸的bc/gelatin与电场之间的协同作用比单独的电场或取向纤维对伤口愈合更有效，且伤口的愈合方向主要取决于电场的方向或纤维排列的方向。
99.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。