一种共轭树枝状分子纳米核酸载体及其应用

1.本发明属于生物医药领域，具体属于核酸药物领域，更具体涉及一种共轭树枝状分子纳米核酸载体及其应用。


背景技术：

2.随着科学研究手段的发展，人们对疾病发生发展机制的认识已经达到了基因的层面，基因治疗作为一种新的疾病治疗手段，成为了近年的研究热点。而由于核酸在各种体内外环境中相对脆弱，能够携带核酸进入人体血液系统从而进入细胞的载体成为了这一领域研究中的基本工具。核酸药物的递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体。病毒自带感染细胞的能力，可携带遗传物质进入细胞，其具有转染效率高、作用迅速、起效快的特点，但病毒载体制备困难，生产成本高，装载dna大小受限，又存在细胞毒性、免疫原性和致癌性等安全性问题，限制了其在临床上的广泛应用。非病毒载体则因其更安全，且灵活性高，合成简便，而受到人们的关注，例如脂质体、纳米粒、胶束等，它们带有阳离子组分可以对核酸形成包裹和保护，所以常称之为阳离子纳米载体。其中，聚酰胺
‑
胺树状大分子(pamam)是研究最为深入和成熟的阳离子纳米载体之一。
3.pamam以胺为核心，通过与丙烯酸甲酯的michael加成和与乙二胺的酰胺化交替反应合成，因其结构为从核心呈树枝状延伸形成的球形分子而得名树状大分子。pamam树状大分子表面大量的胺基基团可以通过静电相互作用结合核酸并形成稳定纳米粒，从而有效保护核酸避免其被核酶降解。然后，核酸/pamam分子复合物纳米粒经内吞途径被细胞摄取，被内化的纳米粒主要聚集在酸性细胞器中，如内涵体和溶酶体。树形分子结构中存在大量叔胺基团，使其具备很强的ph缓冲能力，可通过“质子海绵”效应实现内涵体逃逸，从而促进核酸的释放以发挥外源性核酸在细胞内的生物效应。随着pamam分子合成时反应次数(即合成代数，g)的增加，pamam分子末端胺基数量也随之指数增加，高代pamam分子携带更多的表面正电荷，具有更高的转染效率，同时过多的正电荷会增加纳米复合物的细胞毒性，表面的正电荷胺基也会使其在血液系统中快速被肾脏清除，这些问题成为了pamam应用中的主要瓶颈。因此研究者们通过多种方法对其表面的氨基进行修饰和改性，使其在保持核酸递送活性的同时降低细胞毒性。
4.其中，聚乙二醇(peg)共轭是降低pamam细胞毒性的最广泛应用的方法。peg分子具有水溶性、非免疫原性和非抗原性。聚乙二醇主要优势于利用其亲水性基团增加非水溶性药物的水溶性，而在核酸药物的运载中并不需要这一条件，可见针对pamam核酸载体的表面修饰方法仍有探索的空间。
5.综上，综合考量核酸转染效率和细胞毒性这两方面，更安全可靠的pamam共轭载体是扩大pamam适用面乃至推动基因治疗科学进一步发展所需解决的关键问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种具有较高载药量、同时具有低
毒性的共轭树枝状分子纳米核酸载体，提供该核酸载体的制备方法、在核酸药物制备中的应用为本发明另一个目的。
7.基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.第一方面，本发明提供了一种共轭树枝状分子纳米核酸载体，该核酸载体由g3 pamam分子上接枝plga制得。
9.聚乳酸
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聚羟基乙酸共聚物(poly lactic
‑
co
‑
glycolic acid，plga)由乳酸和乙醇酸聚合构成，在体内可最终降解为二氧化碳和水，具有无毒安全、生物相容性好及降解性能可控等优点。
10.本发明首次将plga接枝于g3 pamam大分子上构建共轭树枝状分子纳米核酸载体，发挥plga脂溶性的特点增加细胞对药物的摄取，从而增加核酸的转染率、载药量，同时降低pamam的细胞毒性。由于plga的生物可降解性及安全性，使得本发明构建的共轭树枝状分子纳米核酸载体降解产物的无毒性，最大程度增加核酸载体的安全使用范围。
11.经试验发现，g3 pamam与plga接枝所形成的共轭树枝状分子纳米核酸载体相较g3pamam具有良好的生物相容性。
12.进一步地，上述共轭树枝状分子纳米核酸载体的粒径为10～50nm。
13.本发明制得的共轭树枝状分子纳米核酸载体的粒径在50nm以内，具有良好的膜穿透能力，便于将负载的核酸药物递送至细胞内。
14.进一步地，g3 pamam分子的分子量为6909，胺基数为32；所述plga的分子量为2000。
15.由上述分子量的plga、g3 pamam接枝构建的共轭树枝状分子纳米核酸载体g3
‑
plga2000，具有更高的安全性和载药量，为基因治疗提供新的药物载体。
16.第二方面，本发明提供了上述共轭树枝状分子纳米核酸载体的制备方法，包括如下步骤：
17.将plga
‑
cooh与g3 pamam于nhs/edc催化体系中进行酰胺反应，经沉析、干燥制得共轭树枝状分子纳米核酸载体。
18.本发明以plga
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cooh、g3 pamam为原料制备共轭树枝状分子纳米核酸载体的方法，具有制备工艺简单、成本低、制备条件易于控制的优点。
19.进一步地，plga
‑
cooh与g3 pamam的质量比为1～5:1。
20.进一步地，nhs/edc催化体系由nhs与edc
·
hcl等质量混合制得。
21.第三方面，本发明提供了上述共轭树枝状分子纳米核酸载体在核酸药物制备中的应用。
22.本发明以上述共轭树枝状分子纳米核酸载体用于核酸药物的制备，具有载药量高、毒性低的优势。
23.第四方面，本发明提供了一种核酸药物的制备方法，将核酸与上述共轭树枝状分子纳米核酸载体按照质量比1:5～10于室温孵育制得核酸药物。
24.经试验发现，当将核酸与上述共轭树枝状分子纳米核酸载体按照质量比1:5～10时，共轭树枝状分子纳米核酸载体对所负载的核酸具有相对较高的吸附率。
25.进一步地，上述与共轭树枝状分子纳米核酸载体孵育的核酸为sirna、grna、核酸适配体中的任一种。
26.第五方面，本发明提供了一种由上述制备方法制得的核酸药物。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
28.本发明以低分子量的plga经nhs/edc催化的酰胺反应修饰g3 pamam分子的胺基，合成共轭阳离子纳米核酸载体，实现在增加本发明核酸载体的转染率和载药量的同时降低pamam细胞毒性，同时保证了核酸载体降解产物无毒性，最大程度增加核酸载体的安全使用范围。
附图说明
29.图1为共轭树枝状分子纳米核酸载体的合成路径示意图；
30.图2为g3
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plga2000的核磁共振氢谱解谱结果示意图；
31.图3为g3
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plga2000的扫描电镜照片；
32.图4为不同比例的g3
‑
plga2000/核酸适配体电泳图；
33.图5为g3 pamam与g3
‑
plga2000对细胞活性影响图。
具体实施方式
34.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
35.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.实施例1共轭树枝状分子纳米核酸载体及其制备方法
37.一种共轭树枝状分子纳米核酸载体的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
38.称取50mg plga
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cooh，加入重蒸氯仿2ml，涡旋使plga
‑
cooh溶解于氯仿中；将50mg nhs(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)、50mg edc
·
hcl(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)溶于上述体系中，室温磁力搅拌反应12h，得淡黄色澄清透明粘稠液，向上述粘稠液中加入50mg g3 pamam，室温磁力搅拌反应12h，加入5ml、
‑
20℃冰甲醇进行沉析，所得析出物经反复洗涤后于45℃下真空干燥，制得共轭树枝状分子纳米核酸载体。
39.其中，g3 pamam的分子量为6909，胺基数为32；plga的分子量为2000，制得的共轭树枝状分子纳米核酸载体为g3
‑
plga2000。
40.取25mg上述制得的纳米核酸载体g3
‑
plga2000溶于dmso中，使用核磁共振仪检测并绘制核磁共振氢谱，解谱结果如图2所示，解谱结果显示g3 pamam胺基的plga取代数为2～3个，由此计算得到pamam的plga接枝率为3％～6％，表明按照本发明方法成功地于g3 pamam上接枝plga。
41.利用扫描电镜对上述制得的纳米核酸载体g3
‑
plga2000进行拍摄，其扫描电镜照片如图3所示，可以看出由本发明方法制得的纳米核酸载体g3
‑
plga2000的粒径为10～50nm，具有良好的细胞膜穿透能力。
42.实施例2含有共轭树枝状分子纳米核酸载体的核酸药物及其制备方法
43.基于实施例1制得的共轭树枝状分子纳米核酸载体g3
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plga2000与核酸进行孵育制备核酸药物的方法，本实施例以核酸cas9 s1008a mrna为例，说明含有共轭树枝状分子
纳米核酸载体的核酸药物的具体制备方法，包括如下步骤：
44.1、核酸水溶液制备：将核酸如cas9 s1008a mrna 10nmol溶于100μl rnase
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free水，配制核酸水溶液。
45.2、g3
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plga2000溶液制备：将核酸质量5～10倍的g3
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plga2000溶于100μl dmf，配制g3
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plga2000溶液。
46.3、g3
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plga2000吸附核酸制得核酸药物的具体方法：将上述步骤1和步骤2制得的两个溶液体系混合、震荡，4℃孵育过夜，制得cas9 s1008a mrna的g3
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plga2000装载药剂。
47.实施例3共轭树枝状分子纳米核酸载体的载药量试验
48.本实施例以实施例1制得的共轭树枝状分子纳米核酸载体g3
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plga2000、核酸适配体为原料，探究不同比例的g3
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plga2000、核酸适配体对共轭树枝状分子纳米核酸载体的载药量的影响，以期筛选出载药量高的最佳比例。具体试验方法及试验结果如下：
49.配制1％的琼脂糖凝胶，将g3
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plga2000和适配体溶于dmso中，使g3
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plga2000与核酸适配体质量比分别为1:10、1:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，并室温孵育1h，在1xtea溶液中100v直流电下电泳20min，并在x线下观察电泳条带，如图4所述，可见在g3
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plga2000与核酸适配体质量比大于5:1时，核酸适配体在电场中不涌动，表明g3
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plga2000对核酸适配体起到了吸附包裹效应，而当g3
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plga2000与核酸适配体质量比为5:1或10:1时，g3
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plga2000的核酸吸附效率最高。
50.实施例4共轭树枝状分子纳米核酸载体的细胞毒性试验
51.本实施例以实施例1制得的共轭树枝状分子纳米核酸载体g3
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plga2000为试验对象，探究其对细胞活性的影响，具体试验方法及结果如下：
52.使用cck8法测定g3
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plga2000的细胞毒性，具体步骤为：在96孔板中配置100μl的细胞悬液；将96孔板放在培养箱预培养24小时(37℃，5％co2)，向96孔板分别加入10μl、10mm g3 pamam的dmso溶液、g3
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plga2000的dmso溶液，每组10孔；将96孔板在培养箱孵育24、48、72、96小时，并向每孔加入10μl cck溶液并将96孔板在培养箱内孵育2小时。
53.用酶标仪测定各组细胞悬液在450nm处的吸光度，并用prismx8软件进行双向anova分析各组差异并绘制统计图，如图5所示。可见g3
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plga2000组孵育后细胞活性远高于g3 pamam组，(95％置信区间p值分别为24小时：<0.0001，48小时：<0.0001，72小时<0.0028，96小时<0.0016)，由此证明本发明通过在g3 pamam上接枝plga形成的核酸载体能够显著降低pamam分子用于核酸转染时的细胞毒性。
54.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。