一种二萜类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶活性抑制剂中的应用

一种二萜类化合物在制备
β
‑
葡萄糖醛酸苷酶活性抑制剂中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种从铁海棠中分离制备得到二萜类化合物及在制备β
‑
葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用，该应用有助于对治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻药物的研发。


背景技术：

2.伊立替康(cpt
‑
11)，是一种常用的治疗结肠癌的药物。当它进入人体后，会在肝脏中被代谢成无活性的sn
‑
38葡萄糖醛酸苷(sn
‑
38g)，随后sn
‑
38g经胆管排泄进入肠道，被肠道菌β
‑
葡萄糖醛酸苷酶水解成sn
‑
38，当sn
‑
38在肠道中积累后会引起严重的迟发性腹泻和肠道损伤，严重影响化疗进程。此外，许多服用酮洛芬、双氯芬酸和吲哚美辛等含羧酸的非甾体类抗炎药也会引起类似的肠道毒性，从而引起严重的药源性腹泻。
3.β
‑
葡萄糖醛酸苷酶属于糖苷酶家族2的成员，能水解β
‑
d
‑
连接的葡萄糖醛酸苷键。人和动物肠道内的许多微生物都可以产生β
‑
葡萄糖醛酸苷酶，2010年有学者首次证实了抑制肠道菌β
‑
葡萄糖苷酶能缓解cpt
‑
11引起的药源性腹泻，随后关于肠道菌β
‑
葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的开发和应用受到了广泛关注。虽然肠道中的β
‑
葡萄糖醛酸苷酶的来源不限于大肠杆菌，但大肠杆菌β
‑
葡萄糖醛酸苷酶(ecgus)，在人和动物肠道中普遍存在而且又易制备，因此ecgus常被作为肠道菌β
‑
葡萄糖醛酸苷酶抑制剂研究的常用靶标。
4.铁海棠(euphorbia milii)为大戟科(euphorbiaceae)大戟属(euphorbia)植物，别名麒麟花。全株可入药，外敷可治瘀痛、骨折及恶疮等。其记载于《福建民间草药》：“化痰排脓，消痈解毒。”现代研究表明，铁海棠中二萜类化合物具有逆转p
‑
糖蛋白介导的多药耐药、细胞毒性、脂肪酶抑制活性、抗病毒和抗炎等活性。
5.化合物euphominoid c(铁海棠素c)为二萜类化合物，黄色油状液体，结构式如式1所示，该化合物分子量较小，易溶于氯仿，分子式为c
20
h
32
o2，可通过天然植物铁海棠e.milii提取获得,化学结构式如下所示：
[0006][0007]
目前，关于上述化合物是否具有β
‑
葡萄糖醛酸苷酶抑制活性的研究，尚未见相关文献报道；也就是说，能否将所述化合物开发成β
‑
葡萄糖醛酸苷酶抑制剂，在本领域中尚属研究空白地带。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种二萜类化合物在制备β
‑
葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用，有助于对治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物的研发。
[0009]
本发明采用的技术方案是：
[0010]
本发明提供一种式1所示二萜类化合物在制备β
‑
葡萄糖醛酸苷酶活性抑制剂中的应用，所述二萜化合物为化合物euphominoid c(铁海棠素c)，结构式如下：
[0011][0012]
本发明对所述化合物1的制备方法没有特殊限定，可以通过本领域公知的常规制备方法制备得到，优选所述二萜类化合物的制备方法按如下步骤进行：
[0013]
(1)取铁海棠整株粉碎，用有机溶剂室温(25
‑
30℃)浸提，提取液减压浓缩至干，得到粗提物浸膏；
[0014]
(2)将粗提物浸膏用氯仿溶解后，用水进行反向萃取，收集有机相减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；
[0015]
(3)将步骤(2)萃取物浸膏先后进行硅胶柱层析、mci chp20p柱层析、ods c
‑
18柱层析、硅胶柱层析，分段收集洗脱部位，洗脱液通过用薄层色谱法检测，合并rf值为0.4
‑
0.6(优选0.5)的洗脱部位，洗脱部位减压浓缩，得到式1所示化合物。
[0016]
其中，步骤(1)中所述有机溶剂为95％乙醇、甲醇或丙酮；所述有机溶剂体积用量以铁海棠粉末重量计为2～10ml/g，优选6ml/g；所述浸提至少进行3次，每次提取时间为5～7天。
[0017]
步骤(2)中所述氯仿体积用量以步骤(1)粗提物浸膏重量计为2
‑
5ml/g，优选2.5ml/g；所述氯仿与水的体积比为1:1
‑
4，优选1:3；萃取3
‑
5次。
[0018]
步骤(3)具体操作方法为：1)步骤(2)氯仿提取物用二氯甲烷溶解，进行硅胶柱层析，分别以体积比为20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚(沸程60
‑
90℃)/乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个柱体积，流速自然；收集体积比1:1的石油醚
‑
乙酸乙酯的洗脱部位，浓缩至干，获得浓缩物；
[0019]
2)将步骤1)浓缩物加入甲醇溶解后进行mci chp20p柱层析，依次以体积比为60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱5～10个柱体积，流速10
‑
20ml/min；分别收集体积比70:30、75:25洗脱剂对应的洗脱部位，合并；减压浓缩至干，得浓缩物；
[0020]
3)步骤2)浓缩物用甲醇溶解后进行ods c
‑
18柱层析，依次以体积比为65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～3个柱体积，流速10
‑
20ml/min；收集体积比85：15洗脱剂对应的洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；
[0021]
4)将步骤3)浓缩物用氯仿溶解后再进行硅胶柱层析，以体积比为50：1氯仿/甲醇混合溶剂为洗脱剂进行等度洗脱4个柱体积，流速10
‑
20ml/min，收集洗脱部位；用收集的洗脱部位点样，采用硅胶gf254薄层板，以氯仿/甲醇体积比为25:1的混合溶液为展开剂，展开结束后经10％硫酸
‑
乙醇显色，合并rf值为0.4
‑
0.6的洗脱部位并浓缩至干，得到黄色油状化合物1。
[0022]
进一步，本发明所述二萜类化合物抑制浓度为0.1
‑
500μm，特别在终浓度为100μm的时候，对ecgus的抑制率为72.33％。
[0023]
进一步，本发明所述二萜类化合物对ecgus的抑制ic
50
值为45.87
±
1.94μm。
[0024]
进一步，本发明所述β
‑
葡萄糖醛酸苷酶源自肠道菌，优选大肠杆菌，ecgus可以从生物化学制品公司采购，比如西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，或者从大肠杆菌中提取。
[0025]
进一步，所述抑制剂为治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物。
[0026]
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0027]
本发明提供了一种从铁海棠中提取二萜类化合物euphominoid c(铁海棠素c)对β
‑
葡萄糖醛酸苷酶的抑制作用，而且抑制活性显著，优于阳性药物d
‑
葡萄糖二酸
‑
1,4
‑
内酯(dsl)(euphominoid c：ic
50
＝45.87
±
1.94μm；dsl：50.64
±
5.03μm)，在治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物的研发方面具有广阔的应用前景。
附图说明
[0028]
图1为化合物1对ecgus的浓度依赖抑制曲线。
[0029]
图2为d
‑
葡萄糖二酸
‑
1,4
‑
内酯对ecgus的浓度依赖抑制曲线。
[0030]
图3为用于判断化合物1对ecgus抑制类型的lineweaver burk双倒数作图。
具体实施方式
[0031]
下面通过具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步的具体说明，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。所使用的材料、试剂等，如果没有特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0032]
实施例1化合物1的制备及鉴定
[0033]
1、化合物1的制备
[0034]
(1)干燥的铁海棠(3kg)经切割粉碎后用95％乙醇18升室温(25
‑
30℃)浸提七天，过滤，滤饼重复浸提2次(每次18升，每次七天)，合并提取液并经减压浓缩至干，得提取物浸膏364.5g；
[0035]
(2)将上述步骤(1)提取物浸膏364.5g溶解于氯仿1升中，用水反萃3次(每次3升)，取有机相减压浓缩至干后得氯仿提取物(222g)。
[0036]
(3)步骤(2)氯仿提取物用200ml二氯甲烷溶解，进行开放硅胶柱层析(硅胶200
‑
300目，硅胶柱直径d＝13cm，高h＝60cm)，依次以体积比为20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚:乙酸乙酯进行梯度洗脱，每个梯度洗脱20l，流速自然，收集石油醚/乙酸乙酯(1:1)的洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物23.5g。
[0037]
(4)将步骤(3)的浓缩物23.5g用100ml甲醇溶解后进行mci chp20p柱层析(直径d＝4.4cm，高h＝23cm)，依次以体积比为60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱8个柱体积，流速15ml/min；收集甲醇/水＝70:30和75:25的洗脱部位，合并，减压浓缩至干，得浓缩物1.24g。
[0038]
(5)步骤(4)浓缩物1.24g用5ml甲醇溶解，进行ods c
‑
18柱层析(直径d＝3.6cm，高h＝31cm)，依次以体积比为65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱3个柱体积，流速15ml/min；收集甲醇/水＝85:15的洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物47.4mg。
[0039]
(6)将步骤(5)浓缩物47.4mg用1.5ml氯仿溶解，再通过硅胶柱层析(直径d＝2.8cm，高h＝26cm)，以体积比为50:1氯仿/甲醇混合溶剂为洗脱剂进行等度洗脱4个柱体积，流速15ml/min，收集洗脱部位100ml；用收集的洗脱部位点样，采用硅胶gf254薄层板，以氯仿/甲醇体积比为25:1的混合溶液为展开剂，展开结束后经10％硫酸
‑
乙醇显色，合并rf值为0.5的洗脱液，减压浓缩至干，得到黄色油状化合物1(20mg)。
[0040]
2、化合物1的理化性质及波谱数据
[0041]
化合物1：黄色油状物。分子式为c
20
h
32
o2；其1h
‑
nmr和
13
c
‑
nmr数据如下：1h
‑
nmr(600mhz,cdcl3)δ
h 0.85(3h,s,h
‑
20),1.00(3h,s,h
‑
18),1.01(3h,s,h
‑
17),1.05(1h,dt,13.3,2.6,h
‑
14),1.26(1h,m,h
‑
12),1.30(1h,m,h
‑
11),1.30(1h,m,h
‑
7),1.36(1h,m,h
‑
7),1.39(1h,m,h
‑
14),1.51(1h,m,h
‑
12),1.54(1h,m,h
‑
8),1.57(1h,m,h
‑
11),1.61(1h,m,h
‑
2),1.75(1h,m,h
‑
2),1.91(1h,m,h
‑
6),2.05(2h,m,h
‑
1),2.08(1h,m,h
‑
6),3.58(1h,d,10.3,h
‑
19),3.75(1h,d,10.3,h
‑
19),3.88(1h,dd,3.5,12.2,h
‑
3),4.84(1h,dd,1.4,10.7,h
‑
16),4.91(1h,dd,1.4,17.5,h
‑
16),5.81(1h,dd,10.7,17.5,h
‑
15)；
13
c
‑
nmr(150mhz,cdcl3)δc 15.7(c
‑
18),17.1(c
‑
20),23.2(c
‑
17),24.6(c
‑
7),25.4(c
‑
1),25.7(c
‑
6),27.4(c
‑
2),31.8(c
‑
11),32.6(c
‑
12),36.5(c
‑
13),37.6(c
‑
8),37.7(c
‑
9),39.6(c
‑
14),44.2(c
‑
4),68.8(c
‑
19),73.2(c
‑
3),108.8(c
‑
16),129.0(c
‑
5),139.8(c
‑
10),151.3(c
‑
15).以上波谱数据与文献(s.n.liu,j.y.hu,s.h.tan,q.wang,j.xu,y.wang,y.yuan and q.gu.ent
‑
rosane diterpenoids from euphorbia milii showing an epstein
‑
barr virus lytic replication assay[j].rsc adv.,2017,7,46938
‑
46947)报道的euphominoid c一致，因此化合物1被确定为euphominoid c，结构式如下式所示：
[0042][0043]
实施例2化合物1对ecgus的抑制作用
[0044]
1、β
‑
葡萄糖醛酸苷酶(ecgus)的制备：
[0045]
lb液体培养基：胰蛋白酶10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水，ph7.0。
[0046]
裂解液：20mm 4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，300mm nacl，5mm咪唑(imidazole)，体积浓度10％甘油(glycerol)，溶剂为水，ph 7.4。
[0047]
nta
‑
0缓冲液：20mm tris
‑
hcl，0.5m氯化钠，体积溶度10％甘油，ph 7.9。
[0048]
nta
‑
20缓冲液：20mm tris
‑
hcl，0.5m氯化钠，体积溶度10％甘油，20mm咪唑，ph 7.9。
[0049]
nta
‑
250缓冲液：20mm tris
‑
hcl，0.5m氯化钠，体积溶度10％甘油，250mm咪唑，ph 7.9。
[0050]
将大肠杆菌(escherichia coli bl21(de3)，
‑
80℃下保存)接种到200ml含30μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于200rpm、37℃条件下培养至od600达到0.5，接着加入终浓度100mm的异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(iptg)，于200rpm、30℃条件下过夜培养诱导ecgus的表达(通过sds
‑
page电泳检测酶的表达情况)。待表达完成后，将培养液在4℃，9000rpm的条件下离心5min，收集菌体，再用pbs(ph 7.4)洗涤菌体2
‑
3遍，然后按1/10原菌液体积加入裂解液20ml重悬菌体，置于冰上，在300w，超声10s间隔10s条件下超声破碎菌体20min，接着在4℃，8000rpm条件下离心10min，取上清液。然后用纯净水和nta
‑
0缓冲液各15ml分别清洗15ml的ni
‑
nta琼脂糖树脂柱料(购于ge医疗公司)2
‑
3次，再在4℃下将上清液与ni
‑
nta琼脂糖树脂柱料螯合3h，然后用nta
‑
0缓冲液，nta
‑
20缓冲液，nta
‑
250缓冲液各15ml分别梯度洗脱，洗脱液每5ml收集一管，分别收集到9管洗脱液，每管洗脱液均进行sds
‑
page电泳，结果显示nta
‑
250缓冲液洗脱收集的4管洗脱液含有ecgus，且ecgus的分子量约为71kd，然后将这4管洗脱液合并，最后使用10kd的millipore蛋白超滤管(截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3)过滤，收集截留液即为酶液，获得ecgus酶液7ml。
[0051]
2、ecgus抑制剂的筛选(抑制剂终浓度100μm)
[0052]
(1)试剂
[0053]
抑制剂：将化合物1用二甲基亚砜(dmso)配成10mm的溶液，待用。
[0054]
底物：4
‑
硝基苯基
‑
β
‑
d
‑
吡喃葡萄糖苷(pnpg，购于sigma
‑
aldrich)，用pbs缓冲液配成2.5mm的溶液，待用。
[0055]
反应酶液：步骤1制得的ecgus酶液，用pbs缓冲液稀释500倍后作为反应酶液，用试剂盒(bca微量蛋白浓度测定试剂盒，北京索莱宝科技有限公司)测得蛋白浓度为1μg/ml；在反应酶液10μl+pbs 80μl+2.5mm底物10μl体系中做三个平行，使用酶标仪在405nm波长下分别测量0min和30min的od值，通过计算发现δ
od
在0.2
‑
0.3之间。
[0056]
阳性对照(dsl)：d
‑
葡萄糖二酸
‑
1,4
‑
内酯(d
‑
saccharic acid 1,4
‑
lactone，dsl，购于sigma
‑
aldrich)用二甲基亚砜(dmso)配成10mm的溶液，作为阳性对照。
[0057]
(2)反应：在96孔板中进行，反应体系如下，空白组：反应酶液10μl+pbs 79μl+体积浓度10％dmso水溶液1μl+2.5mm底物10μl；实验组：反应酶液10μl+pbs 79μl+10mm抑制剂1μl+2.5mm底物10μl；阳性对照组：反应酶液10μl+pbs 79μl+10mm阳性对照药1μl+2.5mm底物10μl；每组做3个平行，按反应酶液、pbs、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样，使用酶标仪在405nm波长下分别测量0min和30min的od值(期间37℃下孵育)，通过计算可得，在终浓度100μm条件下，化合物1对ecgus的抑制率为72.33％，高于阳性对照dsl(抑制率66.76％)。
[0058]
上述的具体计算过程如下：
[0059]
δod＝od
30min
‑
od
0min
；
[0060]
δc
pnp
＝δod/0.003262(0.003262为本发明吸光度与pnp溶度的相关性系数)；
[0061]
相对活性(％)＝实验组δc
pnp
/空白组δc
pnp
；
[0062]
抑制率(％)＝1
‑
相对活性(％)；
[0063]
3、ic
50
值的测定：测定化合物1的ic
50
值，在终浓度0.1
‑
500μm内设置一系列抑制剂浓度点(如0.1、1、20、40、50、100、250、400、500μm)，反应在96孔板中进行，反应体系如下：空白组：反应酶液10μl+pbs 70μl+体积分数1％dmso 10μl+2.5mm底物10μl；实验组：反应酶液10μl+pbs 70μl+不同浓度抑制剂10μl+2.5mm底物10μl；阳性对照组：反应酶液10μl+pbs 70μl+阳性对照10μl+2.5mm底物10μl；每组设3个平行，按反应酶液、pbs、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样，然后在酶标仪405nm波长下分别测量0min和30min的od值(期间37℃下孵育)，通过计算得到抑制剂在不同浓度条件下对ecgus的相对活性值，最后将抑制剂浓度点μm取10为底的导数得到lg值，并以lg值为横坐标，相对活性为纵坐标，利用graphad prism 6.0软件画出ic
50
曲线图(图1、图2)并经该软件分析得到抑制剂/阳性对照对ecgus的ic
50
值，化合物1对ecgus的ic
50
值为45.87
±
1.94μm，小于阳性对照化合物dsl(ic
50
＝50.64
±
5.03μm)。
[0064]
4、化合物1对ecgus的抑制类型研究：化合物1用pbs配制成浓度为0.2，0.4，0.6，0.8mm的溶液(即终浓度为20，40，60，80μm)，底物用pbs配制成浓度为2，3，5，10mm的溶液(即终浓度为200，300，500，1000μm)。底物与化合物1不同浓度的排列组合表见表1。
[0065]
表1底物与化合物1不同浓度的排列组合表
[0066][0067]
注释：c
pnpg
表示底物终浓度，c
in
表示抑制剂(化合物1)终浓度，о表示96孔板的一个样品孔，每个浓度组合做三组平行组。
[0068]
反应在96孔板中进行，反应体系如下：反应酶液10μl+pbs 70μl+不同浓度抑制剂10μl+不同浓度底物10μl，每个组合设3个平行，按反应酶液、pbs、抑制剂、底物的顺序加样，使用酶标仪在405nm波长下分别测量0min和30min的吸光度(期间37℃下孵育)，按步骤2计算过程计算不同浓度组合对应的pnp浓度差值，最后计算出1/v(μmol/min/mg)和1/pnpg值，v(μmol/min/mg)即酶的催化速度，表示在温度、ph值、底物浓度一定的条件下，每毫克酶每分钟催化产生产物的摩尔量；
[0069]
计算过程如下：
[0070]
1/v(μmol/min/mg)＝1/(δc
pnp
*100/10/30/1)；1/pnpg＝1/δc
pnp
；
[0071]
其中，δc
pnp
表示0min和30min体系中pnp的浓度差，100表示反应体系100μl，10表示酶的加入量10μl，30表示反应时间30min，1表示酶的配制溶度为1μg/ml。
[0072]
最后利用graphad prism 6.0软件画出抑制双倒数曲线图(图3)，根据曲线交点判断抑制剂类型，从图3可以推测图像在第二象限存在交点，表明化合物1对ecgus的抑制属于混合型抑制，与酶的活性位点和变构位点均能产生结合。
[0073]
以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。