仙鹤草内酯在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的用途

1.本发明属于医药领域，具体涉及仙鹤草内酯在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的用途。


背景技术：

2.肺癌又称为原发性支气管肺癌，起源于支气管粘膜上皮及上肺泡上皮细胞，是全世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤疾病之一。据世界卫生组织2021年发布的最新全球癌症统计报告显示，在2020年，全球新增癌症1930万人，死亡人数990万人，肺癌的发病率及死亡率分别为11.4％及18.0％，居癌症引起死亡的首位。肺癌的疗方案主要包括手术、化疗、放疗及中医药治疗，近年来，随着医学和科学技术的发展，肺腺癌及肺鳞癌的治疗进展迅速，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，alk)等靶向治疗药物以及程序性死亡受体1(programmed death-receptor 1,pd-1)免疫治疗药物的应用大大提高了肺癌患者的5年生存率，为肺癌的治疗带来了新的选择。尽管如此，肺癌患者的生存现状仍不容乐观，其5年生存率仅为10-20％，1年生存率约42％，诊断时无远处转移者中位生存期平均13个月，而诊断时已有远处转移者中位生存期仅平均5个月。肿瘤细胞在治疗过程中出现耐药或抵抗的原因不明，成为肺癌研究领域的难点问题。目前越来越多的学者倾向于认为肺癌干细胞(lung cancer stem cell,lcsc)是肺癌发生，进展，侵袭，转移，耐药及治疗后复发的“种子”，因此如果可以研发靶向lcsc的药物可显著提高肺癌治疗成功率。
3.中医药治疗因其独到的思维和低毒副作用等特点，在肺癌的治疗中有着悠久历史，其与西医治疗联合应用可达“增效减毒”的效应。仙鹤草作为具有抗肿瘤效应的中草药之一，在肿瘤的治疗中具有补虚扶正、消积散结的效应。近代细胞学研究证实仙鹤草水体液具有抗肿瘤效应，如文献《仙鹤草化学成分及药理研究进展》(赵莹等.特产研究2001年第一期)公开了仙鹤草提取液对宫颈癌、肝癌等有明显抑制作用；文献《仙鹤草水提液对多种肺癌细胞的增殖抑制作用实验研究》(蔡田恬等.浙江中西医结合杂志.2017年第27卷第3期)公开了仙鹤草水提液对肺癌细胞有显著的体外增殖抑制作用。
4.仙鹤内酯是仙鹤草的活性成分之一，结构如下：
[0005][0006]
仙鹤草内酯为无色柱状晶体，易溶于乙醇、乙醚和热苯，其药理作用主要包括抗炎、抗氧化应激、降血糖及抗肿瘤。但研究表明(teng h等.inhibition of cell proliferation and triggering of apoptosis by agrimonolide through map kinase(erk and p38)pathways in human gastric cancer ags cells.food funct,2016,7
(11):4605-4613.)其仅对人源胃腺癌ags细胞株敏感，可治疗胃癌；而对肝癌、乳腺癌、结肠癌细胞株均无抗癌活性。现有技术中没有报道仙鹤内酯可以抑制肺癌细胞，治疗肺癌，更没有报道仙鹤内酯对肺癌干细胞有抑制活性。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供仙鹤草内酯在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的用途。
[0008]
本发明提供了式i所示的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其水合物、或其前药在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的用途：
[0009][0010]
其中，r1、r2、r3分别独立选自c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、羟基、氨基、羧基。
[0011]
进一步地，r1、r2、r3分别独立选自c1～c3烷基、c1～c3烷氧基、羟基。
[0012]
进一步地，所述化合物如式ii所示：
[0013][0014]
其中，r3选自c1～c3烷基、c1～c3烷氧基、羟基；
[0015]
优选地，r3选自c1～c3烷氧基。
[0016]
进一步地，所述化合物为如下化合物：
[0017][0018]
进一步地，所述药物为抑制肺癌干细胞活性的药物；和/或，所述药物为抑制肺癌干细胞在体内形成肿瘤的药物。
[0019]
进一步地，所述肺癌干细胞为a549干细胞。
[0020]
进一步地，所述药物为抑制肺癌复发的药物。
[0021]
进一步地，所述肺癌为非小细胞肺癌。
[0022]
进一步地，所述肺癌为产生了耐药性的肺癌。
[0023]
进一步地，所述药物是以前述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其水合物、或其前药为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
[0024]
本发明发现了仙鹤草内酯对肺癌干细胞生长具有显著抑制作用，且可以抑制肺癌干细胞在体内的形成肿瘤，其对瘤体增长的抑制率可达59.66％。说明仙鹤草内酯可用于预防或治疗肺癌，特别是预防或治疗非小细胞肺癌，尤其是预防或治疗由于肿瘤干细胞导致的具有耐药性的肺癌，并且可以抑制肺癌复发。仙鹤草内酯用于制备预防或治疗肺癌的药物具有良好的应用前景。
[0025]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0026]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0027]
图1为a549细胞和a549肿瘤干细胞的显微镜图片(100x)：a1和a2为a549细胞；b1和b2为a549肿瘤干细胞。
[0028]
图2为a549细胞中表达干细胞标志物cd133的结果：a～c分别为三次重复实验的结果。
[0029]
图3为a549肿瘤干细胞中表达干细胞标志物cd133的结果：a～c分别为三次重复实验的结果。
[0030]
图4为培养24h后各组a549肿瘤干细胞增殖的显微镜图片(100x)。
[0031]
图5为培养48h后各组a549肿瘤干细胞增殖的显微镜图片(100x)。
[0032]
图6为培养72h后各组a549肿瘤干细胞增殖的显微镜图片(100x)。
[0033]
图7为各组小鼠的肿瘤生长曲线。
[0034]
图8为各组小鼠的体内成瘤图片：a为肺癌干细胞组；b为仙鹤草内酯低浓度处理组；c为仙鹤草内酯中浓度处理组；d为仙鹤草内酯高浓度处理组。
[0035]
图9为各组小鼠的瘤体图片：a为肺癌干细胞组；b为仙鹤草内酯低浓度处理组；c为仙鹤草内酯中浓度处理组；d为仙鹤草内酯高浓度处理组。
具体实施方式
[0036]
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0037]
实施例1、a549肿瘤干细胞的诱导
[0038]
1、实验材料
[0039]
细胞株：人肺癌a549细胞系，购于上海中国科学院细胞库。
[0040]
主要试剂配制：
[0041]
(1)pbs磷酸盐缓冲液：pbs粉剂每袋加ddh2o定容至1000ml，调ph7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存。
[0042]
(2)人肺癌a549细胞系生长培养液：90％的dmem培养基，再加入10％胎牛血清，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100u/ml和100μg/ml，置于4℃冰箱保存。
[0043]
(3)肿瘤干细胞无血清培养基：dmem培养基+胰岛素(4u/l)+b27(1x)+egf(20ng/ml)+bfgf(20ng/ml)，混匀置于4℃冰箱保存。
[0044]
(4)细胞冻存液：生长培养基(含20％胎牛血清)或100％胎牛血清，加入10％的dmso混合均匀，置于4℃冰箱保存。
[0045]
2、a549肿瘤干细胞的诱导
[0046]
肿瘤干细胞(cancer stem cell,csc)是一类存在于肿瘤组织中，具有组织干细胞特性，可自我更新及多向分化的肿瘤细胞。csc表达高水平的atp结合盒转运蛋白(atp-binding cassette transporter,abcg)，可将细胞内的药物泵出细胞外，使细胞内药物的浓度远远低于其对细胞的有效杀伤浓度，因而对药物具有较强的抗药性。可以说csc是肿瘤的发生、生长、转移、耐药以及治疗后复发的“种子”，因此csc的深入研究成为目前肿瘤研究领域的热点，靶向csc的治疗也将成为肿瘤治疗的发展方向。
[0047]
无血清悬浮培养是富集肿瘤干细胞的常用方法，在超低吸附无血清干细胞培养基中，分化成熟的肿瘤细胞会因为耐受不了长期的悬浮培养而调亡，而肿瘤干细胞在生长因子的作用下可激活细胞分裂周期进入增殖状态，并维持其干细胞特性，经分裂增殖可悬浮生长并形成球样团块，团块内富含干细胞，同时可以进行传代培养。采用无血清悬浮培养诱导a549肿瘤干细胞，具体方法如下：
[0048]
取对数生长期的a549细胞，以1
×
104/ml的密度接种到6孔板中，用肿瘤干细胞无血清培养基(dmem培养基+胰岛素(4u/l)+b27(1x)+egf(20ng/ml)+bfgf(20ng/ml))悬浮培养，以利于干细胞球的形成。隔1-2天更换培养基，2-3周后可见肿瘤细胞球形成，传代用于后续实验。
[0049]
如图1所示，图a1和a2为常规培养的a549细胞，a549细胞在含血清细胞生长培养液中生长良好，在显微镜下可见细胞大小均匀，呈杆状、梭形，细胞核多为椭圆形，偏心位。将对数生长期的a549细胞接种于肿瘤干细胞无血清培养基悬浮培养，可见培养基中有悬浮的细胞球形成，球内细胞之间紧密链接，细胞间的界限难以区分(如图1b1和b2所示)，该细胞球即为a549肿瘤干细胞。
[0050]
3、利用荧光激活细胞分类仪测定a549肿瘤干细胞中表达干细胞标志物cd133的细胞数
[0051]
cd133是一种跨膜糖蛋白，为prominin家族中一员，是目前应用较为广泛的csc细胞分子标志物。
[0052]
实验分组：
[0053]
①
正常a549细胞组；
②
a549肿瘤干细胞组
[0054]
实验方法：
[0055]
(1)用6孔板培养正常a549细胞，待细胞生长达到60％-70％，弃掉旧培养基，胰酶消化后，加入相应培养基，收集正常a549细胞到一离心管内备用。
[0056]
(2)用6孔板培养a549肿瘤干细胞，待细胞生长达到60％-70％，弃掉旧培养基，胰酶消化后，加入相应培养基，收集a549肿瘤干细胞到一离心管内备用。
[0057]
(3)各离心管分别1000rpm离心5min，沉淀细胞。
[0058]
(4)小心吸去上清，可以残留约50μl的培养基。
[0059]
(5)加入约1ml预冷的pbs，重悬细胞，并转移到1.5ml离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸去上清，可以残留约50μl pbs。
[0060]
(6)轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
[0061]
(7)在每个流式检测管或板式微孔中加入50μl的稀释后的抗体(抗体用staining buffer稀释成合适的浓度)；在空白管/孔中加入50μl staining buffer。抗体用量为0.03-2μg/106个细胞。
[0062]
(8)在各管/孔中分别加入50μl细胞悬液(约106个细胞)，并与抗体轻轻混匀。
[0063]
(9)常温孵育30min。孵育完成后，加入staining buffer(每流式检测管中加2ml，而每微孔中加200μl)。
[0064]
(10)1000rpm 4℃离心5min，并弃去上清，重复洗涤过程3次。100μl重悬细胞后上流式仪检测。每组三次重复实验。
[0065]
实验结果：
[0066]
正常a549细胞和a549肿瘤干细胞中表达干细胞标志物cd133的细胞数如图2和图3所示，图中p1为去除细胞碎片后的细胞含量，p2为未被cd133标记的细胞，p3为cd133标记上的细胞。图2a-c中为正常a549细胞的结果，图3a-c为a549肿瘤干细胞的结果。由图2和图3可知：a549细胞与a549肿瘤干细胞相比，a549肿瘤干细胞中表达cd133的细胞数量百分率显著高于a549细胞中表达cd133的细胞数量百分率。
[0067]
由上述可知本发明经过肿瘤干细胞无血清培养基诱导的细胞球，经鉴定高表达肿瘤干细胞标记物cd133，因此本发明经肿瘤干细胞无血清培养基诱导的细胞球为a549肿瘤干细胞。
[0068]
实施例2、cck8检测仙鹤草内酯对a549肿瘤干细胞增殖的影响
[0069]
1、实验材料
[0070]
主要试剂配制：
[0071]
(1)pbs磷酸盐缓冲液：pbs粉剂用ddh2o定容至1000ml，调ph7.2，121℃、30min高压灭菌，4℃保存备用。
[0072]
(2)肿瘤干细胞无血清培养基：在dmem培养基+胰岛素(4u/l)+b27(1x)+egf(20ng/ml)+bfgf(20ng/ml)，混匀置于4℃冰箱保存。
[0073]
(3)仙鹤草内酯(agrimonolide)溶液：5mg/管，加入0.5ml dmso，溶解后得到10mg/ml的母液。仙鹤草内酯购自成都克洛玛生物科技有限公司，货号chb-x-111，批号chb180406。
[0074]
2、实验分组
[0075]
细胞模型分组：
①
正常a549肿瘤干细胞组(不加入药物，对照组)；
②
顺铂处理组(2μg/ml)；
③
仙鹤草内酯处理组(100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml)。
[0076]
②
和
③
为实验组。
[0077]
3、实验步骤
[0078]
细胞培养：a549肿瘤干细胞培养于含特殊生长因子的dmem培养基(肿瘤干细胞无血清培养基)中，放置在37℃、5％co2、相对湿度为100％的细胞培养箱中培养，经过传代培
养用于后续实验。
[0079]
cck-8法检测法：
[0080]
(1)取正常生长的a549肿瘤干细胞，计数调整细胞浓度至1
×
105/ml。
[0081]
(2)分别接种于96孔板中，每孔100μl，每组细胞设3个复孔。
[0082]
(3)将96孔板移入培养箱中培养(37℃，5％co2)，培养24h后按照分组分别向孔中加入药物，对照组不加入药物，分别再培养24h、48h、72h。
[0083]
(4)培养结束后，各组每孔加入10μl cck-8溶液(注意不要产生气泡)，于培养箱内孵育1-4h。
[0084]
(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。
[0085]
(6)同时设置空白孔(培养基+cck-8，空白组)。
[0086]
细胞抑制率计算：
[0087]
细胞抑制率(％)＝[a(对照组)-a(实验组)]/[a(对照组)-a(空白组)]
×
100％
[0088]
a(实验组)：实验组为使用顺铂或仙鹤草内酯处理后的细胞的吸光度值；
[0089]
a(空白组)：只有培养基和cck-8溶液而没有细胞的吸光度值；
[0090]
a(对照组)：未使用药物处理的细胞的吸光度值。
[0091]
4、实验结果
[0092]
仙鹤草内酯对a549肿瘤干细胞增殖的影响结果如表1～3和图4～6所示。
[0093]
表1.培养24h后仙鹤草内酯对a549肿瘤干细胞增殖的影响结果
[0094][0095]
表2.培养48h后仙鹤草内酯对a549肿瘤干细胞增殖的影响结果
[0096][0097]
表3.培养72h后仙鹤草内酯对a549肿瘤干细胞增殖的影响结果
[0098][0099][0100]
以上实验结果表明，仙鹤草内酯能够显著抑制a549肺癌干细胞的生长。
[0101]
实施例3、仙鹤草内酯对a549干细胞体内成瘤的干预效应
[0102]
1、实验材料
[0103]
实验动物：spf级成年雄性健康balb/c-nude裸小鼠，6-8周龄，20～25g，24只，由重庆恩斯维尔生物科技有限公司提供。
[0104]
仙鹤草内酯：购自成都克洛玛生物科技有限公司，货号chb-x-111，批号chb180406。
[0105]
主要试剂配制：
[0106]
(1)7％水合氯醛：水合氯醛7g溶于约60ml生理盐水中，加生理盐水定容至100ml，室温避光保存。
[0107]
(2)pbs磷酸盐缓冲液：nacl 8g，kcl 0.2g，na2hpo
4 1.44g，kh2po40.24g，超纯水800ml，调ph值为7.2，加超纯水定容至1l，高压蒸汽灭菌20min，室温保存。
[0108]
(3)4％多聚甲醛：多聚甲醛4g溶于约60ml pbs中，加pbs定容至100ml，室温避光保存。
[0109]
(4)仙鹤草内酯溶液配制：高浓度仙鹤草内酯药液按照1mg/ml的比例配制，溶剂为dmso溶液，中浓度稀释为0.5mg/ml，低浓度稀释为0.25mg/ml，药液现配现用。腹腔注射剂量为1ml/kg。
[0110]
2、实验分组
[0111]
a：肺癌干细胞对照组；b：低浓度(0.25mg/kg)仙鹤草内酯单体处理组；c：中浓度(0.5mg/kg)仙鹤草内酯单体处理组；d：高浓度(1mg/kg)仙鹤草内酯单体处理组。共4组，每组6只，共24只。a为对照组，b、c、d为实验组。
[0112]
3、实验方法
[0113]
(1)动物适应性喂养
[0114]
动物房12h～12h昼夜交替，保持动物自由饮水、进食，保持室温23～25℃，一周后进入实验。
[0115]
(2)裸鼠皮下接种肺癌干细胞
[0116]
对接种环境以及手部消毒，用酒精棉球将裸鼠注射部位消毒。将a549肺癌干细胞重悬，1ml注射器吸取细胞悬液，提起裸鼠皮肤，针头斜面朝上，刺入皮下(针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示刺入皮下)，缓慢的将细胞悬液注入皮下(裸鼠右侧腋下)，注射量为150μl/只(约含细胞1
×
107个)。拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，防止细胞液外漏。
[0117]
(3)成瘤观察与测量
[0118]
皮下接种后，每天观察裸鼠健康状态及肿瘤生长情况；待成瘤后(待肿瘤体积达到测量标准100mm3)，隔天观察成瘤情况并测量记录，测量肿瘤长径与短径，并计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长径
×
短径2)/2。根据肿瘤体积做出肿瘤生长曲线。
[0119]
(4)仙鹤草内酯药液给药
[0120]
细胞注射1周后待肿瘤体积达到100mm3，b、c、d组裸鼠分别按照0.25mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的给药量腹腔注射仙鹤草内酯药液，每天给药一次，连续给药2周。
[0121]
对照组给予等量生理盐水腹腔注射。
[0122]
(5)取材
[0123]
裸鼠称重，7％水合氯醛腹腔注射麻醉，注射量5ml/kg。麻醉后眼科剪剪开瘤体周边皮肤，剥离瘤块，称重测量，一部分肿瘤样本4％多聚甲醛固定4℃保存；另一部分-80℃保存，等待后续检测。抑瘤率计算公式：
[0124]
抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)
÷
对照组平均瘤重
×
100％。
[0125]
4、实验结果
[0126]
各组小鼠肿瘤生长曲线如图7所示，各组小鼠体内成瘤图片和瘤体如图8和图9所示，各组小鼠的瘤体体积及瘤体重量如表4所示。
[0127]
表4.仙鹤草内酯干预后各组小鼠的瘤体体积及瘤体重量
[0128][0129]
注：*表示与对照组(a组)相比，p《0.05；**表示与对照组(a组)相比，p《0.01
[0130]
由实验结果可知：a549肿瘤干细胞在裸鼠体内所形成的瘤体体积增长迅速，14天后，瘤体体积增加到平均1294.5mm3。随着仙鹤草内酯浓度升高，瘤体体积和重量增长速度减慢，高浓度组瘤体体积和重量增长速度最慢。
[0131]
经仙鹤草内酯干预14天后，对照组瘤体体积最大，各剂量干预组中瘤体体积随着干预浓度的增加而逐渐下降：低剂量组和对照组比较，瘤体体积差异没有显著统计学意义(p》0.05)；中剂量组和高剂量组和对照组比较，瘤体体积差异有极显著统计学意义(p《0.01)。同时，对照组瘤体重量最大，各剂量干预组中瘤体重量随着干预浓度的增加而逐渐下降：低剂量组和对照组比较，差异有显著统计学意义(p《0.05)；中剂量组和高剂量组和对照组比较，差异有极显著统计学意义(p＝0.000)。
[0132]
肺癌干细胞(lcsc)本身的生理学特点使得肿瘤组织中的lcsc难以被根除，治疗后肿瘤组织中残存的lcsc成为肺癌复发的根源。本发明通过动物实验证实仙鹤草内酯可抑制a549肿瘤干细胞在balb/c-nude裸鼠体内所形成的瘤体增长，其抑瘤效率随着干预浓度的增加而增加，高浓度组对瘤体增长的抑制率可达59.66％。说明仙鹤草内酯可以用以抑制肺癌干细胞，预防或治疗肺癌，特别是预防或治疗非小细胞肺癌，尤其是产生了耐药性的非小细胞肺癌。
[0133]
综上，本发明发现了仙鹤草内酯对肺癌干细胞生长具有显著抑制作用，且可以抑制肺癌干细胞在体内的形成肿瘤，其对瘤体增长的抑制率可达59.66％。说明仙鹤草内酯可
用于预防或治疗肺癌，特别是预防或治疗非小细胞肺癌，尤其是预防或治疗由于肿瘤干细胞导致的具有耐药性的肺癌，并且可以抑制肺癌复发。仙鹤草内酯用于制备预防或治疗肺癌的药物具有良好的应用前景。