一种白蔹提取物及其制备方法和防治登革热Ⅱ型病毒感染的应用

一种白蔹提取物及其制备方法和防治登革热ⅱ型病毒感染的应用
技术领域
1.本发明属于药物领域，具体涉及种白蔹提取物及其制备方法和防治登革热ⅱ型病毒感染的应用。


背景技术：

2.登革病毒在分类上属黄病毒科、黄病毒属。包括4个不同血清型,即ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型登革病毒。登革热是由登革病毒引起的急性传染病，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，传播途径是伊蚊叮咬病毒血症患者的血液后被感染。临床表现主要为高热、头痛、肌肉和关节痛、皮疹、淋巴结肿大及白细胞减少等，严重者可出现出血或休克，甚至死亡。该病主要流行于热带和亚热带地区，目前全球已有100多个国家和地区有病例发生，有约25～30亿人处于登革病毒感染的危险中。该病已经严重影响了人们的身体健康和社会经济发展。由于目前尚无登革热疫苗，也缺乏相应的抗病毒药物，如何应对这一新发传染病已成为医药学界亟需应对的重大课题。
3.白蔹ampelopsis japonica(thunb.)makino为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹的干燥块根，又名山地瓜、野红薯、山葡萄秧、白根、五爪藤等。其味苦，性微寒，归心，胃经，有清热解毒、消痈散结、敛疮生肌的功效，主要用于治疗痈疽发背，疗疮，瘰疠，烧烫伤。现代药理学研究发现白蔹在抗炎、抗肿瘤、免疫调节、保护多巴胺神经元等方面起着重要作用。临床上多用于治疗痈疽发背、疔疮、瘰疬、水火烫伤等。目前文献报道中还没有出现白蔹抗登革热病毒活性报道及其在抗登革热病毒方面的应用。
4.高速逆流色谱(high
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speed countercurrent chromatography，hsccc)法的原理是液液萃取，依据化合物在两相中分配系数的不同而实现分离，利用螺旋管方向性和同步行星式运动，使溶剂系统中两相在转动管柱里达到流体动力学平衡，具有制备量大、前处理简单、无吸附损失、重现性好、回收率高多样性的操作条件等优点。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种利用hsccc法分离白蔹中防治登革热ⅱ型病毒感染有效组分的方法。
6.本发明一个方面提供了一种具有抗登革热ii型病毒感染的白蔹提取物，所述白蔹提取物先通过水提法获得白蔹水提物，然后通过高速逆流色谱分离后获得白蔹提取物。
7.本发明另一个方面提供了上述白蔹提取物的制备方法，所述制备方法以下步骤：
8.1)通过水提法获得白蔹水提物；
9.2)通过高速逆流色谱分离后获得白蔹提取物。
10.在本发明的技术方案中，在步骤1)中，水提法为取白蔹加入8
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15倍水，回流提取25
‑
45分钟，取滤液，浓缩干燥，即得白蔹水提物。
11.在本发明的技术方案中，在步骤2)中，高速逆流色谱分离的方法为：
12.21)配制溶剂体系：配制正丁醇、蒸馏水、甲醇、乙腈和冰乙酸的混合溶液，静置后，可分为两层，分别为上相和下相；其中正丁醇、蒸馏水、甲醇、乙腈和冰乙酸的体积比为100:100:5:11:6；
13.22)称取步骤1)获得白蔹水提物，取下相将样品将白蔹水提物溶解，作为样品待进样；其中样品的浓度为0.1g/ml；
14.23)开启高速逆流色谱仪的低温恒温槽，设定主机温度为30℃，将入口软管放入上相中，以20ml/min的流速将上相泵入主机管路，待上相流出300ml～400ml后，再将入口软管放入下相中，以2ml/min的流速泵入下相，同时打开检测系统，启动主机，调速到850r/min，启动自动部分收集器，收集流出的前50ml溶液，浓缩干燥，获得抗登革热ii型病毒感染的白蔹提取物。
15.本发明再一个方面提供了上述白蔹提取物在制备治疗或预防登革热ⅱ型病毒引起的疾病的药物中的用途。
16.在本发明的技术方案中，预防登革热ⅱ型病毒引起的疾病为登革热。
17.本发明再一个方面提供了上述白蔹提取物在制备抑制登革热ⅱ型病毒所诱导的细胞病变的药物中的用途。
18.本发明再一个方面提供了上述白蔹提取物在制备抑制登革热ⅱ型病毒所诱导的细胞死亡的药物中的用途。
19.本发明再一个方面提供了上述白蔹提取物在制备抑制登革热ⅱ型病毒所诱导的病毒rna的合成或病毒蛋白的药物中的用途。
20.在本发明的技术方案中，所述的病毒rna为病毒e蛋白和ns1蛋白的rna。
21.在本发明的技术方案中，所述的病毒蛋白为病毒e蛋白和ns1蛋白。
22.本发明再一个方面提供了一种具有抗登革热ii型病毒感染的药物组合物，所述药物组合物中包含上述白蔹提取物。
23.在本发明的技术方案中，所述的白蔹提取物作为唯一活性成分。
24.在本发明的技术方案中，所述的药物提取物的剂型为口服剂型、注射剂或外用制剂；优选为片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、外用软膏、注射液。
25.本发明再一个方面提供了一种治疗或预防登革热ⅱ型病毒引起的疾病的方法，所述方法包括给予受试者本发明上述的白蔹提取物。
26.在一个具体的实施例中白蔹提取物通过如下方法制备：
27.1)样品制备：取白蔹，加入10倍水，回流提取30分钟，放冷，滤过，取滤液，浓缩，干燥，即得白蔹水提物。
28.2)高速逆流色谱分离制备
29.配制溶剂体系：配制正丁醇：蒸馏水：甲醇：乙腈：冰乙酸(100:100:5:11:6)的混合溶液，静置后，可分为两层，分别为上相和下相；
30.称取已蒸干的样品2.0g，取下相20ml将样品溶解，作为样品待进样；
31.开启高速逆流色谱仪的低温恒温槽，设定主机温度为30℃，将入口软管放入上相中，以20ml/min的流速将上相泵入主机管路，待上相流出300ml～400ml后，再将入口软管放入下相中，以2ml/min的流速泵入下相，同时打开检测系统，启动主机，缓慢调速到850r/min，启动bs
‑
100n自动部分收集器开始收集流出液，每试管收集5min的流出液，前10管收集
为目标组分即得。
32.本发明所述的固体口服制剂的制备方法为药典上所规定的常规制备方法，即将白蔹组分与固体口服制剂常用的辅料按临床上可接受配比混合制得。
33.本发明所述的液体口服制剂的制备方法为药典上所规定的常规制备方法，即将白蔹组分加水稀释后与液体口服制剂常用的辅料按临床上可接受配比混合，搅匀，滤过，灌装，灭菌，即得。
34.本发明所述的固体口服制剂或液体口服制剂具有抗ⅱ型登革热病毒的作用，可用于防治登革热感染。
35.以下通过实验来进一步说明本发明的药物的安全性和有益效果。
36.本发明是采用细胞病变抑制法研究白蔹组分对登革热ⅱ型病毒的抑制作用，观察白蔹组分aj1对bhk
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21细胞的毒性作用和对登革热ⅱ型病毒的抑制作用，利用mtt检测试剂测得白蔹组分aj1对bhk
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21细胞的半数毒性浓度(cc50)为31.57μg/ml，能显著抑制2型登革病毒所诱导的细胞死亡，其半数最大效应浓度(ec50)为0.48μg/ml，选择指数si是65.77，为低毒高效。白蔹组分aj1能够有效抑制病毒e蛋白和ns1蛋白rna和蛋白的合成，从而抑制2型登革病毒所诱导的细胞病变，且抑制作用呈剂量依赖关系。。
附图说明
37.图1是采用mtt方法检测白蔹aj1馏分对bhk
‑
21细胞的毒性。
38.图2是在显微镜下(放大40倍)观察白蔹aj1馏分对细胞病变效应的影响。
39.图3是采用cck8方法检测白蔹aj1馏分对细胞死亡情况的影响。
40.图4是采用实时荧光定量pcr方法检测白蔹aj1馏分对病毒rna表达水平的影响。
41.图5是采用免疫印迹方法检测白蔹aj1馏分对病毒蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
42.为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
43.实验材料
44.细胞株:乳仓鼠肾细胞(bhk
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21)，引自武汉病毒研究所，t11代。本室冻存保种。
45.实验组及其对应的受试药物
46.受试样品：取下述实施例1制备的白蔹水提物加水溶解，制得相当于每毫升含生药100mg的药液。
47.病毒株:登革ⅱ型病毒引自武汉病毒研究所
48.试剂和仪器:新生小牛血清及dmem培养基(gibco公司)；dmso(广州市康洋化工有限公司)；胰蛋白酶(美国difco公司；上海生工生物工程公司代理)。olympus pm
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6倒置显微镜(日本olympus公司)；e
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52aa旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；bp221s电子分析天平(上海精密仪器表有限公司)。
49.实施例1白蔹水提物的制备
50.取干燥的白蔹块根5kg，加500l蒸馏水浸泡30分钟，煎煮60分钟，趁热过滤，浓缩至1.05～1.1比重的稠浸膏，干燥，得白蔹水提物样品。
51.采用正丁醇：蒸馏水：甲醇：乙腈：冰乙酸(100:100:5:11:6)的溶剂系统分离白蔹水提物样品，静置后，可分为两层，分别为上相和下相；
52.称取已蒸干的样品2.0g，取下相20ml将样品溶解，作为样品待进样；
53.开启高速逆流色谱仪的低温恒温槽，设定主机温度为30℃，将入口软管放入上相中，以20ml/min的流速将上相泵入主机管路，待上相流出300ml～400ml后，再将入口软管放入下相中，以2ml/min的流速泵入下相，同时打开检测系统，启动主机，缓慢调速到850r/min，启动bs
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100n自动部分收集器开始收集流出液，每试管收集5min的流出液，前10管收集物即得白蔹组分aj1，11
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20管收集物即得白蔹组分aj2，21
‑
30收集物即得白蔹组分aj3。
54.实施例2白蔹组分aj1\aj2\aj3对bhk
‑
21细胞的毒性
55.取处于对数生长期的bhk
‑
21细胞，以1
×
105个/ml的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μl。24h后，给予不同浓度的白蔹aj1、aj2或aj3馏分，在含2％血清的维持液中培养4d。之后每孔加入20μl的mtt溶液(5mg/ml)继续培养，4h后弃细胞上清液，每孔加入100μl dmso溶解甲瓒，于酶标仪570nm处检测各孔的吸光度值。白蔹组分aj1对bhk
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21细胞的半数毒性浓度为31.57μg/ml(图1)。而白蔹组分aj2和aj3对bhk
‑
21细胞没有杀伤毒性。
56.实施例3白蔹组分aj1抑制2型登革病毒所诱导的细胞病变
57.取处于对数生长期的bhk
‑
21细胞，以1
×
105个/ml的细胞密度接种于6孔板中，每孔2ml。24h后，弃细胞上清，pbs清洗2～3次，加入含有白蔹组分aj1(0.5、1和2μg/ml)的200pfu 2型登革病毒(denv
‑
2)进行感染。1h后，弃白蔹组分aj1与病毒混合液，pbs清洗2～3次，在含2％血清的维持液继续培养。4～5d后于显微镜下观察各孔细胞病变情况并拍照。白蔹组分aj1抑制2型登革病毒所诱导的细胞病变，且抑制作用呈剂量依赖关系(图2)。
58.实施例4白蔹组分aj1抑制2型登革病毒所诱导的细胞死亡
59.取处于对数生长期的bhk
‑
21细胞，以1
×
105个/ml的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μl。24h后，弃细胞上清，pbs清洗2～3次，加入含有不同浓度白蔹组分aj1的200pfu2型登革病毒进行感染。1h后，弃白蔹组分aj1与病毒混合液，pbs清洗2～3次，在含2％血清的维持液继续培养。4d后采用cck8法检测白蔹组分aj1对细胞死亡情况的影响。白蔹组分aj1能显著抑制2型登革病毒所诱导的细胞死亡，其半数有效浓度为0.48μg/ml(图3)。对比实施例2的半数毒性浓度可知本发明获得的白蔹组分aj1的治疗窗口很宽；选择指数si达到65.77，为低毒高效的活性成分。
60.实施例5白蔹组分aj1抑制2型登革病毒诱导病毒rna的合成
61.取处于对数生长期的bhk
‑
21细胞，以1
×
105个/ml的细胞密度接种于6孔板中，每孔2ml。24h后，弃细胞上清，pbs清洗2～3次，加入含有不同浓度白蔹组分aj1的200pfu 2型登革病毒进行感染。1h后，弃白蔹组分aj1与病毒混合液，pbs清洗2～3次，在含2％血清的维持液继续培养。2d后采用实时荧光定量pcr法检测白蔹组分aj1对病毒e蛋白和ns1蛋白rna表达情况的影响。白蔹组分aj1能够有效抑制2型登革病毒诱导的病毒e蛋白和ns1蛋白rna的合成(图4)。
62.实施例6白蔹组分aj1抑制2型登革病毒诱导病毒蛋白的合成
63.取处于对数生长期的bhk
‑
21细胞，以1
×
105个/ml的细胞密度接种于60mm培养皿中，每孔3ml。24h后，弃细胞上清，pbs清洗2～3次，加入含有不同浓度白蔹组分aj1的200pfu 2型登革病毒进行感染。1h后，弃白蔹组分aj1与病毒混合液，pbs清洗2～3次，在含2％血清
的维持液继续培养。2d后采用免疫印迹方法检测白蔹组分aj1对病毒e蛋白和ns1蛋白表达情况的影响。白蔹组分aj1能够显著抑制2型登革病毒诱导的病毒e蛋白和ns1蛋白的合成(图5)。
64.实施例7：颗粒剂的制备
65.取实施例1的白蔹组分aj1 100g，加入蔗糖、糊精等辅料，置于沸腾制粒机中混合、制粒，干燥，分装500袋，每袋2g。本品为棕绿色颗粒，味微甜、苦。其它项目应符合中华人民共和国药典2020年版颗粒剂项下的有关规定。
66.实施例8：胶囊剂的制备
67.取实施例1的白蔹组分aj1 100g，加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、制粒，干燥。将所得颗粒装入1号硬明胶胶囊中，分装500粒，每粒0.3g。本品为胶囊剂，内容物为棕绿色的颗粒或粉末，味微苦，供口服使用。其它项目应符合中华人民共和国药典2020年版胶囊剂项下的有关规定。
68.实施例9：片剂的制备
69.取实施例1的白蔹组分aj1 100g，加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、制粒，干燥后加入适量硬脂酸镁压片，分装500片，每片0.2g。本品为棕绿色片剂，味微苦，供口服使用。其它项目应符合中华人民共和国药典2020年片剂项下的有关规定。
70.实施例10：口服液的制备
71.取实施例1的白蔹组分aj1 50g，加水适量溶解，滤过，加入单糖浆及苯甲酸钠适量，加水至2500ml，搅匀，静置，滤过，灌封，灭菌，每支10ml。本品为棕色澄清液体，味甜、微苦供口服使用。其它项目应符合中华人民共和国药典2020年口服液项下的有关规定。
72.实施例11：外用膏剂的制备
73.取实施例1的白蔹组分aj1 50g，将蜂蜡加热融化；加入食用植物油和助剂，搅拌使之成为均匀的乳状液体；加入植物精油，搅拌均匀；所得溶液分装，静置冷却，使其凝固。
74.实施例12
75.白蔹通过水提法获得白蔹水提物，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别进行萃取，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位，并采用实施例2和3相同的的方法对bhk
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21细胞的毒性作用和对登革热ⅱ型病毒的抑制作用进行检测，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位无登革热ⅱ型病毒的抑制作用。
76.实施例13
77.白蔹通过水提法获得白蔹水提物，用d101大孔树脂进行分离，用30％、60％和95％乙醇进行洗脱，分别得到30％、60％和95％乙醇部位对并采用实施例2和3相同的的方法对bhk
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21细胞的毒性作用和对登革热ⅱ型病毒的抑制作用进行检测，30％、60％和95％乙醇部位无登革热ⅱ型病毒的抑制作用。