具有协同抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖功效的药物组合物及应用

具有协同抑制非小细胞肺癌a549细胞增殖功效的药物组合物及应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，涉及一种具有协同抑制非小细胞肺癌a549细胞增殖功效的药物组合物及其应用。


背景技术：

2.目前，肺癌的发病率和致死率在恶性肿瘤中均位于第一位，其中非小细胞肺癌(non
‑
small cell lung cancer,nsclc)占肺癌发病人数中的80％以上，对于i或ii期nsclc患者一般采取手术治疗，ⅲ期nsclc患者则主要采取放化疗及免疫治疗，而ⅲ期nsclc患者治疗后五年内生存率只有15％，总体预后不佳【yoon sm,shaikh t,hallman m.therapeutic management options for stage iii non
‑
small cell lung cancer.world j clin oncol,2017；8(1):1
‑
20】。随着近年来化疗方案的不断改善，肺癌患者的生存率已经有了一定提升，但是长期化疗会导致肿瘤细胞出现耐药性，严重影响疗效，例如常用的肺癌化疗药物顺铂，在临床治疗中已经出现广泛的耐药现象【zhang yajuan,chang de,zhang jianpeng.research advances in resistance to platinum
‑
based chemotherapy in lung cancer.acta acad med sin,2017,39(1):150
‑
155】。以pd
‑
1/l1、ctla
‑
4等为代表的免疫检测点抑制剂是晚期肺癌免疫治疗的主要手段，但是在治疗过程中存在费用高昂、预防转移不明确、过度免疫以及t细胞介导的多种不良反应频发等问题，阻碍了其进一步发展【罗添乐,罗斌,姚嘉良,田建辉.肺癌免疫治疗的临床研究进展.肿瘤学杂志:2021，1671
‑
170x】。因此，新的药物开发以及新的药物组合的应用，对于肺癌的治疗进展的突破具有重要意义。
3.桂皮醛(cinnamaldehyde，ca)，结构如式i所示，是从肉桂中提取的烯醛类化合物，也是肉桂挥发油中的主要成分。药理研究表明，桂皮醛具有抗炎、解热镇痛、抗肿瘤等多种药理活性。中国专利也公开了桂皮醛在解热【cn201811042361】、镇痛【cn201810315891】、治疗皮肤及黏膜疾病【cn201810821967、cn201810019853】、抗癌【cn201810973728】等领域中的应用。
[0004][0005]
冲山茶苷(okicamelliaside，ocs)，结构如式ii所示，是从金花茶中提取的鞣花酸衍生物，也是金花茶甲醇提取物中的主要成分。近年来，金花茶化学成分和药理作用研究逐步开展，发现了多种天然活性成分，包括黄酮，多糖，植物多酚，皂苷等，且体内外药理实验证明金花茶在抗肿瘤、抗氧化、抗炎、调节血糖血脂和抗过敏等方面均表现出潜在的药用价值【he d,li x,sai x,et al.camellia nitidissima cw chi:a review ofbotany,chemistry,2019,62(23):10798
‑
10815】。
[0006][0007]
目前，尚未有使用桂皮醛和冲山茶苷组成组合物治疗抑制非小细胞肺癌a549细胞增殖的报道。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种具有协同抑制非小细胞肺癌a549细胞增殖功效的药物组合物。
[0009]
本发明的第二个目的是提供一种具有协同抑制非小细胞肺癌a549细胞增殖功效的药物组合物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
[0010]
本发明的技术方案概述如下：
[0011]
一种具有协同抑制非小细胞肺癌a549细胞增殖功效的药物组合物，包括桂皮醛和冲山茶苷。
[0012]
优选地，桂皮醛和冲山茶苷的摩尔比为30:(6.25
‑
200)。
[0013]
上述药物组合物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
[0014]
本发明的优点：
[0015]
将桂皮醛和冲山茶苷联合使用，其药效大于单独使用的药效，对a549细胞的增殖具有抑制作用。
[0016]
经测定，本发明提供的组合物可抑制a549细胞的生长，且具有抗肿瘤功效，本发明的组合物中，使用量少于单独药量。
[0017]
本发明对药物剂型不作限定，凡是药物领域接受的剂型均在本发明的保护范围之内。
[0018]
本发明的组合物具有抗非小细胞肺癌效果，我们在开展肿瘤发病机理的研究中结合使用相关裸鼠移植瘤模型的病理实验，发现相比于单体给药，将桂皮醛和冲山茶苷联合使用具有更强的抑制实体瘤生长的作用。说明桂皮醛和冲山茶苷具有协同作用，可应用于治疗非小细胞肺癌。
附图说明
[0019]
图1示通过cck
‑
8实验分别检测两种药物对不同品系细胞株作用的ic
50
值。
[0020]
图2示通过cck
‑
8实验检测两种药物联合作用后对a549细胞的抑制作用，并通过compusyn软件计算两种药物联合作用的协同指数(ci值)。图2为两种药物联合作用的ci值。
[0021]
图3示两药联合与相应单药相比，对a549
‑
luc移植瘤在实验动物体内成瘤体积变化影响和实验动物的体重变化影响。图3a为各组实验裸鼠的平均肿瘤体积统计；图3b为各
组实验裸鼠的平均体重统计。
[0022]
图4示两药联合与相应单药相比，对a549
‑
luc移植瘤在实验动物体内成瘤荧光值的影响。图4为各组实验裸鼠肿瘤的平均荧光值统计。
[0023]
图5示两药联合与相应单药相比，对a549
‑
luc移植瘤在实验动物体内成瘤大小的影响。图5为各组实验裸鼠中剥离肿瘤的平均重量统计。
具体实施方式
[0024]
本发明实验中使用桂皮醛(购自上海阿拉丁，货号c110084)，冲山茶苷(金花茶经大孔树脂及中压制备提取分离制得)。
[0025]
本发明的组合物是将桂皮醛和冲山茶苷混合得到。
[0026]
在本发明的具体实施方案中，不同品系细胞株包括：非小细胞肺癌a549、人恶性黑色素瘤细胞a375、人肝癌细胞hepg2、宫颈癌细胞hela、巨噬细胞raw264.7、人正常肺上皮细胞beas
‑
2b、心肌细胞h9c2、成纤维细胞nih
‑
3t3、人肾上皮细胞293t。
[0027]
本发明选择非小细胞肺癌a549细胞进行本发明组合物的协同实验验证。
[0028]
使用本发明的组合物，所述桂皮醛的药物浓度为10
–
30微摩尔/升；所述冲山茶苷的药物浓度为6.25
–
20微摩尔/升。
[0029]
在a549细胞中，优选条件范围为：桂皮醛30微摩尔/升，冲山茶苷6.25
–
200微摩尔/升。
[0030]
为了验证细胞实验得到的结果，我们在此优选范围内选取两个不同比例配比的药物联合应用，在动物水平进行实验。在裸鼠a549
‑
luc移植瘤模型中进行联合给药时，给药方式为腹腔注射。所述冲山茶苷用量为10毫克(0.02毫摩尔)/千克/天；所述桂皮醛用量为5毫克(0.0毫摩尔)/千克/天和10毫克(0.08毫摩尔)/千克/天。
[0031]
本领域技术人员可以借鉴本文内容是当改进。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，都属于本发明的保护范围。
[0032]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0033]
实施例1
[0034]
通过cck
‑
8实验，考察桂皮醛和冲山茶苷对不同品系细胞株的增殖抑制作用。
[0035]
取对数生长期的不同品系细胞株，待细胞生长至80％融合度时进行消化，取100微升细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，置于37摄氏度，5％co2条件的培养箱中培养过夜。细胞贴壁后，弃去原有培养基，分别将不同浓度(7.5
–
30微摩尔/升)的桂皮醛和(6.25
–
200微摩尔/升)的冲山茶苷在培养基中混匀，各孔100微升加入到96孔板中(空白组加入培养基，不含细胞、药物；对照组加入培养基、细胞，不含药物)，每组设置6个复孔，给药孵育72小时。待给药结束后，在各个孔中加入10微升的cck
‑
8溶液，避光于37摄氏度条件下孵育1小时左右，取出，用酶标仪在450纳米处测定各孔吸光度，并计算ic
50
值。
[0036]
结果表明，桂皮醛和冲山茶苷单独使用，对于非小细胞肺癌a549、人恶性黑色素瘤细胞a375、人肝癌细胞hepg2和宫颈癌细胞hela的增殖抑制效果较好，ic
50
值较低，对于巨噬细胞raw264.7、人正常肺上皮细胞beas
‑
2b、心肌细胞h9c2、成纤维细胞nih
‑
3t3和人肾上皮
细胞293t的增殖抑制效果较差，ic
50
值较高(图1)。最终选择非小细胞肺癌a549细胞进行本发明组合物的协同实验验证。
[0037]
实施例2
[0038]
通过cck
‑
8实验，考察桂皮醛和冲山茶苷联合使用(本发明的组合物，具体配比见表1)对非小细胞肺癌a549细胞的增殖抑制作用。
[0039]
取对数生长期的细胞，待细胞生长至80％融合度时消化，取100微升细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，置于37摄氏度，5％co2条件的培养箱中培养过夜。细胞贴壁后，弃去原有培养基，将联合用药组的桂皮醛和冲山茶苷在培养基中混匀，各孔100微升加入到96孔板中(空白组加入培养基，不含细胞、药物；对照组加入培养基、细胞，不含药物)，每组设置6个复孔，给药孵育72小时。待给药结束后，在各个孔中加入10微升的cck
‑
8溶液，避光于37摄氏度条件下孵育1小时左右，取出，用酶标仪在450纳米处测定各孔吸光度。
[0040]
结果评定：按下列公式分别计算不同化合物对多种细胞生长抑制率：
[0041]
细胞增殖抑制率(fa)＝(od
对照孔
－od
实验孔
)/(od
对照孔
－od
空白孔
)。应用compusyn软件分析ci值，<1代表具有协同作用，＝1为相加作用，>1为拮抗作用。
[0042]
结果表明，不同浓度的桂皮醛和冲山茶苷联合作用后，在部分浓度下表现出对非小细胞肺癌a549细胞的协同抑制作用(图2，表1)，优选地，桂皮醛和冲山茶苷的摩尔比为30:(6.25
‑
200)。
[0043]
表1 a549细胞中ca+ocs联合作用后的ci值
[0044][0045]
实施例3
[0046]
裸鼠品种为balb/c
‑
nu(spf级)，雄性，4
‑
6周龄，体重18
‑
22克，根据饲养标准进行饮食管理，适应性饲养一周后用于实验。
[0047]
通过桂皮醛和冲山茶苷联合给药(本发明的组合物)的方法，观察对balb/c
‑
nu裸鼠体内a549
‑
luc移植瘤的影响。
[0048]
将状态良好的a549
‑
luc细胞进行传代培养，待培养至一定数量且细胞处于对数增长期时，用胰酶消化，在室温条件下，800转/分钟离心3三分钟收集细胞，用无菌生理盐水清洗细胞2次，并将细胞重悬，制成浓度为1
×
107个/毫升的细胞悬液，每只裸鼠于右侧腋下位置接种100微升细胞悬液。每日观测裸鼠状况，移植瘤模型构建约一周后可见在裸鼠右侧腋下处形成一球状实心凸起，体积约100立方毫米，即动物模型构建成功。随机将动物分为7组，每组5只。分组情况为：(1)模型对照组；生理盐水；(2)阳性对照组：阿霉素(dox)0.5毫
克/千克/天；(3)冲山茶苷(ocs)组：10毫克(0.02毫摩尔)/千克/天；(4)：桂皮醛(ca)组1：5毫克(0.04毫摩尔)/千克/天；(5)桂皮醛(ca)组2：10毫克(0.08毫摩尔)/千克/天；(6)联合组1：ocs 10毫克(0.02毫摩尔)/千克/天+ca 5毫克(0.04毫摩尔)/千克/天；(7)联合组2：ocs 10毫克(0.02毫摩尔)/千克/天+ca 10毫克(0.08毫摩尔)/千克/天。给药方式为腹腔注射给药，0.1毫升/只/天，共给药26天。每天测量并记录裸鼠体重和肿瘤体积大小变化。
[0049]
结果显示，dox组、ocs组、联合组1、联合组2较模型对照组显著降低了a549
‑
luc移植瘤的体积大小，联合组1较单独给药组相比，a549
‑
luc移植瘤的生长被更大程度地抑制，联合组2较单独给药ocs组无显著性差异，但较单独给药ca组对a549
‑
luc移植瘤的抑制作用更明显，且单独给药或联合给药对动物体重均没有显著影响。表明联合给药组抑制效果明显高于单独给药组且没有明显毒性(图3)，
#
代表联合组1vs ocs组p<0.05，
▲
代表联合组2vs ca组2p<0.05，***代表dox组，ocs组，ca组1，ca组2vs mod组p＜0.001，
△△△
代表联合组1vs ca组1p<0.001，组间差异具有统计学意义。
[0050]
实施例4
[0051]
实施例3中裸鼠最后一天给药后，腹腔注射荧光底物(d
‑
荧光素钾盐，10毫克/毫升，150微升)，5微升后腹腔注射戊巴比妥钠溶液(40毫克/千克)进行麻醉。将裸鼠固定在检测台上并进行荧光成像的检测。在检测仪器上进行数据分析、总光量子数和荧光强度图片的采集。
[0052]
结果显示，dox组、ocs组、联合组1、联合组2较模型对照组总光量子数显著降低，联合组1较单独给药组相比，a549
‑
luc的存活量显著降低，联合组2较单独给药组无显著性差异。表明联合给药组[ocs 10毫克(0.02毫摩尔)/千克/天+ca 5毫克(0.04毫摩尔)/千克/天]裸鼠体内a549
‑
luc的存活量明显低于单独给药组(图4)，
#
代表联合组1vs ocs组p<0.05，*代表联合组2vs mod组p<0.05，**代表ocs组vs mod组p＜0.01，***代表dox组，联合组1vs mod组p＜0.001，
△△△
代表联合组1vs ca组1p<0.001，组间差异具有统计学意义。
[0053]
实施例5
[0054]
经实施例4活体荧光成像后，颈部脱臼处死裸鼠，将肿瘤剥离并称重，对比肿瘤大小。
[0055]
结果显示，dox组、ocs组、ca组1、联合组1、联合组2较模型对照组肿瘤重量显著降低，联合组1较单独给药组相比，肿瘤重量明显降低，而联合组2较单独给药组无显著性差异。表明联合给药组[ocs 10毫克(0.02毫摩尔)/千克/天+ca 5毫克(0.04毫摩尔)/千克/天]对a549
‑
luc的生长抑制效果明显高于单独给药组(图5)，
#
代表联合组1vs ocs组p<0.05，*代表ca组1vs mod组p<0.05，***代表dox组，ocs组，联合组1，联合组2vs mod组p＜0.001，
△△△
代表联合组1vs ca组1p<0.001，组间差异具有统计学意义。