三棱总酚提取物在治疗弥散性血管内凝血药物制备上的应用的制作方法

本发明属于药物新用途技术领域，具体涉及三棱总酚提取物在治疗弥散性血管内凝血药物制备上的应用。

背景技术：

弥散性血管内凝血（dic）是一种临床常见的凝血功能障碍性疾病，是在基于一些疾病之上，微血管体系被一些致病因素所破坏，从而激活了血液中的凝血功能，导致微血管血栓，从而引发该疾病。其病因包括细菌真菌感染、恶性肿瘤、产科疾病、药物或食物中毒等。脓毒症是感染导致的全身炎症反应综合征，凝血功能障碍与脓毒症有密切的联系，凝血障碍与炎症反应相互促进，相互影响，最终发展多器官功能衰竭死亡。30%～50%的脓毒症患者会发生dic，约占dic患者总数的50%。脓毒症并发dic的病死率达28%～43%。脓毒症合并dic的治疗原则首先是清除原发灶，控制感染。目前临床主要使用抗凝药物肝素钠、重组活化蛋白c等，但实际使用中很难达到预期，临床试验表明不能明显改善生存率。

三棱为黑三棱科植物黑三棱sparganiumstoloniferumbuch.-ham.的干燥块茎，冬季至次年春采挖，洗净，削去外皮，晒干后入药，主产于黑龙江、吉林、辽宁、河北、河南等地。三棱味辛、苦，性平，归肝、脾经，可破血行气、消肿止痛，用于癥瘕痞块、痛经、瘀血经闭、胸痹心痛、食积胀痛。现代研究表明，三棱中主要含挥发油类、苯丙素类、黄酮类等化学成分，具有抗血栓、抗炎、镇痛、抗肿瘤等药理作用。

虽然三棱被报道具有抗血栓的功效，但血栓涉及的药理作用太泛。例如，血栓形成的原因不同治疗也不同，动脉血栓以血小板聚集形成栓子为主，治疗上也以抗血小板为主，静脉血栓因血流速度较慢，且凝血机制大于抗凝机制形成栓子，治疗上主要以抗凝为主。因此，对于要求精准医疗的药物来说，现有研究还不够深入。本专利对三棱总酚提取物的抗血栓作用进行剖析，发现更精准的药理作用，有利于新药研发。

技术实现要素：

在研究中发现，三棱的总酚提取物对治疗弥散性血管内凝血有良好的作用。

本发明的技术方案如下：

三棱总酚提取物在治疗弥散性血管内凝血药物制备上的应用。

所述的三棱总酚提取物的制备方法为：取三棱药材适量，粉碎，乙醇回流，合并滤液，真空下浓缩至浸膏；浸膏用聚酰胺树脂吸附，依次用水和乙醇洗脱，减压浓缩，真空干燥后得三棱总酚提取物。

近一步地，所述的三棱总酚提取物的制备方法为：取三棱药材适量，粉碎后过4号筛，10倍量80％乙醇浸泡30min，加热回流60min，重复2次，合并滤液，真空旋转蒸发器（60℃）回收乙醇，浓缩至浸膏。取适量浸膏以聚酰胺树脂（80-100目）吸附，浸膏与聚酰胺树脂质量比为1：3，依次用水和80%乙醇洗脱，洗脱量均为3倍柱体积（bv），洗脱流速控制为0.6ml·min^-1，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥后得三棱总酚提取物。

优选地，所述弥散性血管内凝血为：脓毒症并发弥散性血管内凝血。

近一步地，所述弥散性血管内凝血的治疗为对脓毒症引起的凝血紊乱加重的纠正，激活线粒体自噬功能，保护血管内皮细胞炎症损伤，降低ldh、组织因子tf和炎症因子il-1β水平。

所述三棱总酚提取物按1g·ml^-1的生药量计，包括成分如下：对羟基苯甲醛mg∙ml^-1、香草酸2.2mg∙ml^-1、对香豆酸16.2mg∙ml^-1、阿魏酸82.5mg∙ml^-1、芦丁232.1mg∙ml^-1、山奈酚76.8mg∙ml^-1、芒柄花素20.7mg∙ml^-1、对羟基苯甲酸132.7mg∙ml^-1、原儿茶酸81.9mg∙ml^-1、异阿魏酸54.4mg∙ml^-1、咖啡酸33.7mg∙ml^-1。

优选地，所述的制备治疗弥散性血管内凝血药物为：三棱总酚提取物和药学上可接受的载体制备成注射液、片剂、粉针剂、颗粒剂、胶囊、膏剂、霜剂或口服液剂型的药物。

tps-sl在弥散性血管内凝血治疗上，更精准地针对了具体疾病－脓毒症合并dic，使患者在检查出所属病因后，能更明确、快捷选择三棱总酚提取物制剂进行干预治疗。[x1]

本发明的有益效果：

1.通过大鼠dic血栓模型，以肝素做阳性对照，结果发现tps-sl组血浆凝血酶原时间（pt）、活化部分凝血活酶时间（aptt）缩短，纤维蛋白原（fbg）、血小板计数（plt）升高，d-二聚体（dd）下降，证实tps-sl具有良好的抗dic活性。

2.通过体外细胞实验验证tps-sl可显著降低细胞ldh水平，提高细胞成活率，升高线粒体膜电位，表明tps-sl有显著保护血管内皮细胞损伤的作用。作用机制是给予tps-sl干预后，细胞beclin-1、lc3-ii、parkin及pink蛋白表达量显著增加），细胞上清液中组织因子tf和炎症因子il-1β显著降低，表明tps-sl通过调控细胞线粒体自噬发挥抗凝抗炎作用。

3.为开发一种治疗脓毒症并发弥散性血管内凝血的新药打下实验基础。

附图说明

图1为tps对huvec细胞的保护效果；

图2为tps对huvec细胞线粒体膜电位的影响；

图3为tps对线粒体自噬相关蛋白的影响；

图4为tps对组织因子tf和炎症因子il-1β的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述的三棱总酚提取物（tps-sl）在弥散性血管内凝血保护药物制备上的应用做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

（1）三棱总酚提取物tps-sl的制备：取三棱样品1000g，粉碎后过4号筛，10倍量80％乙醇浸泡30min，加热回流60min，重复2次，合并滤液，真空旋转蒸发器（60℃）回收乙醇，浓缩至浸膏。取适量浸膏以聚酰胺树脂（80-100目）吸附，浸膏与聚酰胺树脂质量比为1:3，依次用水和80%乙醇洗脱，洗脱量均为3倍柱体积（bv），洗脱流速控制为0.6ml·min^-1，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩，在真空烘箱中干燥，得到135克干提物。制备的tps-sl样品在-20℃冰箱中保存。

hplc-ms分析tps-sl成分。1g∙ml^-1生药量所含的成分及含量具体为：对羟基苯甲醛14.3mg∙ml^-1、香草酸2.2mg∙ml^-1、对香豆酸16.2mg∙ml^-1、阿魏酸82.5mg∙ml^-1、芦丁232.1mg∙ml^-1、山奈酚76.8mg∙ml^-1、芒柄花素20.7mg∙ml^-1、对羟基苯甲酸132.7mg∙ml^-1、原儿茶酸81.9mg∙ml^-1、异阿魏酸54.4mg∙ml^-1、咖啡酸33.7mg∙ml^-1。

（2）tps-sl抗弥散性血管内凝血dic作用的实验研究

应用脂多糖（lps）诱导建立大鼠dic血栓模型，以肝素做阳性对照，评价不同剂量下tps-sl抗凝作用。结果发现，与lps模型组相比，tps-sl组血浆凝血酶原时间（pt）、活化部分凝血活酶时间（aptt）缩短，纤维蛋白原（fbg）、血小板计数（plt）升高，d-二聚体（dd）下降，提示tps-sl具有良好的抗dic活性。

表1.凝血指标变化（,n=6）

注：与正常组比较，^*p<0.01；与lps模型组比较，^#p<0.05。

（3）tps-sl对huvec细胞损伤的影响

构建lps诱导huvec细胞损伤模型并分组，给大鼠灌胃高剂量tps-sl，取2小时含药血清，固相萃取柱纯化富集血中成分，复溶至原体积，稀释至1%、3%、5%作用于huvec细胞。结果发现，与模型组比较，tps-sl组可显著降低细胞ldh水平，提高细胞成活率（见图1），升高线粒体膜电位（见图2），表明tps-sl有显著保护血管内皮细胞损伤的作用。

从作用机制上分析，给予tps干预后，细胞beclin-1、lc3-ii、parkin及pink蛋白表达量显著增加（见图3），细胞上清液中组织因子tf和炎症因子il-1β显著降低（见图4），表明tps-sl通过调控细胞线粒体自噬发挥抗凝抗炎作用。