检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体为检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法。

背景技术：

胰腺癌是最致命的实体恶性肿瘤之一。该病早期发现和治疗极为困难，进展迅速，无明显临床症状。胰腺导管腺癌占胰腺癌的90％以上。2018年，全球共有458918例pdac新发病例，432242例死亡。患者5年生存率仅为7％，中位生存时间为确诊后4-6个月。然而，在过去的几十年中，其改善患者生存率的研究进展缓慢，只有20％的患者在确诊后经手术切除，且大多数术后患者需要接受化疗治疗，才可以延长患者几个月生存时间。因此，需要研究新的治疗方法来改善这种致命肿瘤的治愈率。

豆蔻明是从高山植物中分离得到的一种天然查尔酮。研究表明其具有抗炎、抗肿瘤、抗微生物等生物活性。豆蔻明显著抑制了dss和tnbs诱导的小鼠结肠炎；同时增强顺铂对卵巢癌的抗增殖作用；且可以通过抑制氧化应激来减轻压力超载引起的心力衰竭。此外，它还可以调节几种肿瘤的细胞凋亡，包括鼻咽癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤。然而，豆蔻明对胰腺癌细胞的作用影响尚不清楚，限制了其在临床上的应用。

技术实现要素：

本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有豆蔻明在临床应用中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法，能够检测豆蔻明对胰腺癌细胞的作用影响，提高其在临床上的应用。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：

一种检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法，具体步骤如下：

s1、胰腺癌细胞培养于添加10％胎牛血清的dmem培养基中；

s2、胰腺癌细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，隔夜孵化后，细胞给予不同稀释浓度的豆蔻明孵化48h和72h，然后用20μlmtt试剂添加到每个孔中，继续孵化4h。

s3、以dmso溶解mtt试剂，用微孔板检测仪在490nm处测定各孔的吸光度。

作为本发明所述的检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法的一种优选方案，其中，还包括：s4、胰腺癌细胞以5000个细胞/孔的密度接种于4孔板中，隔夜孵化后，胰腺癌细胞给予不同稀释浓度的豆蔻明，孵化48h，之后移出培养基，在每个孔板中加入100μl的hoechest33342，标准培养条件下孵化30分钟，之后用pbs洗涤细胞，用倒置荧光显微镜拍摄荧光图像在波长为460nm下的图像。

作为本发明所述的检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法的一种优选方案，其中，还包括：s5、胰腺癌细胞接种于6孔板并给予豆蔻明处理24h后收集细胞，用冰-冷pbs洗涤，并与膜联蛋白v-fitc和碘化丙啶在黑暗中孵育20分钟，细胞通过缓冲液重新悬浮，通过流式细胞仪检测。

作为本发明所述的检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法的一种优选方案，其中，还包括：s6、在ripa样品缓冲液中裂解细胞制备全细胞提取物，等量的细胞裂解液在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移到聚偏二氟乙烯膜，用bax、bcl-2、parp、细胞色素c和gapdh抗体作为一抗进行检测，抗兔igg，辣根过氧化物酶作为二抗，斌利用增强的化学发光系统检测信号。

作为本发明所述的检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法的一种优选方案，其中，所述步骤s1中，dmem培养基的温度为37℃，并含有5％的co2。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：通过检测胰腺癌细胞对豆蔻明的抑制活性、观察豆蔻明对胰腺癌细胞的抗增殖作用，并采用hoechst染色和流式细胞术验证胰腺癌细胞抗豆蔻明增殖机制，结果表明豆蔻明具有诱导dna损伤和凋亡的作用，对胰腺癌细胞的增殖也有一定的抑制作用。豆蔻明有可能成为胰腺癌的一种新的治疗方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明豆蔻明在不同浓度下处理48h和72h后对胰腺癌细胞的相对抑制率；

图2为本发明胰腺癌细胞在不同浓度下的豆蔻明处理48h后的细胞的形态学变化；

图3为本发明胰腺癌细胞在不同浓度下的豆蔻明作用48小时后的hoechst33342的染色结果；

图4为本发明胰腺癌细胞在不同浓度下的豆蔻明作用48h后的γ-h2a.x表达的westernblotting结果；

图5为本发明胰腺癌细胞在不同浓度下的豆蔻明处理48h后annexinv-fitc/pi染色结果；

图6为本发明胰腺癌细胞在不同浓度下的豆蔻明作用48h后相关蛋白westernblotting结果。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

其次，本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施方式时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。

本发明提供一种检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法，能够检测豆蔻明对胰腺癌细胞的作用影响，提高其在临床上的应用。

实施例1

一种检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法，具体步骤如下：

s1、胰腺癌细胞培养于添加10％胎牛血清的dmem培养基中，作为优选，在本实施例中，dmem培养基的温度为37℃，并含有5％的co2。

s2、胰腺癌细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，隔夜孵化后，细胞给予不同稀释浓度的豆蔻明孵化48h和72h，然后用20μlmtt试剂添加到每个孔中，继续孵化4h。

s3、以dmso溶解mtt试剂，用微孔板检测仪在490nm处测定各孔的吸光度。

如图1所示，2-32μm浓度的豆蔻明在48h和72h时，显著减少了胰腺癌细胞总数，且呈剂量依赖性，长时间处理(72h)的总活细胞数比48h处理下降的更多。豆蔻明对胰腺癌细胞48h和72h的ic50分别为28.86μm和22.83μm。

同时，显微镜下观察豆蔻明处理后胰腺癌细胞的形态学变化。如图2所示，与对照组相比，胰腺癌细胞处理后细胞数量明显减少，大量细胞变圆与死亡。这些数据表明，豆蔻明抑制了胰腺癌细胞的增殖。

实施例2

一种检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法，具体步骤如下：

s1、胰腺癌细胞培养于添加10％胎牛血清的dmem培养基中，作为优选，在本实施例中，dmem培养基的温度为37℃，并含有5％的co2。

s2、胰腺癌细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，隔夜孵化后，细胞给予不同稀释浓度的豆蔻明孵化48h和72h，然后用20μlmtt试剂添加到每个孔中，继续孵化4h。

s3、以dmso溶解mtt试剂，用微孔板检测仪在490nm处测定各孔的吸光度。

s4、胰腺癌细胞以5000个细胞/孔的密度接种于4孔板中，隔夜孵化后，胰腺癌细胞给予不同稀释浓度的豆蔻明，孵化48h，之后移出培养基，在每个孔板中加入100μl的hoechest33342，标准培养条件下孵化30分钟，之后用pbs洗涤细胞，用倒置荧光显微镜拍摄荧光图像在波长为460nm下的图像。

在上述实施例1中，验证了豆蔻明抑制了胰腺癌细胞的增殖，为了进一步验证豆蔻对诱导胰腺癌细胞的dna损伤的可能性，与上述实施例1不同的是，本实施实施例中还包括步骤s4，通过步骤s4来验证豆蔻对诱导胰腺癌细胞的dna损伤的可能性，由图3可以看出豆蔻明处理的胰腺癌细胞诱导染色质凝结和核收缩或碎裂，此外，胰腺癌细胞的核萎缩的数量呈浓度依赖性增加，提示豆蔻可能诱导胰腺癌细胞的dna损伤，从而抑制胰腺癌细胞的存活，而且从图4可以看出，豆蔻明明显增加了γ-h2a.x在胰腺癌细胞中的表达。这表明，豆蔻明的抗肿瘤活性与胰腺癌细胞dna损伤的诱导有关。

实施例3

一种检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法，具体步骤如下：

s1、胰腺癌细胞培养于添加10％胎牛血清的dmem培养基中，作为优选，在本实施例中，dmem培养基的温度为37℃，并含有5％的co2。

s2、胰腺癌细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，隔夜孵化后，细胞给予不同稀释浓度的豆蔻明孵化48h和72h，然后用20μlmtt试剂添加到每个孔中，继续孵化4h。

s3、以dmso溶解mtt试剂，用微孔板检测仪在490nm处测定各孔的吸光度。

s4、胰腺癌细胞以5000个细胞/孔的密度接种于4孔板中，隔夜孵化后，胰腺癌细胞给予不同稀释浓度的豆蔻明，孵化48h，之后移出培养基，在每个孔板中加入100μl的hoechest33342，标准培养条件下孵化30分钟，之后用pbs洗涤细胞，用倒置荧光显微镜拍摄荧光图像在波长为460nm下的图像。

s5、胰腺癌细胞接种于6孔板并给予豆蔻明处理24h后收集细胞，用冰-冷pbs洗涤，并与膜联蛋白v-fitc和碘化丙啶在黑暗中孵育20分钟，细胞通过缓冲液重新悬浮，通过流式细胞仪检测。

在上述实施例2中，验证了豆蔻明豆蔻明的抗肿瘤活性与胰腺癌细胞dna损伤的诱导有关，为了进一步验证豆蔻明对胰腺癌细胞的诱导凋亡作用，与上述实施例2不同的是，本实施实施例中还包括步骤s5，通过步骤s5来验证豆蔻明对胰腺癌细胞的诱导凋亡作用，如图5所示，采用流式细胞术检测5、10、15μm豆蔻明处理胰腺癌细胞24h后的细胞凋亡情况。通过annexinv/pi分析发现，在豆蔻明处理后，大量胰腺癌细胞以浓度依赖的方式发生凋亡。

实施例4

一种检测豆蔻明对胰腺癌细胞的细胞增殖与凋亡作用的方法，具体步骤如下：

s1、胰腺癌细胞培养于添加10％胎牛血清的dmem培养基中，作为优选，在本实施例中，dmem培养基的温度为37℃，并含有5％的co2。

s2、胰腺癌细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，隔夜孵化后，细胞给予不同稀释浓度的豆蔻明孵化48h和72h，然后用20μlmtt试剂添加到每个孔中，继续孵化4h。

s3、以dmso溶解mtt试剂，用微孔板检测仪在490nm处测定各孔的吸光度。

s4、胰腺癌细胞以5000个细胞/孔的密度接种于4孔板中，隔夜孵化后，胰腺癌细胞给予不同稀释浓度的豆蔻明，孵化48h，之后移出培养基，在每个孔板中加入100μl的hoechest33342，标准培养条件下孵化30分钟，之后用pbs洗涤细胞，用倒置荧光显微镜拍摄荧光图像在波长为460nm下的图像。

s5、胰腺癌细胞接种于6孔板并给予豆蔻明处理24h后收集细胞，用冰-冷pbs洗涤，并与膜联蛋白v-fitc和碘化丙啶在黑暗中孵育20分钟，细胞通过缓冲液重新悬浮，通过流式细胞仪检测。

s6、在ripa样品缓冲液中裂解细胞制备全细胞提取物，等量的细胞裂解液在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移到聚偏二氟乙烯膜，用bax、bcl-2、parp、细胞色素c和gapdh抗体作为一抗进行检测，抗兔igg，辣根过氧化物酶作为二抗，斌利用增强的化学发光系统检测信号。

为了进一步研究豆蔻明是否通过凋亡相关蛋白的作用诱导胰腺癌细胞凋亡，采用s6的步骤进行westernblotting验证，如图6所示，发现胰腺癌细胞系中促凋亡蛋白bax上调，而抗凋亡蛋白b-celllymphoma-2(bcl-2)下调。同时，凋亡可能涉及内源性或外源性途径，而且研究了cleavedcaspase-3和cytochromec的表达。这些凋亡信号蛋白在不同豆蔻明浓度处理24小时后显著增加(p<0.01)。结果表明，豆蔻明可调控重要促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达，从而诱导胰腺癌细胞凋亡。

虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。