一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法

一种具有
α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法
技术领域
1.本发明涉及植物药活性成分提取技术领域，具体涉及一种从桑叶中制备桑叶提取物的机械化学方法，该提取物具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性。


背景技术：

2.桑叶是桑科桑属落叶灌木桑树（morus alba l.）的干燥叶，叶片形状为宽卵形，叶片基部心脏形，顶端微尖，边缘有锯齿，叶脉密生白柔毛。老叶较厚暗绿色。嫩叶较薄，黄绿色。桑树又名“黄桑”、
ꢀ“
家桑”、“荆桑”、“铁扇子”等，主要生长在北温带，原产于中国，现于欧洲，韩国，日本等地均有种植。（王婷婷. 桑叶化学成分及生物活性研究进展［j］. 食品与药品, 2018(20): 390
‑
393.）。
3.桑树的根，桑白皮，叶，果实均可入药，是我国常见的传统中药。其中，桑叶既是蚕的主要食物，也是最早被记录于《神农本草经》中的一味中品药物，可以除寒热出汗，下气益阴，滋阴补血，止咳润燥，清肝明目（陆城宇. 不同产地桑叶氨基酸、核苷、生物碱成分的含量测定及多元统计分析［j］.中国现代应用药学, 2020(37): 1052
‑
1057），是中医常用的清热解毒之药。桑叶的主要活性成分有黄酮，黄酮苷，多酚，生物碱，多糖等（张倩, 张立华. 桑叶的化学成分及开发利用进展［j］.湖北农业科学, 2020(59): 16
‑
19．），其中，黄酮类及酚类化合物，以及生物碱类化合物为桑叶主要的有效成分。现代药理学研究表明，桑叶具有降血糖、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等作用，其中桑叶中的生物碱1
‑
脱氧野尻霉素(1
‑
deoxynojirimycin，dnj)的具有强效的α
‑
葡萄糖苷酶抑制作用，dnj可以通过与α
‑
糖苷酶结合，与体内二糖可逆性竞争，抑制其转化，达到降血糖作用（吴晓红, 桑叶生物碱测定方法研究进展［j］. 广州化工, 2020(48): 24
‑
26）。在不同的生长期，桑叶中的有效成分含量有明显变化，药理活性随之呈现不同强度。（张丽丽, 不同品种不同生长期桑叶中生物碱类与黄酮类 化学成分的积累动态分析评价［j］.中国中药杂志. 2014(39）:4822
‑
4828）。
4.dnj的分子结构式为：桑叶中dnj的提取方法主要有加热回流提取、超声辅助提取、酶发酵提取等。根据现有文献（cn102675188a），普通的溶剂和酸提取法中，dnj提取效率均较低。中国专利（cn101209284a）公布了一种从桑叶中加热回流提取生物碱的方法，dnj提取率在0.12%~0.13%之间，但溶剂消耗量大，提取时间长。中国专利（cn110141602a）公布了一种超声提取桑叶生物碱的方法，该方法简单高效，测得桑叶中总生物碱的含量87%~99.9%之间。中国专利（cn102675188a）公布了一种用纤维素酶发酵提取桑叶中dnj的方法，该方法提取效率在0.299%左右，绿色环保，但该工艺需要对桑叶进行发酵、酸化、以及进一步的纯化，大规模生
产需要进一步试验。
5.近年来，机械化学辅助提取技术已成功应用于植物中有效成分的提取（cn110066305a、cn110615854a）。此方法通过球磨珠在小罐中的高速旋转碰撞，使机械力作用于植物粉末表面，产生破壁效应，使植物成分中的有效成分得以高效释放。而球磨过程中的不同性质的助剂，也可以改变目标化合物的提取率，以期达到高效快速提取。目前，并未发现用机械化学辅助提取技术提高桑叶中dnj提取效率的方法。因此，本发明采用机械化学辅助对桑叶中dnj进行提取，以期在简单、环保的前提下，得到高dnj含量的桑叶提取物。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法，以简单、快速的方法提高提取物主要成分dnj 的得率。
7.所述的一种具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法，其特征在于包括以下步骤：1）采集桑叶，干燥后进行粉碎，过筛，得桑叶粉末备用；2）将步骤1）所得桑叶粉末进行机械化学处理，处理过程为：将所述桑叶粉末置于行星式球磨仪中与球磨助剂一并进行球磨，球磨转速为50~400 rpm，球磨时间5~20 min后，得到球磨处理后的桑叶粉末；3）将步骤2）所得球磨处理后的桑叶粉末与提取溶剂以1:30~50的料液比混合，料液比单位为 g/ml，然后置于30~40℃的水浴中超声提取5~20 min，超声提取结束后，冷却至室温，过滤，滤液经旋转蒸发除去溶剂后，得黄绿色桑叶提取物；4）将步骤3）所得桑叶提取物用甲醇复溶后，离心，取上层清液稀释，经0.22 μm ptfe有机滤膜过滤，采用超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱仪对提取物中的dnj进行定量分析，以dnj的含量计算粗提物的得率。
8.所述的一种具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法，其特征在于步骤2）中，行星式球磨仪内的球磨填充率在5%~21%，优选为10.5%。
9.所述的一种具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法，其特征在于步骤2）中，球磨转速为100~300 rpm，球磨时间为5~15 min。
10.所述的一种具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法，其特征在于步骤2）中，所使用的球磨助剂为柠檬酸；球磨助剂的质量是桑叶粉末质量的3~12%，优选为10%。
11.所述的一种具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法，其特征在于步骤3）中，提取溶剂为乙酸乙酯、甲醇、乙醇、石油醚、水中的任意一种，或者为乙醇和水的混合溶剂，优选为质量分数70~80%的乙醇水溶液；料液比为1 : 40，料液比单位为g/ml，超声提取的温度为35℃，超声提取的时间为10 min。
12.所述的一种具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法，其特征在于步骤3）中，对得到的黄绿色桑叶提取物进行分析检测，具体过程为：桑叶提取物用甲醇复溶后，离心，取上层清液稀释，经0.22 μm ptfe有机滤膜过滤，滤液通过超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱仪进行检测，对提取物中的dnj进行定量分析，以dnj的含量计算粗提物的得率。
13.所述的一种具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性桑叶提取物的机械化学提取方法，其特征在于步骤4）中，用超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱仪进行分析的过程中，液相条件为：色谱柱为waters acquity uplc beh hilic（100
×
2.1 mm，1.7 μm）；流速0.2 ml/min；进样量1.0 μl；柱温30℃；流动相a为0.1wt%甲酸水溶液，流动相b为乙腈；梯度洗脱条件：0～1 min，80~61% b；1～4.5 min，61% b；4.5～4.6 min，61%～80% b；4.6～13 min，80% b。质谱条件为：电喷雾离子源（正离子模式 esi+）；喷雾气体：氮气；离子源温度：150℃；检测方式：多反应监测模式（mrm）；锥孔电压：56 v；毛细管电压：2.97 kv；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：650 l/h；定性离子对：164.24 > 145.99；定量离子对：164.24 > 68.80。
14.本发明具有如下优点：1）桑叶在我国资源丰富，更是自然界中含有大量dnj的植物之一。从易栽培的桑叶中提取高dnj含量的桑叶提取物，有助于桑叶在降血糖方面的药用价值的开发，提高桑叶资源综合利用。
15.2）本发明首次采用机械化学辅助超声提取桑叶中dnj成分，优选了机械化学参数，且与传统超声法提取桑叶中dnj相比，产率得到了明显的提高。
16.3）对桑叶提取物的α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性进行比较评价，得到具有较高抑制活性的桑叶提取物。
17.4）本发明工艺简单，绿色环保，成本低廉。
附图说明
18.图1为桑叶提取物α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性试验结果图。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0020] 1、本发明涉及到的各仪器及药品规格如下：xs205 dualrange分析天平（mettler toledo，瑞士）；kh5200de超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；waters acquity uplc超高效液相色谱仪（waters，美国）；waters xevo tq
‑
xs三重四级杆质谱仪（waters，美国）；barnstead tii超纯水系统（thermo scientific，美国）；r
‑
215旋转蒸发仪（buchi，瑞士）；酶标仪（tecan，瑞士）。
[0021]
色谱级乙腈和乙醇购自德国默克股份两合公司，色谱级甲酸和1
‑
脱氧野尻霉素（dnj）购自上海阿拉丁试剂有限公司，阿卡波糖和对硝基苯基
‑
α
‑
d
‑
吡喃葡萄糖苷（pnpg）购自上海源叶生物科技有限公司；其余试剂均为分析级。
[0022]
实验所用样品桑叶采自浙江德清。
[0023]
2、以下实施例中所述桑叶中dnj含量的测定，采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行分析。
[0024]
用超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱仪进行分析的过程中，液相条件为：色谱柱为waters acquity uplc beh hilic（100
×
2.1 mm，1.7 μm）；流速0.2 ml/min；进样量1.0 μl；柱温30℃；流动相a为0.1wt%甲酸水溶液，流动相b为乙腈；梯度洗脱条件：0～1 min，80~61% b；1～4.5 min，61% b；4.5～4.6 min，61%～80% b；4.6～13 min，80% b。质谱条件为：电喷雾离子源（正离子模式 esi+）；喷雾气体：氮气；离子源温度：150℃；检测方式：
多反应监测模式（mrm）；锥孔电压：56 v；毛细管电压：2.97 kv；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：650 l/h；定性离子对：164.24 > 145.99；定量离子对：164.24 > 68.80。
[0025]
桑叶中dnj含量是以1
‑
脱氧野尻霉素（≥98%）作为对照品，采用外标法进行计算。以峰面积y为纵坐标，以上述对照品的质量浓度x（ppb）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程如下：y = 393.19x + 3009.1，r2=0.9990桑叶中dnj得率的计算公式为：得率%(mg/g)=[dnj质量(mg)/桑叶原料质量(g)]*100%。
[0026]
实施例1：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，加入直径10 mm的不锈钢球磨珠5个（球磨填充率5.2%），球磨时间为10 min，球磨转速为200 rpm。
[0027]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，步骤为“加入4 ml 75%乙醇水溶液混合，然后置于35℃水浴中超声提取10 min，过滤，滤液经旋转蒸发除去溶剂后，得黄绿色桑叶提取物；用4 ml甲醇复溶后，离心，取上层100 μl清液，与1 ml甲醇混合稀释，经0.22 μm ptfe有机滤膜过滤，备用。将过滤后的提取液，采用uplc
‑
ms/ms（即超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱仪）对其中的dnj进行定量分析”。
[0028]
经计算，1
‑
脱氧野尻霉素的得率为86%（mg/g）。
[0029]
实施例2：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10 min，球磨转速为200 rpm。
[0030]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。最终经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为95%（mg/g）。
[0031]
实施例3：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，加入直径10 mm的不锈钢球磨珠15个（球磨填充率15.7%），球磨时间为10 min，球磨转速为200 rpm。
[0032]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为82%（mg/g）。
[0033]
实施例4：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，加入直径10 mm的不锈钢球磨珠20个（球磨填充率20.9%），球磨时间为10 min，球磨转速为200 rpm。
[0034]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素（dnj）的得率为68%（mg/g）。
[0035]
对比实施例1~4可知，随着球磨填充率的升高，机械作用力增大，破壁效果加强，提取得率增大；但当球磨珠数量高于10个时，得率不再提高，且随球磨珠的数量增加而降低，主要原因在于过高的球磨填充率，使球磨珠的运动受到限制，减少了机械作用，从而降低得
率。
[0036]
实施例5：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为5 min，球磨转速为200 rpm。
[0037]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为81%（mg/g）。
[0038]
实施例6：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为15 min，球磨转速为200 rpm。
[0039]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为66%（mg/g）。
[0040]
对比实施例2、5和6可知，适当增加球磨时间，蓄积球磨罐内能量，可以提高dnj得率。但当球磨时间增加至15 min时，得率不再提高，呈现下降趋势，主要原因在于较长的球磨时间产生较高的能量，使球磨罐内热量集中，破坏目标成分，使得率下降。
[0041]
实施例7：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为100 rpm。
[0042]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为73%（mg/g）。
[0043]
实施例8：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为300 rpm。
[0044]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为74%（mg/g）。
[0045]
对比实施例2、7和8可知，当转速由100 rpm增至200 rpm，机械作用力增强，破壁效果提高，得率提高。但当转速达到300 rpm时，得率呈现下降趋势，主要原因在于过高的转速产生高能量，破坏了有效成分，使得率下降。
[0046]
实施例9：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。
[0047]
称取桑叶粉末20 mg，加入4 ml 75%乙醇水溶液混合，然后置于35℃水浴中超声提取10 min，冷却至室温，过滤，滤液经旋转蒸发除去溶剂后，得黄绿色桑叶提取物，该提取物用甲醇复溶后，离心，取上层清液稀释，经0.22 μm ptfe有机滤膜过滤，采用uplc
‑
ms/ms对提取物中的dnj进行定量分析。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为66%（mg/g）。
[0048]
对比实施例2和实施例9可知，在同样提取条件下，经球磨操作之后的桑叶粉末比
简单粉碎的桑叶粉末，dnj得率更高。主要原因在于合适的球磨机械力作用，增加了有效成分的释放，得率提高。
[0049]
实施例10：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，柠檬酸10 mg，用量为桑叶粉末质量的3.3%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0050]
称取球磨之后的桑叶粉末20.6 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为98%（mg/g）。
[0051]
实施例11：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，酒石酸10 mg，用量为桑叶粉末质量的3.3%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0052]
称取球磨之后的桑叶粉末20.6 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为53%（mg/g）。
[0053]
实施例12：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，中性氧化铝10 mg，用量为桑叶粉末质量的3.3%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0054]
称取球磨之后的桑叶粉末20.6 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为97%（mg/g）。
[0055]
实施例13：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，环糊精10 mg，用量为桑叶粉末质量的3.3%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0056]
称取球磨之后的桑叶粉末20.6 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为97%（mg/g）。
[0057]
实施例14：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，柠檬酸30 mg，用量为桑叶粉末质量的10%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0058]
称取球磨之后的桑叶粉末22 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为150%（mg/g）。
[0059]
实施例15：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80
目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，中性氧化铝30 mg，用量为桑叶粉末质量的10%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0060]
称取球磨之后的桑叶粉末22 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为87%（mg/g）。
[0061]
实施例16：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，环糊精30 mg，用量为桑叶粉末质量的10%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0062]
称取球磨之后的桑叶粉末22 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为60%（mg/g）。
[0063]
实施例17：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，环糊精5 mg，用量为桑叶粉末质量的1.7%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0064]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为70%（mg/g）。
[0065]
实施例18：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，中性氧化铝5 mg，用量为桑叶粉末质量的1.7%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0066]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为57%（mg/g）。
[0067]
实施例19：将收集于2020年3月的桑叶于
‑
80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述桑叶粉末0.30 g，柠檬酸50 mg，用量为桑叶粉末质量的17%。加入直径10 mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率10.5%），球磨时间为10min，球磨转速为200 rpm。
[0068]
称取球磨之后的桑叶粉末20 mg，然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为68%（mg/g）。
[0069]
实施例20：将收集于2020年3月的桑叶于
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80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎，过80目筛，得到桑叶粉末。称取桑叶粉末20 mg，加入2 mg柠檬酸固体，用量为桑叶粉末质量的10%。混合均匀。然后依次进行溶剂提取、定量分析操作，操作步骤重复实施例1。经计算1
‑
脱氧野尻霉素的得率为86%（mg/g）。
[0070]
机械化学技术应用研磨、挤压、剪切、摩擦等机械力作用于样品，在短时间内诱发
样品内部理化性质的变化。对比实施例1~9可知，不同的球磨时间、球磨转速、填充率都对dnj得率有影响。随球磨时间和球磨转速、填充率的增加，dnj得率先增加，后减小。可能的原因是，在一定机械力作用下，有利于细胞壁的破碎，释放有效物质；但当球磨时间、转速、填充率过高时，由于机械力过大，破坏了有效成分，从而使dnj提取率呈下降趋势。对比实施例10~15可知，不同的助剂类型和助剂含量也对dnj得率有影响。在加入柠檬酸、中性氧化铝、环糊精助剂之后，不同的助剂类型与助剂含量对dnj得率的影响相差比较大。其中柠檬酸助剂在含量10%时使dnj得率提升最大。推测是由于dnj呈碱性，在高能机械力的作用下，与酸性助剂反应生成水溶性物质，从而提高了提取率。而继续提升柠檬酸含量，则可能由于酸度过高，使dnj结构发生改变，降低得率。酒石酸同样为有机酸，但用量为3.3%的酒石酸并未使dnj得率升高，反而降低，可能是由于酒石酸较于柠檬酸具有更强的酸性，从而降低了dnj得率。
[0071]
实施例21 桑叶提取物α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性试验：取实施例14所得桑叶提取物，以75%乙醇水溶液作为溶剂，配置一系列提取物浓度分别为0.07 mg/ml、0.15 mg/ml、0.31 mg/ml、0.62mg/ml、0.82 mg/ml、1.10 mg/ml的样品溶液。
[0072]
对桑叶提取物进行α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性分析时，平行进行如下四组实验：样品组：用移液枪吸取20 μl上述配制的样品溶液于96孔板，加入20 μl活性为0.219 u/ml的α
‑
葡萄糖苷酶溶液（α
‑
葡萄糖苷酶加入pbs缓冲液中配制而成），加入40 μl pbs溶液，在37℃孵育10 min，再向孔中加入40 μl浓度为2.5mm的pnpg底物溶液（pnpg底物加入pbs缓冲液中配制而成），继续在37℃反应30 min，最后加入80 μl碳酸钠溶液终止反应。在405 nm处检测吸光度。
[0073]
阳性对照组：以阿卡波糖作为对照药剂，以75%乙醇水溶液作为溶剂，配制一系列不同阿卡波糖浓度的阳性对照溶液。用移液枪吸取20 μl上述配制的阳性对照溶液于96孔板，加入20 μl活性为0.219 u/ml的α
‑
葡萄糖苷酶溶液（α
‑
葡萄糖苷酶加入pbs缓冲液中配制而成），加入40 μl pbs溶液，在37℃孵育10 min，再向孔中加入40 μl浓度为2.5mm的pnpg底物溶液（pnpg底物加入pbs缓冲液中配制而成），继续在37℃反应30 min，最后加入80 μl碳酸钠溶液终止反应。在405 nm处检测吸光度。
[0074]
空白组：用移液枪吸取20 μl的pbs缓冲液于96孔板，加入20 μl活性为0.219 u/ml的α
‑
葡萄糖苷酶溶液（α
‑
葡萄糖苷酶加入pbs缓冲液中配制而成），加入40 μl pbs溶液，在37℃孵育10 min，再向孔中加入40 μl浓度为2.5mm的pnpg底物溶液（pnpg底物加入pbs缓冲液中配制而成），继续在37℃反应30 min，最后加入80 μl碳酸钠溶液终止反应。在405 nm处检测吸光度。
[0075]
背景组：用移液枪吸取20 μl上述配制的样品溶液于96孔板，加入20 μl的pbs溶液后，再加入40 μl pbs溶液，在37℃孵育10 min，再向孔中加入40 μl浓度为2.5mm的pnpg底物溶液（pnpg底物加入pbs缓冲液中配制而成），继续在37℃反应30 min，最后加入80 μl碳酸钠溶液终止反应。在405 nm处检测吸光度。
[0076]
上述样品组、阳性对照组、空白组以及背景组中反应液的配制过程中，使用的pbs缓冲液浓度为0.1 m，碳酸钠溶液浓度为1 m。
[0077]
所述桑叶中α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性试验，平行进行的四组实验中，a1为样品组或
阳性对照组测得的吸光度结果；a0为空白组测得的吸光度结果；a2为背景组测得的吸光度结果。抑制活性计算公式如下：α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性（%）=[1
‑
（a1‑
a2）/a0]*100%。
[0078]
按照上述α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性试验过程，桑叶提取物以及阿卡波糖对照药剂对α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性结果对比图见图1。
[0079]
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。