特异性靶向UHRF1的小分子抑制剂UF146在急性髓系白血病中的应用

特异性靶向uhrf1的小分子抑制剂uf146在急性髓系白血病中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体地，涉及一种靶向uhrf1的小分子抑制剂uf146在急性髓系白血病中的应用与治疗。


背景技术：

2.uhrf1(ubiquitin-like containing phd and ring finger domains 1，uhrf1)是一种重要的表观遗传识别子，在各类疾病模型中都有广泛的研究，在多种实体瘤中可以观察到uhrf1高表达，提示uhrf1可能是一个原癌基因，参与胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和膀胱癌等多种恶性肿瘤疾病的发生和发展。
3.由于uhrf1在多种肿瘤中高表达并扮演致癌基因的功能，其在各类肿瘤疾病的发生发展过程中扮演着重要的作用，因此从临床治疗角度来看，uhrf1可以成为一种极具前景的治疗靶点。uhrf1通过对相关通路基因转录或者蛋白表达、活性等方面的调控，可以达到缓解或者治疗肿瘤的目的。因此筛选开发新型有效的uhrf1抑制剂就显得极为重要，具有重大的临床意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种针对uhrf1分子靶点的新型抑制剂。
5.在本发明的第一方面，提供了一种式a所示的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐的用途，用于制备一药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于(a)抑制表观遗传因子uhrf1；(b)治疗uhrf1相关的疾病；(c)抑制肿瘤细胞的体外增殖。
[0006][0007]
式中，
[0008]
r1选自卤素、c
1-c3烷基或c
1-c3卤代烷基；
[0009]
r2选自h、c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基；
[0010]
r3选自h、c
1-c6烷基、c
3-c6环烷基。
[0011]
在另一优选例中，所述的式a化合物为式1所示的化合物：
[0012][0013]
在另一优选例中，所述的uhrf1为人uhrf1。
[0014]
在另一优选例中，所述的式1所示的化合物特异性抑制uhrf1。
[0015]
在另一优选例中，所述的式1所示的化合物特异性靶向uhrf1的sra结构域。
[0016]
在另一优选例中，所述肿瘤选自：血液肿瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肠癌、肾癌。
[0017]
在另一优选例中，所述肿瘤细胞为血液肿瘤细胞，优选为白血病细胞。
[0018]
在另一优选例中，所述白血病细胞包括：急性髓系白血病细胞、急性淋巴细胞白血病(all)细胞、慢性髓系白血病(cml)细胞。
[0019]
在另一优选例中，所述急性髓系白血病细胞选自：kasumi-1、thp-1、nb4、k562、skm-1、hl-60、jurkat、oci-aml3、molm13、nomo-1和mv4-11细胞。
[0020]
在另一优选例中，所述的式a所示的化合物抑制uhrf1的sra结构域介导的dna甲基化。
[0021]
在另一优选例中，所述的式a所示的化合物靶向肿瘤细胞中uhrf1高表达的肿瘤疾病特征。
[0022]
在另一优选例中，所述的式a所示的化合物抑制急性髓系白血病细胞的增殖。
[0023]
在另一优选例中，所述急性髓系白血病细胞选自下组：kasumi-1、thp-1、nb4、k562、skm-1、hl-60、jurkat、oci-aml3、molm13、nomo-1和mv4-11细胞。
[0024]
在另一优选例中，所述的与uhrf1相关的疾病选自下组：血液肿瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肠癌、肾癌。
[0025]
在另一优选例中，所述的血液肿瘤选自下组：急性髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、急性淋巴细胞白血病(all)、慢性髓系白血病(cml)。
[0026]
在另一优选例中，所述药物组合物中含有0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的式a化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，按组合物的总重量计。
[0027]
在另一优选例中，所述的药物组合物或制剂还可含有其他药物活性成分或药学上可接受的载体。
[0028]
在本发明的第二方面，提供了一种式a所示的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
[0029][0030]
式中，
[0031]
r1选自卤素、c
1-c3烷基或c
1-c3卤代烷基；
[0032]
r2选自h、c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基；
[0033]
r3选自h、c
1-c6烷基、c
3-c6环烷基。
[0034]
在另一优选例中，所述的式a化合物为式1所示的化合物：
[0035][0036]
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有(a)活性成分，所述活性成分包括如本发明的第二方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，及其光学异构体或其药学上可接受的盐；
[0037]
以及(b)药学上可接受的载体。
[0038]
在另一优选例中，在所述的药物组合物中，组分(a)的总量为0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％，按组合物的总重量计。
[0039]
在另一优选例中，所述的药物组合物或制剂还可含有其他药物活性成分或药学上可接受的载体。
[0040]
在另一优选例中，所述其他药物活性成分选自下组：尿嘧啶衍生物nsc232003、茴香霉素(anisomycin)、姜黄素(curcumin)、二氢青蒿素(dihydroartemisinin)、大黄素(emodin)、因子喹啉铜抑制剂(factor quinolinone inhibitor 1，fqi1)、扁柏素(hinokitiol)、萘茜(naphthazarin)、托林2(torin 2)、紫草醌(shikonin)、木犀草素(luteolin)和米托蒽醌(mitoxantrone)。
[0041]
在本发明的第四方面，提供了一种药盒，所述的药盒包括：
[0042]
(1)第一容器，以及位于所述容器内的第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有如本发明的第二方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，及其光学异构体或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体；
[0043]
以及(2)任选的使用说明书。
[0044]
在本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性的抑制uhrf1蛋白的方法，将uhrf1与本发明的第二方面所述的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐进行接触，从而特异性抑制uhrf1蛋白的活性。
[0045]
在本发明的第六方面，提供了一种本发明的第二方面所述的式a化合物或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，或如本发明的第三方面所述的药物组合物，或如本发明的第四方面所述的药盒在制备用于预防/治疗与uhrf1蛋白相关的疾病和/或uhrf1蛋白靶向抑制剂的药物中的用途。
[0046]
在本发明的第七方面，提供了一种非治疗性的体外抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括步骤：将肿瘤细胞与如本发明的第二方面所述的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐进行接触，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
[0047]
在另一优选例中，所述肿瘤选自：血液肿瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肠癌、肾癌。
[0048]
在另一优选例中，所述肿瘤细胞为血液肿瘤细胞，优选为白血病细胞。
[0049]
在另一优选例中，所述白血病细胞选自：kasumi-1、thp-1、nb4、k562、skm-1、hl-60、jurkat、oci-aml3、molm13、nomo-1和mv4-11细胞。
[0050]
在本发明的第八方面，提供了一种抑制uhrf1蛋白的方法，包括步骤：给需要的对象施用如本发明的第二方面所述的式a化合物或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐。
[0051]
在本发明的第九方面，提供了一种治疗白血病的方法，包括步骤：给需要的对象施用如本发明的第二方面所述的式a化合物或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，或如本发明的第三方面所述的药物组合物，或如本发明的第四方面所述的药盒。
[0052]
在另一优选例中，所述的白血病选自下组：急性髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、急性淋巴细胞白血病(all)、慢性髓系白血病(cml)。
[0053]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0054]
图1显示了uhrf1的基因结构示意图。
[0055]
图2显示了uf146特异性抑制uhrf1与dnmt1相互作用。其中，(a)uf146的结构；(b)急性髓系白血病细胞kasumi-1在uf146处理24h和48h时的mtt实验结果；(c)uf146处理kasumi-1细胞24h后，pla实验分析uhrf1与dnmt1的结合效率；(d)uf146处理kasumi-1细胞24h后，pla实验统计分析；其中，dmso为对照组，dapi为细胞核dna荧光染色图，merge为uhrf1与dnmt1相互作用荧光点与细胞核染色重叠图，比例尺为10μm。
[0056]
图3显示了uf146特异性靶向uhrf1与dnmt1相互作用。其中，(a)uf146处理kasumi-1细胞24h后，ip实验分析uhrf1与dnmt1的结合效率；(b)uf146处理kasumi-1细胞后，dna甲基化实验分析uhrf1靶基因mxd4启动子区域dna甲基化变化；(c)uf146处理kasumi-1细胞后，q-pcr分析uhrf1靶基因mxd4表达变化；其中，dmso为对照组，ib为蛋白免疫印迹实验，cpg为dna甲基化水平。
[0057]
图4显示uf146对正常人造血干细胞影响较小。其中，(a)不同浓度uf146处理人源cd34
+
细胞48小时后，mtt检测细胞增殖影响；(b)2.5μm uf146处理人源cd34
+
细胞，克隆形成
能力实验检测uf146对cd34
+
细胞自我更新和分化的影响；其中，bfu-e、cfu-m、cfu-g、cfu-gm、cfu-gemm分别为早期红系造血祖细胞集落、巨噬细胞集落、粒细胞集落、巨噬-粒细胞集落和混合细胞集落。
[0058]
图5显示了uf146调控细胞增殖和细胞周期通路影响aml细胞存活。其中，(a)不同浓度uf146处理kasumi-1细胞后，流式分析uf146对kasumi-1细胞凋亡的影响；(b)不同浓度uf146处理kasumi-1细胞后，流式分析uf146对kasumi-1细胞周期的影响；其中，g0/g1、s、g2/m分别为细胞周期不同分裂时期。其中，annexin-v为细胞发生凋亡时表达在细胞膜上的信号分子。
[0059]
图6显示了uf146显著抑制aml细胞的增殖。其中，不同浓度uf146处理不同aml细胞系48h，mtt检测uf146对不同细胞系的增殖影响及对不同aml细胞的敏感性。
[0060]
图7显示了uf146显著抑制aml病人细胞的增殖。其中，(a)2.5μm uf146处理aml原代细胞48h后，cfu实验分析aml原代细胞克隆形态大小和数目变化；(b)20μm uf146处理不同aml原代细胞24h后，瑞士-吉姆萨分析uf146对病人原代细胞形态的影响；(c)20μm uf146处理aml原代细胞不同时间后，mtt检测uf146对aml原代细胞的增殖影响；其中，cfu为菌落形成单位。
[0061]
图8显示了uf146显著延缓小鼠急性髓系白血病的发展。其中，(a-b)取ae9a和mll-af9原代细胞移植的发病受体小鼠脾细胞进行二次移植，uf146药物治疗后的ae9a和mll-af9受体小鼠生存期统计分析；(c-d)uf146给药过程中，对ae9a和mll-af9移植的受体小鼠进行体重分析。
[0062]
图9显示了uf146显著延缓小鼠急性髓系白血病的发展。其中，(a)取对照组和给药组受体小鼠进行外周血随访，血细胞计数分析小鼠外周血细胞wbc、rbc、plt和hgb变化；(b)取对照组和给药组受体小鼠进行外周血血涂片，瑞士-吉姆萨染色分析白血病细胞浸润情况；(c)对对照组和给药组受体小鼠进行外周血随访，流式分析小鼠外周血细胞gfp
+
gr-1-比例变化。
[0063]
图10显示了uf146对病人来源的aml异种移植受体小鼠具有显著治疗作用。其中，(a)流式分析aml病人骨髓来源的aml细胞hcd34
+
比例；(b)aml-pdx移植模型示意图；(a)取aml病人骨髓来源细胞进行pdx异种移植，uf146药物治疗后的受体小鼠生存期统计分析；(e)取对照组和给药组受体小鼠骨髓细胞和脾细胞进行甩片，瑞士染色分析aml病人细胞浸润情况。
[0064]
图11显示了uf146对病人来源的aml异种移植受体小鼠具有显著治疗作用。其中，(a-b)收集和分离pdx移植对照组和给药组受体小鼠骨髓细胞，流式染色和分析受体小鼠骨髓中aml病人细胞hcd45
+
mcd45
+
和hcd45
+
hcd34
+
比例；(c)收集pdx移植对照组和给药组受体小鼠脾脏进行固定，he染色分析uf146治疗后小鼠脾脏病理变化。
[0065]
以上各图中，***p《0.001，**p《0.01，*p《0.05。
具体实施方式
[0066]
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现一类结构如式a所示的酰胺类化合物可以显著地抑制uhrf1的活性。本发明的化合物，特异性抑制uhrf1 sra结构域活性，最终影响sra结构域与dnmt1的相互作用。此外，还出乎意料发现该化合物对白血病细胞具有
显著的抑制效果。小鼠实验中表明，所述的式a化合物对于急性髓系白血病具有显著治疗作用。本发明的式a化合物还可用于治疗与uhrf1靶点相关的胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等疾病。在此基础上，完成了本发明。
[0067]
术语
[0068]
术语“c
1-c3烷基”指具有1-3个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基或类似基团。
[0069]
术语“c
1-c6烷基”指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、或类似基团。
[0070]
术语“c
1-c3卤代烷基”指具有1-3个碳原子的卤素取代的直链或支链烷基，例如卤代甲基、卤代乙基、卤代丙基、卤代异丙基或类似基团。
[0071]
术语“c
3-c6环烷基”指具有3-6个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、或类似基团。
[0072]
术语“c
3-c8环烷基”指具有3-8个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、或类似基团。
[0073]
术语“卤素”指f、cl、br和i。
[0074]
活性化合物
[0075]
如本文所用，“本发明化合物”、或“式a化合物”、“本发明的uhrf1抑制剂”可互换使用，指式a所示的化合物、或其消旋体、对应异构体、或其药学上可接受的盐。
[0076]
应理解，该术语还包括上述组分的混合物。
[0077][0078]
式中，各基团的定义如上所述。
[0079]
在本发明中，还包括式a化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
[0080]
本发明的式a化合物可采用现有技术中本领域技术人员熟知的方法进行制备，对各个步骤的反应参数没有特别限制。此外，本发明的典型化合物也可通过市售方式获得。
[0081]
如本文所用，在式a化合物中，如果存在手性碳原子，则手性碳原子可以为r构型，也可以为s构型，或二者的混合物。
[0082]
在另一优选例中，所述的式a化合物为式1所示的化合物(即本发明中的uf146)或其药学上可接受的盐。
[0083]
本发明中的式a或式i化合物结构简单，可以容易地用本领域人员熟知的化学方法
合成。
[0084][0085]
uhrf1
[0086]
uhrf1(ubiquitin-like containing phd and ring finger domains 1，含phd和ring指结构域的遍在蛋白1)是一种重要的表观遗传识别子，1998年由日本科学家首次在小鼠细胞核中被鉴定出来，其主要存在于细胞周期s期并与细胞增殖具有重要联系，由于uhrf1蛋白分子大小为95kd，因而被命名为np95。随后在2000年，法国科学家在研究人类细胞中拓扑异构酶ⅱ的启动子区域结合蛋白时，发现uhrf1能够结合在它的反向ccaat框上并参与基因表达的重要调控，所以又将它命名为icbp90(inverted ccaat box binding protein of 90kd)。
[0087]
uhrf1位于人19号染色体上，含有793个氨基酸，主要包含五个重要的结构域(图1)：ubl结构域(ubiqiutin-like domain)、tdd结构域(tandem tudor domain)、phd结构域(plant homeo domain)、sra结构域(set and ring associated)和ring结构域(really interesting new gene)，它们分别承担了uhrf1的表观遗传功能，其中sra结构域在ttd和phd等的辅助下，一方面识别复制产生的半甲基化dna，另一方面招募dnmt1至复制叉进而维持dna甲基化；ubl结构域具有蛋白酶体水解途径；tdd结构域具有识别h3k9me3或h3r2的功能；phd结构域则识别没发生修饰的组蛋白h3的n端；ring结构域对组蛋白h3k23或h3k18表现出e3连接酶活性，可以介导蛋白质降解。综上，uhrf1表达具有细胞周期特异性的特点，并且与细胞增殖能力具有重要关系，细胞增殖能力越强其表达量越高，其在各种肿瘤和免疫系统中均发挥着重要作用。
[0088]
uhrf1在肿瘤发生中的调控作用
[0089]
目前，uhrf1在各类疾病模型中都有广泛的研究，在多种实体瘤中可以观察到uhrf1高表达，提示uhrf1可能是一个原癌基因，参与胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和膀胱癌等多种恶性肿瘤疾病的发生和发展。在肺癌中，利用免疫组织化学染色对数百例肺癌组织进行分析发现在非小细胞肺癌中uhrf1表达明显升高，并且uhrf1表达量与非小细胞肺癌病人预后具有显著相关性。在肝癌中，有研究报道在各种病因如基因组不稳定、tp53突变和tp53介导的衰老因素等导致的肝癌中，uhrf1表达升高并且着这种高表达被认为是癌细胞dna甲基化主要因素，因而uhrf1常被描述为原癌基因。在另外一项研究中，对处在癌症的二期和三期的160例肝癌病人细胞分析，发现uhrf1 mrna水平表达同样异常较高。此外，在胃癌、结肠癌、乳腺癌中，uhrf1表达量也比正常细胞升高，并对肿瘤细胞的侵袭和肿瘤转移具有重要功能。
[0090]
在细胞内uhrf1作为一种衔接蛋白，在维持dna甲基化和组蛋白修饰的基因激活和抑制中起着重要作用。e2f转录因子(e2f1和e2f8)能直接与uhrf1启动子区域结合并促进其
基因表达，而h3k9甲基转移酶(g9a)和阴阳转录因子1(yy1)作为上游负调节因子可下调uhrf1的表达。研究表明，uhrf1依赖性组蛋白h3泛素化在爪蟾dna甲基化维持中具有重要作用。uhrf1是一种细胞周期调节蛋白，uhrf1缺失能通过促进细胞周期相关蛋白(例如p21和p27)的表达而抑制不同癌症的进展，从而导致细胞周期停滞。此外，uhrf1还参与细胞dna损伤修复反应，说明uhrf1在维持细胞基因组稳定性方面起着关键作用。最近的研究表明，在细胞周期s期，ser674磷酸化的uhrf1能与dna损伤介质brca1的brct结构域结合并被brca1招募到dna断裂双链(dsb)中参与dna损伤修复反应。
[0091]
白血病和急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia，aml)
[0092]
白血病是一类因血液中造血干/祖细胞异常变化引起的恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞由于具有异常快速增殖、各系分化障碍、凋亡变化和周期改变等特点，导致其在机体内各脏器和外周血液中大量累积和浸润，致使机体正常的器官和组织受损，使得维持机体生命活动的正常造血功能和免疫调节等生理过程严重失调。白血病的临床表现为发热、贫血、免疫力低下和脾脏、淋巴结等脏器肿大等特征，同时患者出现血液粘稠并伴随外周血白细胞显著升高和红细胞、血红蛋白和血小板明显降低等特点。
[0093]
正常造血干细胞具有自我更新和分化成各系的潜能，根据其不同分化路径可以将白血病分成髓系白血病、淋巴系白血病和红白血病等。同时，由于不同白血病患者发病的程度不同，白血病又可分为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，aml)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)和慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，cml)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoblastic leukemia，cll)。aml是一种造血干/祖细胞异常的克隆性疾病，其特征是骨髓中未成熟髓系细胞增多。aml是成年人中最常见的急性白血病，发病率为2.7/10万，据2011-2013年美国癌症统计报道，男性和女性在其一生中被诊断为白血病概率约为1.6％，确诊时的中位数年龄为68岁，其中55.54％的患者在65岁或65岁以上。尽管亚型和其它危险因素不同，aml病人5年生存率为62.7％。近年来随着人口老龄化加剧，在过去的10年中aml的发病率以每年2.2％的速度上升，因此aml的研究、诊断和治疗日益成为越来越重要的科学热点。
[0094]
之前的研究发现uhrf1介导的dna甲基化在非aml的白血病中具有重要功能。和正常人相比，白血病患者uhrf1的表达量高很多。基于前期的小鼠模型等实验，首次发现uhrf1介导的dna甲基化在aml中同样具有重要功能。因此，寻找能够特异性地抑制uhrf1蛋白的活性或功能的化合物，可以作为白血病(特别是aml)的潜在治疗剂。
[0095]
用途
[0096]
本发明还提供了一种抑制uhrf1的方法，以及治疗与uhrf1相关的疾病的方法。
[0097]
本发明的上述式a化合物可用于抑制uhrf1，进而预防或治疗与uhrf1相关的疾病。
[0098]
本发明中，与uhrf1相关的疾病的例子包括(但不限于)：血癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和膀胱癌等多种恶性肿瘤疾病。
[0099]
在一实施例中，本发明提供了一种体外非治疗性的抑制uhrf1活性的方法，包括：例如在体外培养体系中，将uhrf1或表达所述蛋白的细胞与式a化合物(或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐)进行接触，从而抑制瞬时受体电位通道蛋白的活性。
[0100]
本发明还提供了一种uhrf1的方法，该方法可以是治疗性的或非治疗性的。通常，
该方法包括步骤：给需要的对象施用本发明的式a化合物。
[0101]
优选地，所述对象包括人和非人哺乳动物(啮齿动物、兔、猴、家畜、狗、猫等)。
[0102]
组合物和施用方法
[0103]
本发明提供了一种用于抑制uhrf1活性的组合物。所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、膳食补充剂、饮料组合物等。
[0104]
在本发明中，所述的药物组合物可直接用于疾病治疗，例如，用于白血病的治疗。
[0105]
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。
[0106]
以药物组合物为例，本发明的组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。
[0107]
此外，本发明的uhrf1抑制剂还可与其他治疗剂一起使用。
[0108]
对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、雾化吸入等。
[0109]
本发明的主要优点包括：
[0110]
(1)本发明的式a化合物对uhrf1介导的dna甲基化在细胞中的调控作用具有显著的抑制效果。
[0111]
(2)本发明首次发现uhrf1在aml细胞中具有重要功能，并且式a化合物对白血病细胞(尤其是aml细胞)治疗具有显著的抑制效果。
[0112]
(3)本发明的式a化合物对于与uhrf1靶点相关的多种疾病的治疗具有良好的开发应用前景。
[0113]
(4)本发明发现式a化合物对正常细胞(如造血干细胞)毒副作用影响较小。
[0114]
(5)本发明首次分析了式a化合物参与急性髓系白血病的调控机制。
[0115]
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0116]
实验方法与步骤
[0117]
1.1流式染色及凋亡、周期检测
[0118]
本研究所涉及到的流式分析分别为小鼠给药移植外周血细胞流式染色分析，细胞凋亡和周期分析，小鼠外周血细胞染色和细胞凋亡数据采用flowjo version 10.0统计，细胞周期数据采用modfit lt 32分析。流式分析方法步骤如下：
[0119]
(1)小鼠外周血细胞流式染色分析：取抗凝剂0.5m edta作为稀释液1：1混匀小鼠外周血，小鼠外周血来自尾静脉，经全血细胞计数仪计数后，剩下的外周血细胞中加入500μl红细胞裂解液，裂解1-2分钟后加入1ml pbs终止裂解，1500rpm离心3分钟弃上清，然后加入1ml pbs到流式管1500rpm离心3分钟弃上清洗一遍。以1:200比例加入gr-1-pe抗体至流
式管室温染色15min以上。加入1ml pbs到流式管1500rpm离心3分钟弃上清，1:100加入dapi避光储存，流式细胞仪上机检测；
[0120]
(2)凋亡分析：收集需要分析的实验细胞如uf146给药的kasumi-1和thp-1，调整细胞浓度至3
×
106至1
×
107个/ml，取200μl-300μl至流式管，加入1ml pbs洗一遍，加入100μl配好的1
×
apoptosis binding buffer(ddh2o稀释10
×
apoptosis binding buffer)。以1:200比例加入pi染色液和1:100比例加入annexin-v抗体至流式管室温染色15min以上。加入1ml pbs到流式管1500rpm离心3分钟弃上清，加入约200μl 1
×
apoptosis binding buffer重悬细胞，避光储存，流式细胞仪上机检测；
[0121]
(3)周期分析：细胞周期分析前，将需要分析的细胞加入1ml的75％冰乙醇固定24小时以上。收集细胞至流式管中加入1ml pbs 1500rpm离心3分钟弃上清，加入100μl pbs并按1：100比例加入rnase i于37度孵育30分钟，加入1ml pbs洗涤染色的细胞，室温1500rpm离心3分钟弃上清后，加入100μl pbs并按1：100比例加入pi染液于室温孵育染色30分钟后，加入1ml pbs到流式管1500rpm离心3分钟弃上清，加入约200μl pbs重悬细胞，避光储存，流式细胞仪上机检测。
[0122]
1.2cd34
+
细胞的分离、纯化和培养
[0123]
课题涉及到的cd34
+
细胞均来源于脐带血，取7ml淋巴细胞分离液(ficoll，norway)加入到15ml离心管中，脐带血以1:1等体积缓慢加入至ficoll上层中，采用密度梯度2000rpm 4度离心20分钟，缓慢降速后取中间白色分层的单个核细胞，pbs稀释取出的细胞混合液，混匀后1500rpm离心5分钟再用pbs清洗细胞后，加入1ml红细胞裂解液裂解红细胞，pbs洗一遍后得到脐带血单个核细胞，然后通过美天旎人源cd34磁珠分选试剂盒(macs，miltenyi biotec)纯化并富集到cd34
+
细胞(磁珠分选方法见kit使用说明书)。通过分离纯化后得到富集的cd34
+
细胞，将cd34
+
细胞培养在如下cd34
+
全配培养基中，培养3天扩增后开展后续实验。
[0124]
imdmbit 9500 20％flt3 100ng/mlscf 100ng/mltpo 100ng/mlil-6 20ng/ml
[0125]
1.3rna提取和定量rt-pcr
[0126]
1.rna抽提：分别收集待处理细胞离心获得细胞沉淀，加入1ml trizol充分混匀后，用氯仿抽提法提取细胞总rna。
[0127]
(1)相分离：在含有1ml trizol溶解物的1.5ml ep管中加入0.2ml的氯仿，用手剧烈摇晃15秒，将混合物于室温静置2-3分钟后，在4℃条件下以12000g离心15分钟，高速离心后液体分成三层，最下层的红色为酚-氯仿相，一个中间层，最上层为含rna的无色水相层。
[0128]
(2)rna沉淀：将上层水相转移到新的1.5ml ep管中，同时加入0.5ml异丙醇溶液，混匀后将样品于-20℃静置20分钟，在4℃条件下以12000g离心15分钟，离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样rna沉淀。
[0129]
(3)rna洗涤：弃上清，分别加入1ml 75％乙醇洗涤rna沉淀，混匀后4℃条件下12000g离心5分钟。
[0130]
(4)rna再溶解：去上清，置空气中5-10分钟，干燥rna沉淀，用无rnase水重悬rna沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟，测浓度后-20℃保存。
[0131]
2.rna反转录及荧光定量检测：对所提取rna浓度测定后，使用primescript rt试
剂盒(takara)反转录为cdna，使用方法参照试剂盒说明书。使用sybr green supermix(roche)配制荧光定量反应液，在机器abi q7上进行实时pcr分析。表2.1.4.3列出了所检测基因的引物序列。
[0132]
1.4pla实验
[0133]
分别用dmso和1.5μm uf146处理kasumi-1细胞48小时，计数甩片到载玻片上。加入200μl 4％pfa室温固定20分钟后，用pbs洗2遍，每次10分钟。室温晾干表面的水分后，用含0.1％triton x-100的pbs固定10分钟，pbs洗2遍，每次10分钟。含3％bsa的pbs室温封闭60分钟后，加入30-40μl含一抗的封闭液4℃避光孵育过夜。室温pbs洗2遍，每次10分钟。分别以1:5或1:10比例加入oligonucleotide偶联的pla探针混合液37℃孵育1小时，用wash buffer a洗脱2次，每次5分钟。加入经稀释的1
×
ligase solution 37℃孵育30分钟进行连接后，wash buffer a洗脱2次，每次5分钟。分别加入polymerase和nucleotide混合液37℃扩增120分钟，wash buffer b洗脱2次，每次10分钟。室温风干后，1:100加入dapi避光染色10分钟，wash buffer b洗脱10分钟后用抗淬灭的封片剂封片后在激光共聚焦显微镜拍摄。通过分析pla实验相互作用蛋白间形成的荧光点以研究uf146对kasumi-1细胞特异性作用靶点的影响。
[0134]
1.5dna甲基化
[0135]
分别用dmso和uf146处理kasumi-1细胞24小时，离心后分别收集细胞用于rna和gdna抽提。qpcr验证mxd4的表达后，收集kasumi-1细胞并用qiagen gdna抽提试剂盒提取kasumi-1细胞gdna。通过重亚硫酸盐处理后(ez dna甲基化金试剂盒，zymo research)，将经甲基化修饰的包嘧啶反转成t，未经修饰的包嘧啶则不能反转成t，将反转后的gdna样品用相应测序引物进行pcr，pcr产物连接到pmd18-t载体后，转化到dh5α感受态中，挑克隆测序比对uf146处理后甲基化比例变化。通过分析测序数据以研究uf146对kasumi-1细胞中uhrf1靶基因mxd4的dna甲基化的影响。
[0136]
1.6免疫共沉淀实验
[0137]
分别用dmso和3.5μm uf146处理kasumi-1细胞24小时，细胞计数后分别取1
×
107个细胞进行蛋白裂解。分别加入1ml lysis buffer后，冰上裂解30分钟，置于自动超声仪中超声5分钟，使细胞混合液裂解澄清。4℃条件下12000g离心15分钟，取上清分别加入2.5μl uhrf1抗体混匀后4℃rotation孵育过夜。第二天每管分别加入35μl protein a/g argrose beads置于4℃rotation 4小时以上，4℃条件下500g离心1分钟，弃上清，lysis buffer裂解液洗脱3次后，加入1
×
plb裂解液95℃煮10分钟使蛋白从beads上洗脱下来，western blot验证uf146处理对kasumi-1细胞中uhrf1与dnmt1的相互作用的影响。
[0138]
1.7小鼠病理he染色
[0139]
aml-pdx小鼠骨髓组织苏木素-伊红染色法：(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ10min-二甲苯ⅱ10min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。(2)苏木素染细胞核：切片入harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。(3)伊红染细胞质切片入伊红染液中染色1-3min。(4)脱水封片：将切片依次放入95％酒精i 5min-95％酒精ii 5min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。(5)骨髓切片用中性树脂封片，避
光保存在暗盒中，在显微镜上进行镜检分析。
[0140]
1.8克隆形成实验
[0141]
(1)人正常造血干细胞cfu：cd34
+
细胞来源于脐带血，取7ml淋巴细胞分离液(ficoll，norway)加入到15ml离心管中，脐带血以1:1等体积缓慢加入至ficoll上层中，采用密度梯度2000rpm 4度离心20分钟，缓慢降速后取中间白色分层的单个核细胞，pbs稀释取出的细胞混合液，混匀后1500rpm离心5分钟再用pbs清洗细胞后，加入1ml红细胞裂解液裂解红细胞，pbs洗一遍后得到脐带血单个核细胞，然后通过美天旎人源cd34磁珠分选试剂盒(macs，miltenyi biotec)纯化并富集到cd34
+
细胞(磁珠分选方法见试剂盒使用说明书)。收集、重悬和计数cd34
+
细胞，分别将1000个cd34
+
细胞种植在methocult gf-h4435培养基(stem cell technologies)中，并分别以dmso和2.5μm uf146加入培养基中培养7天后，显微镜计数克隆数目并显微镜拍摄克隆形态大小分析uf146对正常造血干细胞的影响。
[0142]
(2)aml病人骨髓细胞cfu：收集和分离aml病人来源的骨髓细胞。红细胞裂解后进行细胞计数，分别将10000个aml病人骨髓细胞种植在methocult gf-h4435培养基(stem cell technologies)中，并分别以dmso和2.5μm uf146加入培养基中培养7天后，显微镜计数克隆数目并显微镜拍摄克隆形态大小分析uf146对aml病人骨髓细胞克隆形成能力的影响。
[0143]
1.9抑制剂小鼠体内治疗实验
[0144]
(1)ae9a和mll-af9脾细胞二次移植：取ae9a和mll-af9原代骨髓细胞移植的发病的uhrf1
f/f
受体小鼠脾脏，分离得到ae9a和mll-af9白血病小鼠脾细胞，计数1
×
106ae9a和1
×
105mll-af9脾细胞尾静脉移植到经半致死剂量(4.75gy)辐照的受体小鼠体内，移植3天后，对小鼠进行uf146腹腔注射给药，剂量为2.5mg/kg，分别称体重每2天给药一次，小鼠发病前一周对受体小鼠外周血随访，检测外周血细胞数目变化和gfp比例动态变化，分别记录小鼠生存期和小鼠随访数据分析uf146对ae9a和mll-af9小鼠白血病发展的影响。
[0145]
(2)aml-pdx异种移植：取来自aml病人骨髓细胞进行骨髓单个核细胞的分离，得到单细胞悬液后，计数5
×
106病人骨髓细胞尾静脉移植到经2.0gy辐照的b-ndg受体小鼠体内，移植3天后，对小鼠进行uf146腹腔注射给药，剂量为2.5mg/kg，分别称体重每2天给药一次，小鼠发病前一周对受体小鼠外周血随访，检测外周血细胞数目变化和gfp比例动态变化，分别记录小鼠生存期和小鼠随访数据分析uf146对病人来源的aml细胞小鼠白血病发展的影响。
[0146]
1.10rna测序
[0147]
用dmso和2.5μm的uf146处理kasumi-1细胞24h，dmso和20μm的uf146处理thp-1细胞24h，pbs洗一遍细胞后，分别收集kasumi-1细胞和thp-1细胞并用trizol裂解细胞和存储rna，氯仿法抽提rna。
[0148]
使用truseq rna样品制备试剂盒v2(illumina)进行rna-seq文库构建，最后采用illumina hiseq2500进行测序。使用tophat(2.0.9版)将reads数与基因组比对，将ht-seq用于计算基因的fpkm(每百万个reads数中比对到外显子的每1千个碱基上片段个数)。样品数据进行gsea和go分析，以分析rna-seq中差异表达基因的功能和机制。
[0149]
1.11测序分析
[0150]
标准化的rna-seq数据通过fold change参数在excel进行排序后，另存为txt文本
文档，将txt后缀改为rnk，上传到gsea软件，分析中用到的基因通路变化从gsea官网(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)上下载。david软件用于go富集分析(https://david.ncifcrf.gov/)。标准化的chip-seq和atac-seq数据均用igv软件分析。
[0151]
1.14统计分析
[0152]
所有数据表示为平均值
±
平均值的标准误差分析，所有结果均通过3个独立的重复实验获得。统计学分析是通过graphpad prism进行的并用t检验分析数据差异性变化。生存曲线使用kaplan-meier方法统计，并通过对数秩检验进行比较。*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，所有*均表示显著差异。
[0153]
1.15uhrf1抑制剂的合成
[0154]
本发明中通过虚拟筛选法获得的uf146化合物，通过specs公司合成获得。
[0155]
实施例1 uf146特异性靶向uhrf1的sra结构域
[0156]
尽管uhrf1在各种癌症中得到了广泛的研究，但有效的uhrf1抑制剂却鲜有报道。近年来，部分uhrf1抑制剂虽有报道，但它们是否为uhrf1特异靶点并且是否对白血病具有功能作用尚不清楚。基于本发明人研究发现uhrf1介导的dna甲基化在aml中的重要功能，通过虚拟筛选法设计了针对uhrf1的sra结构域的小分子共49种，经过功能初筛得到对白血病细胞具有较好抑制效果的抑制剂uf146(图2a)。mtt实验表明，uf146对急性髓系白血病细胞kasumi-1具有很好的抑制效果，其在48小时的ic50浓度在3.58μm(图2b)。
[0157]
为了鉴定uf146在uhrf1和sra结构域上的特异性靶点，使用uhrf1和dnmt1抗体和pla荧光探针进行邻近连接实验(pla)，通过确定uhrf1和dnmt1相互作用连接位点(红点)的数目来验证uf146对其相互作用的影响。用uf146处理kasumi-1细胞24h后收集细胞并甩片进行pla实验。
[0158]
结果表明uf146处理的kasumi-1细胞中的相互作用连接位点比dmso处理的细胞明显减少，表明uf146特异作用于uhrf1的sra结构域并抑制uhrf1和dnmt1的相互作用(图2c和d)。
[0159]
为了进一步分析uf146对uhrf1特异性的影响，通过免疫共沉淀实验分析了uf146处理kasumi-1细胞24小时后uhrf1与dnmt1相互作用的影响，结果表明uf146显著降低了uhrf1与dnmt1之间的相互作用(图3a)。
[0160]
为了分析uf146对uhrf1靶基因mxd4的甲基化影响，通过手动甲基化实验分析了uf146对于mxd4甲基化水平变化，结果表明mxd4基因启动子区域dna甲基化水平明显降低(图3b)。
[0161]
同时，还检测了uf146对于mxd4表达的影响，q-pcr结果表明uf146显著上调了uhrf1靶基因mxd4的表达(图3c)。这表明uf146是特异性靶向uhrf1的抑制剂。
[0162]
尽管uhrf1抑制剂uf146对白血病细胞具有很好的抑制效果，但uf146能否作为有效的靶点药物，需要进一步分析uf146对正常造血干细胞的影响。
[0163]
为了分析uf146对人源造血干细胞的影响，收集并用磁珠分离了脐带血来源的cd34
+
细胞，经过72h扩增后获得了细胞状态稳定的人源造血干细胞，mtt结果表明，不同浓度uf146处理cd34
+
细胞和人源白血病细胞kasumi-1 48小时后，kasumi-1细胞增殖能力受到显著性抑制，而cd34
+
扩增能力则影响较小(图4a)。为了进一步验证这一结果，将cd34
+
细
胞进行克隆形成能力分析，结果表明uf146处理后的cd34
+
细胞克隆总数和各系分化克隆数有一定程度降低(图4b)，但与uf146处理aml来源的病人细胞(图7a)相比，其克隆形成能力影响较小(图4b)。以上结果表明，uf146对人源造血干细胞自我更新和分化能力影响较小，uf146抑制白血病细胞的增殖能力比人正常造血干细胞更强，说明uf146具有的毒副作用较小。
[0164]
综上，uf146能显著性抑制白血病细胞增殖能力，但对人源正常造血干细胞的毒副作用较小，表明uf146能够作为一个安全有效的uhrf1特异性抑制靶点。
[0165]
实施例2 uhrf1抑制剂uf146对于白血病细胞具有显著抑制作用
[0166]
为了研究uf146对白血病细胞的功能影响，分别用不同浓度处理kasumi-1细胞，流式结果表明uf146显著促进kasumi-1细胞的凋亡(图5a)，同时导致细胞周期g2/m期阻滞(图5b)，这与uhrf1在kasumi-1细胞中敲低所引起的细胞凋亡增加和细胞周期阻滞的表现一致，表明uf146是uhrf1的特异性抑制剂。
[0167]
为了进一步研究uf146对其它类型aml的功能影响，用uf146分别处理thp-1、nb4、k562、skm-1、hl-60、jurkat、oci-aml3、molm13、nomo-1和mv4-11细胞48小时，mtt结果表明uf146对所有急性髓系白血病细胞的增殖均有明显抑制作用(图6)。
[0168]
为了研究uf146对原代aml病人细胞的影响，收集和分离培养了aml病人白血病细胞，mtt结果表明uf146对aml原代细胞增殖具有显著的抑制作用(图7c)。为了分析uf146处理后的细胞形态学影响，对uf146处理后的aml原代细胞进行细胞甩片和瑞士染色，结果表明，与对照组相比，aml病人细胞在20μm uf146处理48h后凋亡细胞显著增多(图7b)。
[0169]
此外，还对uf146处理的aml原代细胞进行了克隆形成能力分析，将uf146处理的aml原代细胞种植在含人细胞因子的甲基纤维素培养基中检测uf146对细胞克隆形成能力的影响，结果表明与dmso对照组相比，2.5um uf146处理aml病人原代细胞cfu数目显著降低(图7a)，同时克隆形态大小更小，这表明uf146显著抑制病人原代细胞的克隆形成能力。
[0170]
综上所述，uhrf1抑制剂uf146对aml细胞系和aml病人原代细胞增殖具有明显的抑制作用，同时uf146也明显抑制aml病人原代细胞的克隆形成能力。
[0171]
实施例3 uhrf1抑制剂uf146对于急性髓系白血病具有显著治疗作用
[0172]
为了研究uf146对aml疾病发展的治疗效果，收集和分离了濒死发病的原代移植的ae9a和mll-af9白血病小鼠的脾细胞，分别用1
×
104mll-af9白血病小鼠脾细胞和1.5
×
106ae9a白血病小鼠脾细胞尾静脉移植到亚致死剂量4.75gy辐照的受体小鼠体内以进行二次移植，在受体小鼠移植3天后每隔一天腹腔注射2.5mg/kg uf146，连续三周给药受体小鼠分析uf146对小鼠发病的影响。
[0173]
生存期统计结果表明，与对照组相比，uf146治疗组的ae9a受体小鼠生存期显著延长(图8a)；同样的，经过uf146处理的mll-af9白血病小鼠中位数生存期为46.5天，比中位数生存期为38天的对照组小鼠延迟了8.5天，这表明uf146在小鼠体内对t(8；21)和t(9；11)白血病具有显著的治疗作用(图8b)。
[0174]
此外，还分析了给药过程中，ae9a和mll-af9受体小鼠体重变化，结果表明uf146对给药受体小鼠体重的影响较小(图8c和d)，表明uf146在小鼠体内的毒副作用影响也较小。
[0175]
为了分析uf146对小鼠疾病发展进程的影响，对ae9a移植受体小鼠进行了外周血随访分析，全血细胞计数分析表明接受uf146治疗的受体小鼠外周血白细胞(wbc)显著低于
对照组，而红细胞、血小板和血红蛋白则无显著影响(图9a)。同时，对外周血涂片并进行瑞士染色，结果表明与对照组相比，uf146治疗的受者小鼠外周血中浸润的白血病细胞显著减少(图9b)。
[0176]
此外，流式分析表明外周血中gfp
+
gr-1-细胞的比例显著降低(图9c)，表明经过uf146治疗的受体小鼠白血病细胞浸润更少。
[0177]
综上，这些研究结果表明uf146在小鼠体内对急性髓系白血病的发展具有显著的治疗效果。
[0178]
为了进一步分析uf146对aml病人细胞的治疗效果，收集和分离了来自aml病人骨髓细胞并进行了异种移植实验。流式分析表明，供体aml病人细胞hcd45
+
hcd34
+
比例为87％左右(图10a)。将5
×
106个aml病人细胞尾静脉移植到经2.0gy辐照的b-ndg小鼠体内，在受体小鼠移植3天后，每隔一天分别腹腔给药2.5mg/kg，分析uf146对小鼠pdx疾病模型的影响(图10b)。
[0179]
生存期统计结果表明，uf146治疗组的b-ndg受体小鼠中位数生存期为25天，比中位数生存期为12.5天的对照组小鼠延迟了12.5天，说明uf146在小鼠体内对aml病人来源的人白血病具有显著的治疗作用(图10c)。
[0180]
与此同时，分离和收集了小鼠的骨髓和脾细胞，对小鼠细胞进行了甩片和瑞士染色，结果表明与对照组相比，uf146治疗的b-ndg受体小鼠骨髓和脾中浸润的白血病细胞显著减少(图10d)。
[0181]
此外，为了进一步分析uf146对pdx受体小鼠疾病发展的影响，收集和分离了对照组和uf146给药组受体小鼠的骨髓细胞，流式染色分析表明，小鼠骨髓中hcd45
+
mcd45-比例明显降低(图11a)，同时hcd45
+
hcd34
+
也明显受到抑制(图11b)。
[0182]
he染色病理分析进一步表明，经过uf146治疗的受体小鼠脾脏中来自aml病人的白血病细胞浸润明显减少(图11c)。
[0183]
综上，这些研究结果表明uf146在小鼠体内对病人来源的白血病的发展具有显著的治疗效果。
[0184]
讨论
[0185]
目前，有关uhrf1抑制剂的研究也有一些报道，例如茴香霉素(anisomycin)、姜黄素(curcumin)、二氢青蒿素(dihydroartemisinin)、大黄素(emodin)、因子喹啉铜抑制剂(factor quinolinone inhibitor 1，fqi1)、扁柏素(hinokitiol)、萘茜(naphthazarin)、托林2(torin 2)、紫草醌(shikonin)、木犀草素(luteolin)和米托蒽醌(mitoxantrone)等，它们虽能有效降低uhrf1的表达，但其中大部分小分子效应物都是uhrf1非特异性的，因此难以作为特异性的uhrf1抑制分子。
[0186]
最近研究表明，利用虚拟串联筛选方法得到的尿嘧啶衍生物nsc232003(cas号1905453-18-0)，主要通过作用在uhrf1的sra结构域而破坏uhrf1与dna甲基转移酶dnmt1的相互作用而影响dna甲基化水平来调控细胞生存。但之前的功能实验发现nsc232003对急性髓系白血病细胞kasumi-1的增殖和凋亡无明显作用，因此nsc232003难以作为uhrf1抑制剂的有效候选分子。
[0187]
本发明人在前期工作中发展了基于序列的配体-蛋白质相互作用预测新方法transformercpi，并在各个基准测试集和标签反转实验中取得了不错的效果。
[0188]
在本发明中，本发明人将进一步利用该方法transformercpi指导活性化合物的筛选，并将其与传统筛选方法结合，以期能提高虚拟筛选的真阳性率。首先从商业数据库specs中下载210,421个结构用于虚拟筛选，之后对specs库进行泛筛选干扰化合物过滤，得到137,136个小分子。再选用transformcpi模型进行初筛，以uhrf1的sra结构域为输入，对13多万个结构进行活性预测，取配体-蛋白质相互作用预测概率在0.5以上的前50,000个结构。紧接着，在其中选择和已报道的uhrf1活性化合物nsc2320032结构最相似的前1,000个小分子进行配体准备，然后使用glide分子对接初步计算预处理后的化合物与准备好的uhrf1蛋白3(pdb code:3clz)结合的亲和力，最终选择打分靠前的49个化合物，购买合成并进行实验测定。
[0189]
经过筛选和实验测试，uf146化合物表现出优异的针对uhrf1的抑制作用。由于本发明的抑制剂特异性针对uhrf1的sra结构域，因此具有优良的特异性。此外，实验结果表明，uf146能显著性抑制白血病细胞增殖能力，且毒副作用低(对人源正常造血干细胞的毒副作用小)，表明uf146作为安全有效的uhrf1特异性抑制剂，有望用于急性髓系白血病或uhrf1阳性肿瘤的治疗。
[0190]
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