一种抗结核分枝杆菌入侵细胞的靶点及其应用

1.本发明涉及一种抗结核分枝杆菌入侵细胞的靶点及其应用，属于细胞生物学领域。


背景技术：

2.结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)感染引起的结核病(tuberculosis,tb) 是严重威胁人类健康的重大传染病。作为一种胞内致病菌，结核分枝杆菌能利用宿主因子入侵宿主细胞并在宿主细胞内增殖，从而建立感染导致结核病。胞内感染的建立很大程度上依赖结核分枝杆菌对宿主细胞表面受体的操纵和利用，不同结核分枝杆菌入侵的受体的选择决定了其胞内命运。已有的研究表明，结核分枝杆菌能利用宿主细胞表面的肝素结合血凝素 (heparin-binding hemagglutinin adhesion,hbha)入侵非吞噬细胞，如肺上皮细胞a549；宿主巨噬细胞表面的整联蛋白β2能被结核分枝杆菌利用侵入吞噬细胞，如raw264.7细胞。然而，促进结核分枝杆菌同时入侵宿主吞噬和非吞噬细胞的表面受体目前仍有待进一步的研究。深入探究结核分枝杆菌入侵宿主吞噬和非吞噬细胞的机制将为靶向结核分枝杆菌－宿主细胞入侵界面阻断结核分枝杆菌入侵和传播提供有效的干预策略。


技术实现要素：

3.本发明通过无偏性的全基因组筛选实验鉴定了能与mtb表面蛋白mce3a结合的宿主细胞表面g蛋白偶联受体108(gpr108)，并进一步通过实验证实gpr108通过其暴露在细胞外的结构域与mce3a的c端结构域相互作用诱导细胞骨架的重排，从而促进结核分枝杆菌侵入宿主细胞。g蛋白偶联受体是一类具有巨大成药潜能的的细胞表面受体，目前已获批准的1/3的药物都靶向该受体家族。因此，gpr108可作为潜在的抗结核药物新靶点。以gpr108 胞外结构域第33～263位氨基酸所在区域为靶点的多肽或小分子抑制剂能有效阻断结核分枝杆菌对宿主细胞的入侵，从而抑制结核分枝杆菌感染的建立。
4.本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗结核分枝杆菌入侵细胞的药物，所述药物可与(a)～(c)任一所示的靶点结合，沉默或抑制gpr108蛋白，所述靶点含有：
5.(a)含有seq id no.1所示氨基酸序列的多肽；
6.(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸衍生的多肽或其类似物；
7.(c)在与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。
8.在一种实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.在一种实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.在一种实施方式中，所述结核分枝杆菌包括但不限于结核分枝杆菌bcg。
11.本发明的第二个目的是提供seq id no.1所示的靶点在制备抗致病菌入侵宿主细
胞阻断剂方面的应用。
12.在一种实施方式中，所述应用是以seq id no.1所示的蛋白为靶点，筛选可与该靶点结合的细胞阻断剂。
13.在一种实施方式中，所述致病菌包括但不限于结核分枝杆菌、致病性大肠杆菌。
14.在一种实施方式中，所述细胞阻断剂具有与结核分枝杆菌表面蛋白mce3a的c端33～142 位氨基酸一致的氨基酸序列。
15.本发明的第三个目的是提供所述靶点在制备抗结核病药物方面的应用。
16.在一种实施方式中，所述应用是指将seq id no.1所示的胞外端作为药物作用靶点，制备可与之靶向结合的多肽或小分子抑制剂。
17.在一种实施方式中，所述药物包括mce3a(δ33-142)蛋白，其氨基酸序列如seq id no.3 所示。
18.在一种实施方式中，所述抗结核病是指：减少结核分枝杆菌入侵、降低体内结核分枝杆菌数量或促进体内抗结核炎症反应。
19.有益效果：本发明提供的gpr108胞外结构域及gpr108蛋白可作为抗结核药物的新靶点，用于抗结核药物的筛选和研发。经细胞实验验证，针对该靶点设计的多肽等药物(如mce3a (δ33-142))可以阻断该蛋白的功能，从而抵抗结核分枝杆菌细胞入侵。同时以该结构域为靶点设计的抗结核药物可以特异性抑制结核分枝杆菌对宿主细胞的入侵。
附图说明
20.图1：酵母双杂交实验证实gpr108能与结核分枝杆菌表面蛋白mce3a相互作用；其中，左图为sd/-trp-leu培养基，右图为sd/-trp-leu-his-ade培养基；ad表示pgadt7质粒， bd表示pgbkt7质粒，1为共转ad和bd的ah109酵母菌株，2为共转ad-gpr108和 bd的ah109酵母菌株；3为共转ad和bd-mce3a的ah109酵母菌株；4为共转ad-gpr108 和bd-mce3a的ah109酵母菌株；5为共转ad-tak1和bd-tab2的ah109酵母菌株(tak1 和tab2能相互作用，在酵母双杂交系统中被用作阳性对照)。
21.图2免疫共沉淀实验证实g蛋白偶联受体gpr108通过其胞外端(33-263)与mce3a蛋白相互作用(a)；结核分枝杆菌表面蛋白mce3a能通过其c端(δ33-142)，而不是n端(1-142) 与gpr108胞外端(33-263)互作(b)。
22.图3蛋白免疫印迹实验检测gpr108蛋白的敲除情况(a)；gpr108蛋白敲除能衰减结核分枝杆菌表面蛋白mce3a介导的分枝杆菌入侵(b)。
23.图4为gpr108蛋白在不同类型细胞中的表达情况(a)；gpr108的过表达促进了mce3a 介导的分枝杆菌入侵(b)。
24.图5为蛋白对分枝杆菌入侵宿主细胞的影响。
具体实施方式
25.下述实施例中，培养基配方具体如下：
26.ypda培养基(1l)：20g蛋白胨，10g酵母提取物，20g葡萄糖，0.03g腺嘌呤；ypda 固体培养基另外再添加20毫升琼脂粉。
27.10
×
do(-leu-trp)：3.2g do(-leu-trp)粉末(clontech)溶于500ml水；
28.10
×
do(-trp-leu-his-ade)：3.0g do(-trp-leu-his-ade)粉末(clontech)溶于500ml 水；
29.20
×
leu：200mg l-leucine(sigma公司)溶于100ml水；
30.sd/-trp培养基配方(50ml)：1.335g sd base(clontech)，5ml 10
×
do(-leu-trp) 和2.5ml 20
×
leu，并加水至50毫升，121度灭菌15分钟；
31.sd/-trp-leu-his-ade培养基(100ml)：4.67克sd agar base(clontech)，10毫升10
×
do (-trp-leu-his-ade)，并加水至100毫升，121度灭菌15分钟。
32.实施例1 细胞表面g蛋白偶联受体gpr108
33.通过无偏性的全基因组筛选实验，鉴定了能与mtb表面蛋白mce3a结合的宿主细胞表面 g蛋白偶联受体108(gpr108，可以促进结核分枝杆菌入侵宿主细胞的g蛋白偶联受体 gpr108，其氨基酸序列如seq idno:2所示。
34.实施例2 gpr108与结核分枝杆菌表面蛋白mce3a互作
35.(a)酵母双杂交实验
36.1)分别构建pgbkt7-mce3a和pgadt7-gpr108质粒，操作如下：
37.设计pcr引物：
38.pgbkt7-mce3a-ecor1-f:cggaattcatgagacgcgggccgggtcg；
39.pgbkt7-mce3a-bamh1-r:cgggatcctcatggctgctcccccgccgc；
40.pgadt7-gpr108-xho1-f:ccgctcgagaccatgggagcagtgagcga；
41.pgadt7-gpr108-bamh1-r:cgggatccgctaacagttcccgcccgctg；
42.pcr扩增：
43.pcr反应体系(50μl)：25μl 2
×
phanta max buffer(vazyme)，1μl dntp mix(vazyme)， 2μl上游引物，2μl下游引物，1μl phanta max super-fidelity dna polymerase(vazyme)，2μl cdna模版，加水至50μl，反应条件为95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，65℃退火 15秒，72度延伸90秒，30个循环，72℃彻底延伸5分钟；
44.利用dna凝胶回收试剂盒(axygen)对获得的扩增产物进行回收；
45.双酶切体系；
46.mce3a扩增产物，30μl pcr产物，1.5μl ecor1，1.5μl bamh1，5μl buffer，12μl水；pgbkt7 空载体，5μl pgbkt7载体(clotech)，1.5μl ecor1，1.5μl bamh1，2μl buffer，10μl水；
47.gpr108扩增产物，30μl pcr产物，1.5μl xho1，1.5μl bamh1，5μl buffer，12μl水；pgadt7 空载体，5μl pgadt7载体(clotech)，1.5μl xho1，1.5μl bamh1，2μl buffer，10μl水；
48.连接体系：收集双酶切的片段，2μl 10
×
t4 dna ligase buffer(thermofisher)，1μl t4 dna ligase(thermofisher)，20-100ng载体，等量目的片段，加水至20μl；分别获得pgadt7-gpr108 和pgbkt7-mce3a的连接产物；
49.转化：将连接产物分别加入已融化的dh5α感受态细胞中，混匀后于冰上放置10分钟，其后42℃热激90秒，再放置于冰上10分钟，然后加入1毫升lb液体培养基于37℃培养箱中培养；
50.验证转化子：挑取若干单克隆于lb液体培养基中，待生长到对数期后提取质粒并
送测序，并将测序正确的菌种保存在15％的甘油中；
51.构建重组细胞：将小提获得的pgbkt7-mce3a质粒转化至制备ah109酵母感受态细胞中，涂布于色氨酸营养缺失的sd/-trp平板上，30℃倒置培养3-5天，获得转化后的单克隆细胞。
52.2)挑取步骤1)培养的单克隆置于色氨酸营养缺失的sd/-trp液体培养基中，30℃震荡培养250rpm振荡培养过夜(16-18h)，至od
600
》1.5；取适量过夜菌液接种于300ml新鲜的ypda培养基，30℃恒温，250rpm振荡培养至od
600
＝0.4-0.6，制备酵母感受态；将 pgadt7-gpr108转化至步骤1)制备的酵母感受态中，涂布于营养缺失的sd/-trp-leu平板上，30℃倒置培养3-5天；
53.3)挑取步骤2)培养获得的单克隆于营养缺失的sd/-trp-leu液体培养基中，30℃震荡培养250rpm振荡培养过夜；然后将培养基涂布在sd/-trp-leu平板及 sd/-trp-leu-his-ade平板上，以验证mce3a和gpr108之间的相互作用，结果如图1右侧培养基所示，若mce3a和gpr108之间存在相互作用，则在sd/-trp-leu-his-ade平板上能长出菌株。
54.(b)免疫共沉淀实验
55.1)分别构建flag-mce3a和myc-gpr108(33-263)质粒，引物序列如下：
56.flag-mce3a-ecor1-f:cggaattcatgagacgcgggccgggtcg；
57.flag-mce3a-bamh1-r:cgggatcctggctgctcccccgccgcg；
58.myc-gpr108(33-263)-bamh1-f:cgggatccatgcgcatccaccagctggc,
59.myc-gpr108(33-263)-ecor1-r:cggaattccttgaaaaggggcatctccg
60.a.pcr扩增：pcr反应体系(50μl)：25μl 2
×
phanta max buffer(vazyme)，1μl dntp mix (vazyme)，2μl上游引物，2μl下游引物，1μl phanta max super-fidelity dna polymerase (vazyme)，2μl pgbkt7-mce3a或pgadt7-gpr108模版，加水至50μl，反应条件为95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，65℃退火15秒，72度延伸90秒，30个循环，72℃彻底延伸5分钟；
61.b.利用dna凝胶回收试剂盒(axygen)对获得的扩增产物进行回收；
62.c.分别建立如下两组双酶切体系：
63.mce3a扩增产物，30μl pcr产物，1.5μl ecor1，1.5μl bamh1，5μl buffer，12μl水； 3flag-cmv-14空载体，5μl 3flag-cmv-14载体(sigma)，1.5μl ecor1，1.5μl bamh1，2μl buffer， 10μl水；
64.gpr108(33-263)扩增产物，30μl pcr产物，1.5μl bamh1，1.5μl ecor1，5μl buffer， 12μl水；pcdna6a空载体，5μl pcdna6a载体(invitrogen)，1.5μl bamh1，1.5μl ecor1， 2μl buffer，10μl水；
65.d.连接体系，2μl 10
×
t4 dna ligase buffer(thermofisher)，1μl t4 dna ligase (thermofisher)，20-100ng步骤c双酶切后的载体，步骤c双酶切后的等量目的片段，加水至20μl；
66.e.转化，将步骤d获得的连接产物分别加入已融化的dh5α感受态细胞中，混匀后于冰上放置10分钟，其后42℃热激90秒，再放置于冰上10分钟，然后加入1毫升lb液体培养基于37℃培养箱中培养；
67.f.挑菌测序，挑取若干单克隆于lb液体培养基中，待生长到对数期后提取质粒并
dntp mix (vazyme)，2μl上游引物，2μl下游引物，1μl phanta max super-fidelity dna polymerase (vazyme)，2μl pgadt7-gpr108模版，加水至50μl，反应条件为95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，65℃退火15秒，72度延伸90秒，30个循环，72℃彻底延伸5分钟；
86.b.利用dna凝胶回收试剂盒(axygen)对获得的扩增产物进行回收；
87.c.双酶切体系；gpr108扩增产物，30μl pcr产物，1.5μl ecor1，1.5μl bamh1，5μl buffer， 12μl水；3flag-cmv-14空载体，5μl 3flag-cmv-14载体，1.5μl ecor1，1.5μl bamh1，2μl buffer， 10μl水；
88.d.连接体系，2μl 10
×
t4 dna ligase buffer(thermofisher)，1μl t4 dna ligase (thermofisher)，20-100ng载体，等量目的片段，加水至20μl；
89.e.转化，将连接产物加入已融化的dh5α感受态细胞中，混匀后于冰上放置10分钟，其后42℃热激90秒，再放置于冰上10分钟，然后加入1毫升lb液体培养基于37℃培养箱中培养；
90.f.挑菌测序，挑取若干单克隆于lb液体培养基中，待生长到对数期后提取质粒并送测序，并将测序正确的菌种保存在15％的甘油中；
91.g.用lipo2000将其过表达至mda-mb-231细胞系中；
92.2)转染24h后，分别用wt bcg和mce3a-bcg感染该细胞系，并在感染后不同时间点，用pbs将未进入细胞的菌洗掉，在将细胞裂解计算cfu。结果如图4所示，相比于野生型 mda-mb-231细胞，gpr108过表达的mda-mb-231细胞显著促进了mce3a-bcg的入侵。
93.实施例5 gpr108作为靶点筛选抗结核多肽
94.将mce3a(143-425)蛋白多肽用作抗结核分枝杆菌入侵的多肽。步骤如下：
95.1)构建pgex6p-1-mce3a(143-425)质粒，pcr引物如下：
96.f-ecor1：cggaattcacggaaatcaacaccgtcttcg；
97.r-bamh1：cgggatcctggctgctcccccgccgcg；
98.a.pcr扩增，pcr反应体系(50μl)：25μl 2
×
phanta max buffer(vazyme)，1μl dntp mix (vazyme)，2μl上游引物，2μl下游引物，1μl phanta max super-fidelity dna polymerase (vazyme)，2μl pgbkt7-mce3a模版，加水至50μl，反应条件为95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，65℃退火15秒，72度延伸90秒，30个循环，72℃彻底延伸5分钟；
99.b.利用dna凝胶回收试剂盒(axygen)对获得的扩增产物进行回收；
100.c.双酶切体系；mce3a(143-425)扩增产物，30μl pcr产物，1.5μl ecor1，1.5μl bamh1， 5μl buffer，12μl水；pgex6p-1空载体，5μl pgex6p-1载体(solarbio)，1.5μl ecor1，1.5μl bamh1，2μl buffer，10μl水；
101.d.连接体系，2μl 10
×
t4 dna ligase buffer(thermofisher)，1μl t4 dna ligase (thermofisher)，20-100ng载体，等量目的片段，加水至20μl；
102.e.转化，将连接产物加入已融化的dh5α感受态细胞中，混匀后于冰上放置10分钟，其后42℃热激90秒，再放置于冰上10分钟，然后加入1毫升lb液体培养基于37℃培养箱中培养；
103.f.挑菌测序，挑取若干单克隆于lb液体培养基中，待生长到对数期后提取质粒并送测序，并将测序正确的菌种保存在15％的甘油中；
104.2)将pegx6p-1-mce3a(143-425)在大肠杆菌bl21菌株中表达，并用iptg作为诱导
剂诱导该蛋白的表达，收集菌体并纯化得到mce3a(143-425)蛋白；
105.3)用30μg/ml和10μg/ml mce3a(143-425)蛋白分别与非小细胞肺癌细胞a549和单核巨噬细胞raw264.7细胞孵育1小时；
106.4)分别用wt bcg以及mce3a-bcg感染步骤3)孵育后的细胞，检测蛋白对分枝杆菌入侵宿主细胞的影响。如图5所示，相比于未加mce3a(143-425)蛋白孵育组，30μg/ml和10 μg/ml的mce3a(143-425)蛋白预孵育显著降低了70-80％mce3a-bcg入侵a549和raw264.7 的能力。
107.实施例6 gpr108的应用
108.seq id no.1所示的结构域可作为抗结核分枝杆菌入侵宿主细胞新靶点在抗结核药物研发中应用，具体包括在商业化蛋白、多肽、试剂盒等方面的开发和应用，针对该靶点设计的多肽等药物，如mce3a(143-425)，可以阻断该蛋白的功能，从而抵抗结核分枝杆菌细胞入侵。
109.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。