一种rna在制备治疗肺纤维化相关疾病的产品中的应用
技术领域：
：1.本技术涉及生物医学
技术领域：
：，特别涉及一种rna在制备治疗肺纤维化相关疾病的产品中的应用。
背景技术：
：：2.肺纤维化是一种慢性、进行性、不可逆性的肺间质组织异质性疾病，包括继发因素导致的肺纤维化和特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis，ipf)，其是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常(疤痕形成)。肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难(自觉气不够用)，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化。特发性肺纤维化发病率和死亡率逐年增加，诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，被称为一种“类肿瘤疾病”。3.肺纤维化发病率逐年升高，且致残率、病死率高，肺移植是目前临床唯一有效的治疗手段。大量研究表明mirna在肺纤维化发病过程中表达明显变化，影响肺纤维化进程中的多个过程，并且大大降低其对一些信号传导通路如tgfβ/smad和erk信号传导的负性调控作用，进而导致肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞增殖及表型转化、成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化(emt)、细胞外基质(ecm)重塑，加速了肺纤维化的发展进程。4.mirna是microrna的简称，其是一类长约19-23个核苷酸的小分子单链rna，在动物、植物、病毒等多种生物体中广泛存在。它们在转录后水平发挥作用，能够与靶mrna的3’‑utr(untranslatedregion)区的碱基互补配对而起作用，使mrna降解或抑制mrna表达，从而导致特定基因的沉默。5.目前发现mirna在多种疾病的发生发展过程中都发挥重要作用。大量的研究证明，mirna的遗传变异、扩增、缺失或基因沉默都可能引起疾病的发生，mirna被发现在各种疾病中都有异常表达，因此mirna的特定变化被认为是疾病发生发展的主要特征之一。在肿瘤的发生发展过程中，mirna可以起到促癌或抑癌的作用。因此，mirna本身就是潜在的药物靶点。6.但是目前在mirna研究领域，关于肺纤维化临床研究还较少。mirna如何作为药物有效稳定地治疗肺纤维化，是否可以开发新的mirna传输方式实现安全有效的传输mirna以治疗肺纤维化，目前世界上相关研究仍是空白。因此，以mirna为研究对象，通过融入最新的科学发现，开发全新的mirna传输技术，以实现mirna稳定特异的体内传输，从而探寻新的肺纤维化治疗方式和途径，为提高肺纤维化的治疗效果奠定基础，是目前亟待解决的问题。技术实现要素：7.有鉴于此，本技术实施例提供了一种rna在制备治疗肺纤维化相关疾病的产品中的应用，以解决现有技术中存在的技术缺陷。8.本技术提供一种rna在制备治疗肺纤维化相关疾病的产品中的应用，所述治疗肺纤维化相关疾病的产品中包括载体与rna，携带所述rna的载体进入宿主体内后能够自组装形成复合结构，对肺纤维化及其相关疾病进行靶向治疗，其中，所述rna包括能够抑制tgf-β1基因表达的sirna和/或能够抑制mir-21表达的反义rna。9.具体地，所述载体携带有能够用于治疗肺纤维化的rna，该载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述rna片段的复合结构，所述复合结构能将够抑制肺纤维化的rna送入肺部，以实现肺纤维化的治疗。10.可选地，上述宿主的器官组织为肝脏，复合结构为外泌体。11.可选地，所述能够抑制tgf-β1基因表达的sirna选自以下sirna序列、编码以下sirna的核酸序列、或与以下sirna同源性大于80％的sirna中的任意一种或几种：12.tgf-β1sirna-1：5’‑atttctggtagagttccac-3’；13.tgf-β1sirna-2：5’‑ttcatgtcatggatggtgc-3’；14.tgf-β1sirna-3：5’‑taaagtcaatgtacagctg-3’；15.tgf-β1sirna-4：5’‑tatctttgctgtcacaagagc-3’。16.可选地，所述能够抑制tgf-β1基因表达的sirna选自tgf-β1sirna-4或编码tgf-β1sirna-4的核酸序列，所述编码tgf-β1sirna-4的核酸序列由以下正义链、反义链组成，或由与以下正义链、反义链同源性大于80％的序列组成：17.正义链：5’‑aattcgtatctttgctgtcacaagagcgttttggccactgactgacgctcttgtcagcaaagataca-3’；18.反义链：5’‑ccggtgtatctttgctgacaagagcgtcagtcagtggccaaaacgctcttgtgacagcaaagatacg-3’。19.可选地，能够抑制mir-21表达的反义rna的序列为5’‑tcaacatcagtctgataagcta-3’，或编码所述反义rna的核酸序列；20.编码所述反义rna的核酸序列由以下正义链、反义链组成，或由与以下正义链、反义链同源性大于80％的序列组成：21.正义链：5’‑aattcgtcaacatcagtctgataagctagttttggccactgactgactagcttatgactgatgttgaca-3’；22.反义链：5’‑ccggtgtcaacatcagtcataagctagtcagtcagtggccaaaactagcttatcagactgatgttgacg-3’。23.可选地，所述rna还包括能够抑制igfbp-5基因表达的sirna、能够抑制pdgf基因表达的sirna、能够抑制tnf-α基因表达的sirna、能够抑制nox4基因表达的sirna、能够抑制mmp7基因表达的sirna中的任意一种或几种。24.可选地，所述能够抑制igfbp-5基因表达的sirna选自5’‑tcattccgtacttgtccac-3’、5’‑ttgttcggattcctgtctc-3’、5’‑tagaatcctttgcggtcac-3’中的任意一种或几种；25.所述能够抑制pdgf基因表达的sirna选自5’‑acattgcggttattgcagc-3’、5’‑tgaagatcatcaaaggagc-3’、5’‑agatgagctttccaactcg-3’中的任意一种或几种；26.所述能够抑制tnf-α基因表达的sirna选自5’‑tatatgggctcataccagg-3’、5’‑tagaactgatgagagggag-3’、5’‑tttctgtgctcatggtgtc-3’中的任意一种或几种；27.所述能够抑制nox4基因表达的sirna选自5’‑ttaaacacaatcctaggcc-3’、5’‑ataatatactggccaggtc-3’、5’‑ttaagactaatgcagccag-3’中的任意一种或几种；28.所述能够抑制mmp7基因表达的sirna选自5’‑attatgatatccgcagtcc-3’、5’‑tataacttctgaatgcctg-3’、5’‑ttatttccatgatgtaggg-3’中的任意一种或几种。29.可选地，所述载体为质粒载体或病毒载体。30.可选地，所述病毒载体选自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒载体中的任意一种。31.可选地，所述载体上还设置有具有靶向功能的靶向元件，所述靶向元件选自靶向肽或靶向蛋白，所述靶向肽优选为rvg靶向肽、ge11靶向肽，所述靶向蛋白优选为rvg-lamp2b融合蛋白、ge11-lamp2b融合蛋白。32.可选地，所述肺纤维化相关疾病包括肺纤维化以及由肺纤维化引起的并发症、后遗症、炎症。33.可选地，所述治疗肺纤维化相关疾病的产品包括：具有抑制肺纤维化及其相关疾病发展作用的化合物、组合物、药物、制剂、试剂盒、仪器。34.本技术的技术效果为：35.目前，现有的技术多为体外预先制备外泌体，再将制备完成的外泌体注射至人体内进行治疗，由于外泌体的质量无法通过制定统一标准进行衡量，因此，体外预先制备外泌体的技术风险较大，质量无法把控。而不论是病毒载体还是质粒载体，其质量是可控的，并且可以大规模的量化生产，现在通过将特定的rna置于载体上，再将载体以注射等方式注入体内进行治疗，就可以完美解决上述问题，质量易于控制，安全性高，易于大规模推广与应用。36.本技术创新的将特定的rna用于治疗肺纤维化相关疾病的产品中，形成了一种全新、便捷、安全、高效的外源性rna药物递送系统。区别于常规rna递送系统的是，本技术提供的治疗肺纤维化相关疾病的产品，其包含携带rna的载体，该携带rna的载体能够在进入哺乳动物体内后，利用肝脏作为天然生物反应器，在体内自组装为含有rna的外泌体，并通过循环系统运达目标组织肺部，抑制致病基因的表达。如此可以大大提高肺纤维化的治疗效果，还可以通过该平台形成更多rna类药物的研发基础，对rna类药物研发和使用具有极大的推动作用。附图说明37.图1是本技术一实施例提供的tgf-β1sirna体外干扰效率对比图；38.图2是本技术一实施例提供的质粒骨架及质粒体外干扰效率检测结果图；39.图3是本技术一实施例提供的质粒体外干扰效率检测结果图；40.图4是本技术一实施例提供的小鼠体内antimir-21、sirna含量检测图；41.图5是本技术一实施例提供的小鼠治疗过程及治疗情况对比图；42.图6是本技术一实施例提供的小鼠micro-ct结果图；43.图7是本技术一实施例提供的小鼠masson染色结果对比图；44.图8是本技术一实施例提供的小鼠h&e染色结果对比图；45.图9是本技术一实施例提供的小鼠免疫荧光结果图；46.图10是本技术一实施例提供的mir-21、tgf-β1抑制效果对比图；47.图11是本技术一实施例提供的质粒安全性检测结果对比图。具体实施方式48.下面结合附图对本技术的具体实施方式进行描述。49.首先，对本发明涉及到的专业名词、试验方法等进行解释说明。50.苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称he染色。he染色是组织学、病理学教学与科研中最基础、使用最广泛的技术方法之一。51.苏木精染液为碱性，可以将组织的嗜碱性结构(如核糖体、细胞核及细胞质中的核糖核酸等)染成蓝紫色；伊红为酸性染料，可以将组织的嗜酸性结构(如细胞内及细胞间的蛋白质，包括路易体、酒精小体以及细胞质的大部分)染成粉红色，使整个细胞组织的形态清晰可见。52.he染色的具体步骤包括：样本组织固定与切片；组织样本脱蜡；组织样本水化；组织切片苏木素染色、分化与反蓝；组织切片伊红染色与脱水；组织样本切片风干封片；最后在显微镜下观察并拍照。53.masson染色使胶原纤维呈蓝色(被苯胺蓝所染)或绿色(被亮绿所染)，肌纤维呈红色(被酸性品红和丽春红所染)，这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。已固定的组织用一系列阴离子水溶性染料先后或混合染色，则可发现红细胞被最小分子的阴离子染料着染，肌纤维与胞质被中等大小的阴离子染料着染，而胶原纤维则被大分子的阴离子染料着染。由此说明了红细胞对阴离子染料的渗透性最小，肌纤维与胞质次之，而胶原纤维具有最大的渗透性。i型、iii型胶原呈绿色(gbm、tbm、系膜基质及肾间质呈绿色)，嗜复红蛋白、肾小管胞质、红细胞呈红色。54.masson染色的具体步骤包括：55.组织固定于bouin氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋；切片脱蜡至水(二甲苯中脱蜡10min×3次，用吸水纸吸干液体；100％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体；95％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体；流水2min，用吸水纸吸干水分)；weiger氏铁苏木素染5-10min；流水稍洗；0.5％盐酸酒精分化15s；流水冲洗3min；丽春红酸性品红液染8min；蒸馏水稍冲洗；1％磷钼酸水溶液处理约5min；不用水洗，直接用苯胺蓝液或亮绿液复染5min；1％冰醋酸处理1min；95％乙醇脱水5min×2次，用吸水纸吸干液体；100％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体；二甲苯中透明5min×2次，用吸水纸吸干液体；中性树胶封片。56.western免疫印迹(westernblot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。57.westernblot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。其步骤主要包括：提取蛋白、蛋白定量、制胶和电泳、转膜、免疫标记及显影。58.免疫组化，应用抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。59.免疫组化的主要步骤包括：切片浸泡、过夜晾干、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱蜡(100％、95％、90％、80％、75％、70％、50％，每次3min)、双蒸水、滴加3％过氧化氢溶液去除过氧化氢酶、水洗、抗原修复、滴加5％bsa、封闭1h、稀释一抗、pbs缓冲液清洗、孵二抗、pbs缓冲液清洗、显色液显色、水洗、苏木精染色、梯度乙醇脱水、中性树胶封片。60.在本发明中所述的“同源性大于80％”是指两条序列属于部分同源或全部同源，并且序列的相似度大于80％，可以为85％、90％、95％、98％、99％等。61.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。62.实施例163.本实施例提供一种rna在制备治疗肺纤维化相关疾病的产品中的应用，所述治疗肺纤维化相关疾病的产品中包括载体与rna，携带所述rna的载体进入宿主体内后能够自组装形成复合结构，对肺纤维化及其相关疾病进行靶向治疗，其中，所述rna包括能够抑制tgf-β1基因表达的sirna。64.所述载体携带有能够用于治疗肺纤维化的rna，该载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织肝脏中内源性地自发形成含有所述rna片段的复合结构外泌体，所述复合结构外泌体能将够抑制肺纤维化的rna送入肺部，以实现肺纤维化的治疗。65.具体地，能够抑制tgf-β1基因表达的sirna选自以下sirna序列、编码以下sirna的核酸序列、或与以下sirna同源性大于80％的sirna中的任意一种或几种：66.tgf-β1sirna-1：5’‑atttctggtagagttccac-3’；67.tgf-β1sirna-2：5’‑ttcatgtcatggatggtgc-3’；68.tgf-β1sirna-2：5’‑taaagtcaatgtacagctg-3’；69.tgf-β1sirna-4：5’‑tatctttgctgtcacaagagc-3’。70.需要说明的是，上述四种sirna序列并不是随意选择的，而是基于大量的理论研究与反复尝试确定的，在选择上述四种特定的sirna序列的情况下，对tgf-β1基因的抑制效果最强，对肺纤维化及其相关疾病的治疗效果最好。71.在实际应用中，既可以仅选用tgf-β1sirna-1、tgf-β1sirna-2、tgf-β1sirna-3、tgf-β1sirna-4中的一种，也可以选择tgf-β1sirna-1、tgf-β1sirna-2、tgf-β1sirna-3、tgf-β1sirna-4中的任意二者组合、三者组合、四者组合等，优选采用tgf-β1sirna-4或tgf-β1sirna-4与其他sirna序列的组合。72.编码tgf-β1sirna-4的核酸序列由以下正义链、反义链组成，或由与以下正义链、反义链同源性大于80％的序列组成：73.正义链：5’‑aattcgtatctttgctgtcacaagagcgttttggccactgactgacgctcttgtcagcaaagataca-3’；74.反义链：5’‑ccggtgtatctttgctgacaagagcgtcagtcagtggccaaaacgctcttgtgacagcaaagatacg-3’。75.所述载体为质粒载体或病毒载体，其中，所述病毒载体选自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒载体中的任意一种。优选采用腺相关病毒载体。76.所述肺纤维化相关疾病包括肺纤维化以及由肺纤维化引起的并发症、后遗症、炎症类疾病。77.所述治疗肺纤维化相关疾病的产品包括：具有抑制抑制肺纤维化及其相关疾病发展作用的化合物、组合物、药物、制剂、试剂盒、仪器。本实施例提供的治疗肺纤维化相关疾病的产品还可以与其他具有治疗肺纤维化作用的药物(比如吡非尼酮、尼达尼布等)、手段(比如氧疗、机械通气、肺康复、手术治疗、肺移植等)联合使用，以增强治疗效果。78.本实施例提供的治疗肺纤维化相关疾病的产品，其包含携带tgf-β1sirna的载体，该携带tgf-β1sirna的载体能够在进入哺乳动物体内后，利用肝脏作为天然生物反应器，在体内自组装为含有tgf-β1sirna的外泌体，并通过循环系统运达目标组织肺部，抑制致病基因的表达。如此可以大大提高肺纤维化的治疗效果，还可以通过该平台形成更多rna类药物的研发基础，对rna类药物研发和使用具有极大的推动作用。79.实施例280.本实施例提供一种rna在制备治疗肺纤维化相关疾病的产品中的应用，所述治疗肺纤维化相关疾病的产品中包括载体与rna，携带所述rna的载体进入宿主体内后能够自组装形成复合结构，对肺纤维化及其相关疾病进行靶向治疗，其中，所述rna包括能够抑制mir-21表达的反义rna。81.能够抑制mir-21表达的反义rna的序列为5’‑tcaacatcagtctgataagcta-3’，或编码所述反义rna的核酸序列；82.编码反义rna的核酸序列由以下正义链、反义链组成，或由与以下正义链、反义链同源性大于80％的序列组成：83.正义链：5’‑aattcgtcaacatcagtctgataagctagttttggccactgactgactagcttatgactgatgttgaca-3’；84.反义链：5’‑ccggtgtcaacatcagtcataagctagtcagtcagtggccaaaactagcttatcagactgatgttgacg-3’。85.本实施例提供的治疗肺纤维化相关疾病的产品，其包含携带能够抑制mir-21表达的反义rna的载体，该携带能够抑制mir-21表达的反义rna的载体能够在进入哺乳动物体内后，利用肝脏作为天然生物反应器，在体内自组装为含有能够抑制mir-21表达的反义rna的外泌体，并通过循环系统运达目标组织肺部，抑制致病基因的表达。如此可以大大提高肺纤维化的治疗效果，还可以通过该平台形成更多rna类药物的研发基础，对rna类药物研发和使用具有极大的推动作用。86.实施例387.在实施例1和实施例2的基础上，本实施例提供一种rna在制备治疗肺纤维化相关疾病的产品中的应用，所述治疗肺纤维化相关疾病的产品中包括载体与rna，携带所述rna的载体进入宿主体内后能够自组装形成复合结构，对肺纤维化及其相关疾病进行靶向治疗，其中，所述rna包括能够抑制tgf-β1基因表达的sirna和能够抑制mir-21表达的反义rna。88.对于本实施例中“能够抑制tgf-β1基因表达的sirna”、“能够抑制mir-21表达的反义rna”等的具体内容可参见实施例1-2，在此不再赘述。89.在本实施例中，将能够抑制tgf-β1基因表达的sirna和能够抑制mir-21表达的反义rna联合使用在治疗肺纤维化相关疾病的产品中联合使用，可以从tgf-β1、mir-21两个靶点同时入手，进一步地提高肺纤维化的治疗效果。90.实施例491.在实施例1-3任意一项的基础上，本实施例提供一种rna在制备治疗肺纤维化相关疾病的产品中的应用，所述治疗肺纤维化相关疾病的产品中包括载体与rna，携带所述rna的载体进入宿主体内后能够自组装形成复合结构，对肺纤维化及其相关疾病进行靶向治疗，其中，所述rna包括能够抑制tgf-β1基因表达的sirna和/或能够抑制mir-21表达的反义rna。92.对于本实施例中“能够抑制tgf-β1基因表达的sirna”、“能够抑制mir-21表达的反义rna”等的具体内容可参见实施例1-2，在此不再赘述。93.此外，所述rna还可以包括能够抑制igfbp-5基因表达的sirna、能够抑制pdgf基因表达的sirna、能够抑制tnf-α基因表达的sirna、能够抑制nox4基因表达的sirna、能够抑制mmp7基因表达的sirna中的任意一种或几种。94.胰岛素样生长因子结合蛋白5(igfbp-5)属于igfbp蛋白家族成员，在肺纤维化中过表达。有研究表明igfbp-5可以通过直接诱导细胞外基质和促纤维化基因的表达来发挥其促纤维化活性。此外igfbp-5可能与其他生长因子发挥协同作用，驱动纤维化和组织的重塑。同时也有研究表明，igfbp-5可以诱导成纤维细胞产生胶原和纤维连接蛋白，并诱导成纤维细胞/肌成纤维细胞转分化。基于此，我们确定以下三种能够抑制igfbp-5基因表达的sirna，包括：5’‑tcattccgtacttgtccac-3’、5’‑ttgttcggattcctgtctc-3’、5’‑tagaatcctttgcggtcac-3’、或与上述sirna同源性大于80％的sirna序列，或编码上述sirna的核酸序列。95.血小板源性生长因子(pdgf)与肺纤维化的发病机制同样有关。目前已发现两个pdgf受体，分别为pdgf-rα和pdgf-rβ。在大鼠肺纤维化过程中，pdgf-rα水平在成纤维细胞增殖阶段显著上调。基于此，我们确定以下三种能够抑制pdgf基因表达的sirna，包括：5’‑acattgcggttattgcagc-3’、5’‑tgaagatcatcaaaggagc-3’、5’‑agatgagctttccaactcg-3’、或与上述sirna同源性大于80％的sirna序列，或编码上述sirna的核酸序列。96.肿瘤坏死因子(tnf)α水平的升高与许多肺部炎症疾病有关，包括间质肺纤维化(ipf)、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、急性肺损伤(ali)/急性呼吸窘迫综合征(ards)、结节病等。基于此，我们确定以下三种能够抑制tnf-α基因表达的sirna，包括：5’‑tatatgggctcataccagg-3’、5’‑tagaactgatgagagggag-3’、5’‑tttctgtgctcatggtgtc-3’、或与上述sirna同源性大于80％的sirna序列，或编码上述sirna的核酸序列。97.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamideadeninedinucleotidephosphateoxidase4,nox4)是nox家族的一个亚型，主要在呼吸系统的肺血管和肺内皮细胞中表达。tgf-β/smad2/3/nox4信号通路的正反馈对肺纤维化过程至关重要。肺纤维化中nox4在肺成纤维细胞中的表达增加，nox4sirna可改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的严重程度。基于此，我们确定以下三种能够抑制nox4基因表达的sirna，包括：5’‑ttaaacacaatcctaggcc-3’、5’‑ataatatactggccaggtc-3’、5’‑ttaagactaatgcagccag-3’、或与上述sirna同源性大于80％的sirna序列，或编码上述sirna的核酸序列。98.金属蛋白酶7(mmp-7)是特发性肺纤维化(ipf)的潜在疾病标志物之一，并且试验证明mmp-7水平均升高的ipf患者生存率较低。基于此，我们确定以下三种能够抑制mmp7基因表达的sirna，包括：5’‑attatgatatccgcagtcc-3’、5’‑tataacttctgaatgcctg-3’、5’‑ttatttccatgatgtaggg-3’、或与上述sirna同源性大于80％的sirna序列，或编码上述sirna的核酸序列。99.因此，在本实施例中tgf-β1基因表达的sirna和/或能够抑制mir-21表达的反义rna与能够抑制igfbp-5基因表达的sirna、能够抑制pdgf基因表达的sirna、能够抑制tnf-α基因表达的sirna、能够抑制nox4基因表达的sirna、能够抑制mmp7基因表达的sirna中的任意一种或几种联合使用，多种sirna之间可以相互配合，以从不同维度不同方面同时对肺纤维化相关疾病进行作用和治疗，从而增强治疗力度，进一步提高治疗效果。100.试验例1101.如图1所示，分别将tgf-β1的四种sirna(tgf-β1sirna-1、tgf-β1sirna-2、tgf-β1sirna-3、tgf-β1sirna-4)转染到细胞中，48小时后提取rna进行q-pcr实验。结果表明四种sirna都可以不同程度的下调tgf-β1的表达水平，其中，tgf-β1sirna-4对于tgf-β1表达水平的调节效果最为明显，因此，tgf-β1sirna-4调节tgf-β1的效果最优，其是四种tgf-β1sirna中的最优选择，故以下试验例中均选用tgf-β1sirna-4进行试验。102.试验例2103.为了检测antimir-21(抑制mir-21表达的反义rna)和tgf-β1sirna的干扰效率，我们首先构建antimir-21质粒和tgf-β1sirna质粒。104.我们利用限制性内切酶对对照质粒pcdna6.2进行处理，回收线性载体后，利用t4连接酶将antimir-21或tgf-β1sirna-4片段与质粒载体进行连接，得到的连接产物进行转化实验并涂布于抗性平板；第二天挑取单克隆，测序确定质粒序列的正确性，即得到antimir-21质粒和tgf-β1sirna质粒。105.将对照质粒、antimir-21质粒和tgf-β1sirna质粒分别转染到llc细胞，48小时后提取rna和蛋白。利用q-pcr技术和westernblot技术检测细胞中mir-21和tgf-β1的表达水平，并在l929细胞中重复上述实验，结果如图2-图3所示。106.其中，图2a为质粒骨架示意图，图2b为对照质粒和antimir-21质粒分别转染llc细胞，并利用q-pcr检测得到的mir-21的表达水平对比图，图2c为对照质粒和tgf-β1sirna质粒转染细胞后利用westernblot检测得到的tgf-β1蛋白水平对比图，图2d为图2c的westernblot定量图，图2e为利用q-pcr检测得到的tgf-β1mrna水平对比图。107.图3a为对照质粒和tgf-β1sirna质粒转染l929细胞后利用westernblot检测得到的tgf-β1蛋白水平对比图，图3b为图3a的westernblot定量图，图3c为利用q-pcr检测得到的的tgf-β1mrna水平对比图，图3d为对照质粒和antimir-21质粒转染细胞后利用q-pcr检测得到的mir-21表达水平对比图。108.以上图中，*表示p《0.05，***表示p《0.005。109.从图2-图3中可以看出，antimir-21质粒能够有效下调mir-21的水平；tgf-β1sirna质粒能够有效下调tgf-β1的mrna水平和蛋白水平。110.试验例3111.我们将对照质粒和antimir-21质粒通过尾静脉注射到小鼠体内，并取肝、血、肺提取rna并进行q-pcr实验，以检测注射对照质粒的小鼠和注射antimir-21质粒的小鼠肝脏、血清、肺部的相对antimir-21水平，结果如图4a-图4c所示，其中，ud表示undetectable，**表示p《0.01，***表示p《0.005。可以看出，与注射对照质粒的小鼠相比，注射antimir-21质粒的小鼠，其肝脏、血清、肺部中均可以检测到一定含量的antimir-21。112.我们将对照质粒和tgf-β1sirna质粒通过尾静脉注射到小鼠体内，并取肝、血、肺提取rna并进行q-pcr实验，以检测注射对照质粒的小鼠和注射tgf-β1sirna质粒的小鼠肝脏、血清、肺部的相对tgf-β1sirna水平，结果如图4d-图4f所示。可以看出，与注射对照质粒的小鼠相比，注射tgf-β1sirna质粒的小鼠，其肝脏、血清、肺部中均可以检测到一定含量的tgf-β1sirna。113.试验例4114.为了进一步确认antimir-21质粒及tgf-β1sirna质粒对肺纤维化的治疗效果，我们通过体内实验检测“通过尾静脉注射质粒后，体内自组装的antimir-21及tgf-β1sirna对小鼠肺纤维化的治疗作用”。115.具体地，首先通过雾化器给药博来霉素(5mg/kg)构建均匀的肺纤维化小鼠模型。之后将小鼠分为正常组(normal)，pbs组，对照质粒组(controlplasmid)，antimir-21质粒组(antimir-21plasmid，1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)，tgf-β1sirna质粒组(tgf-β1sirnaplasmid，1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)，antimir-21质粒+tgf-β1sirna质粒组(antimir-21+tgf-β1sirnaplasmid，10mg/kg)，阳性药组(吡非尼酮，pirfenidone，300mg/kg)。各组小鼠均治疗14天，2天一次，定期利用micro-ct检测小鼠肺纤维化程度，同时观测小鼠的体重、毛色、状态等。治疗结束后处死老鼠并通过羟脯氨酸水平、masson染色、he染色等指标检测质粒的治疗效果。116.如图5-图9所示，图中的ns表示p》0.05，*表示p《0.05，**表示p《0.01。结果显示，2周后治疗组的羟脯氨酸水平远低于对照组，从micro-ct的结果中可以看出，通过为期两周的治疗后，antimir-21质粒组，tgf-β1sirna质粒组，antimir-21质粒+tgf-β1sirna质粒组的肺纤维化情况明显优于对照组，高剂量组及联合用药组效果和阳性药组相当或略优于阳性药组。通过masson染色、he染色、免疫荧光等手段可以发现治疗组肺部的胶原含量远远低于对照组。以上各种指标都显示antimir-21质粒及tgf-β1sirna质粒都能十分有效的阻止肺纤维化的发生发展。同时结果也显示质粒有剂量依赖效应，且联合用药效果更佳。117.试验例5118.为了证明这些分布的sirna是否能够在体内有效抑制mir-21及tgf-β1的表达情况，我们构建好肺纤维化模型后将小鼠分为正常组(normal)，pbs组，对照质粒组(controlplasmid)，antimir-21质粒组(antimir-21plasmid，1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)，tgf-β1sirna质粒组(tgf-β1sirnaplasmid，1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)，antimir-21质粒+tgf-β1sirna质粒组(antimir-21+tgf-β1sirnaplasmid，10mg/kg)，阳性药组(吡非尼酮，pirfenidone，300mg/kg)。119.分别对各组小鼠治疗14天，2天一次，治疗结束后取小鼠肺组织提取rna和蛋白。进一步通过q-pcr及wesrernblot试验检测，结果如图10所示，图10a为每两天注射一次质粒，注射七次后利用westernblot检测得到的小鼠肺组织中tgf-β1蛋白水平对比图，图10b为图10a的westernblot定量图，图10c为每两天注射一次质粒，注射七次后利用q-pcr检测得到的小鼠肺组织中tgf-β1mrna水平对比图，图10d为每两天注射一次质粒，注射七次后利用q-pcr检测得到的小鼠肺组织中mir-21水平对比图。其中，**表示p《0.01，***表示p《0.005。120.上述结果表明，antimir-21质粒在体内可以有效降低肺组织中mir-21的表达水平，tgf-β1sirna质粒可以有效降低肺组织中tgf-β1的表达水平。121.试验例6122.为了检测该治疗手段的安全性，我们做了生物安全性检测。123.取正常小鼠分为三组，一组注射pbs，另一组注射antimir-21质粒，最后一组注射tgf-β1sirna质粒。取各组小鼠的肝、肺、肾、脾等组织包埋后进行he染色。124.结果如图11所示，可以看出注射质粒组小鼠的各个脏器均没有受到损伤，和正常小鼠无异。这表明尾静脉注射质粒不会造成组织损伤，安全性高，适于大规模的推广和应用。125.综上所述，本技术将特定的rna应用于治疗肺纤维化相关疾病的产品中，该产品安全性高，质量能够得到足够保障，能够大大提高肺纤维化的治疗效果，并且成本低廉，易于规模化量产，适于大规模推广与应用。126.在本文中，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等仅用于表示相关部分之间的相对位置关系，而非限定这些相关部分的绝对位置。127.在本文中，“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分，而非表示重要程度及顺序、以及互为存在的前提等。128.在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。129.除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。130.上面结合附图对本技术优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本技术并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术构思的前提下做出各种变化。当前第1页12当前第1页12