一种免疫相关转录因子Bach2的应用

本发明涉及一种免疫相关转录因子bach2的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

心血管疾病是中国人致死率最高的死亡原因，且其发病率呈逐年升高的趋势。另外，目前80％的猝死是心源性猝死，即心脏病导致心脏骤停引起的猝死。根据《中国心血管健康与疾病报告2019》，中国心血管病患者人数达到3.3亿，其中高血压患者达2.45亿，居于首位；其次分别为脑卒中1300万，冠心病1100万，心力衰竭450万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200万，占居民疾病死亡构成的40％以上，已成为重大的公共卫生问题，防治心血管疾病刻不容缓。

心血管疾病的危险因素有很多，比如：高血压、吸烟、血脂异常、糖尿病、超重、体力活动不足等，尽管目前大量的临床基础课题都在开展，如冠心病、心律失常、心力衰竭等，但心血管疾病的患病率和死亡率还是逐年增加，因此鉴定新的心血管疾病的诊断及治疗靶点尤其重要。

心脏主要是由心肌细胞和间质组成的，其中心肌细胞占心脏体积的75％，是心脏的主要成分。心肌细胞结构和功能的异常是引起心血管疾病的重要基础。例如，在高血压心脏中，心肌细胞直径增宽、肌节数量增多，表现为心肌肥大；在糖尿病模型中心肌细胞凋亡坏死，心肌间质大量增生，导致心脏纤维化；心律失常过程中katp通道敏感性下降，心肌细胞钙超载，最终导致缺氧、纤维化及心脏组织坏死。因此，心肌细胞功能正常与否是调控心血管疾病的关键。

btb与cnc同源基因2(btbandcnchomology2,bach2)是一种具有碱性亮氨酸拉链结构(bzipdomain)的转录因子，它能与小maf蛋白形成异二聚体并与其dna上特异性序列maf识别元件(mafrecognitionelements,mare)结合，抑制下游基因的表达，参与多种细胞转录调控过程。bach2主要在t细胞、b细胞、神经细胞等细胞中表达，但是近来，研究者发现bach2在心脏、肠中也有表达。目前的研究多集中在bach2与免疫系统之间的相关性，bach2可通过多步骤调节免疫相关疾病、参与b淋巴细胞和t淋巴细胞的发育，调控淋巴细胞的周期。bach2是t淋巴细胞维持免疫稳态的调节因子，与多种免疫相关性疾病的发生发展密切相关。bach2表达异常不能正常调控b细胞的发育和分化，使b细胞向浆细胞异常分化，初始t细胞持续向效应t细胞分化并释放ifn-γ、il-6等炎性细胞因子。另一方面，bach2表达异常可抑制treg生成和功能，使其不能很好的发挥免疫抑制的作用，因此，bach2表达异常最终可导致自身抗体的大量产生并与自身抗原结合形成免疫复合物沉积，促进自身免疫性疾病的发生。在多发性硬化患者外周血中，bach2表达降低，影响了cd4+t细胞的功能；在炎性肠病中，bach2可通过影响抗体类别转换而加剧疾病发生发展。然而bach2在心肌细胞中的作用未曾见过报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为解决一种免疫相关转录因子bach2在保护心肌细胞的应用中的技术问题。

为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种免疫相关转录因子bach2在保护心肌细胞用的药物制备中的应用。

本发明提供一种免疫相关转录因子bach2在心血管疾病的治疗和预防性的药物制备中的应用。

优选地，所述心血管疾病包括高血压、糖尿病心肌损伤、药物性心肌损伤、心肌梗死和心律失常。

优选地，所述的一种免疫相关转录因子bach2在保护心肌细胞用的药物制备中的应用；所述药物用于促进免疫相关转录因子bach2的表达。

优选地，所述的一种免疫相关转录因子bach2在心血管疾病的治疗和预防性的药物制备中的应用，所述药物用于促进免疫相关转录因子bach2的表达。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了免疫相关转录因子bach2在保护心肌细胞中的具体应用，为临床上高血压、糖尿病心肌损伤、药物性心肌损伤等疾病提供了治疗靶点。本发明提供了一种免疫相关转录因子bach2在保护心肌细胞用的药物制备中的应用和在心血管疾病的治疗和预防性的药物制备中的应用，为心血管类疾病的诊断及治疗提供了新的靶点和新的路径。

附图说明

图1为高血压模型中bach2可以改善心肌肥厚及心衰指标的照片和示意图。其中图a显示过表达bach2后心肌肥厚得以缓解；图b-图e为在心肌肥厚模型中，lv-s及lv-d较正常组上升，而ef及fs较正常组下降，过表达bach2后明显逆转了由tac造成的心肌细胞损伤。

图2为高血压模型中随着iso(异丙肾上腺素)刺激的时间的延长，bach2的表达的趋势，以及过表达bach2后，心肌肥厚及心衰的指标anp、bnp及myh7的变化图。

图3为糖尿病心肌损伤模型中bach2可显著改善糖尿病引起的心肌损伤，而敲除bach2则加剧了糖尿病心肌损伤的组织切片图和指标图。

其中a图为糖尿病小鼠心脏原位过表达bach2改善了糖尿病小鼠心脏的纤维化，而在糖尿病小鼠心脏原位敲除bach2加剧了糖尿病小鼠心脏的纤维化的组织切片图；b图显示过表达bach2改善心脏的射血分数(ef)；c图显示过表达bach2改善左室缩短分数(fs)；d图显示原位敲除bach2恶化了心脏的射血分数(ef)；e图显示原位敲除bach2恶化了左室缩短分数(fs)。

图4为糖尿病心肌损伤模型的人体样本中，bach2的蛋白及rna表达及与心肌损伤的程度相关的指标变化图；

其中a图为rna水平上糖尿病患者心脏组织中bach2的表达降低，但是心肌损伤的指标如mlkl及tgfβ1等则表达上升；b图和c图为蛋白水平糖尿病患者心脏组织中bach2的表达降低，但是心肌损伤的指标则表达上升；d图为在左心室、室间隔和右心室，bach2的蛋白表达均显著下调。

图5为药物性心肌损伤模型中，通过体外干预bach2(质粒转染过表达)得到的心肌损伤程度相关的指标变化图。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：

本发明提供一种免疫相关转录因子bach2在保护心肌细胞用的药物制备中的应用。

本发明提供一种免疫相关转录因子bach2在心血管疾病的治疗和预防性的药物制备中的应用。

上述心血管疾病包括高血压、糖尿病心肌损伤、药物性心肌损伤、心肌梗死和心律失常。

上述的一种免疫相关转录因子bach2在保护心肌细胞用的药物制备中的应用；所述的药物是用于促进免疫相关转录因子bach2的表达。

上述的一种免疫相关转录因子bach2在心血管疾病的治疗和预防性的药物制备中的应用，所述的药物是用于促进免疫相关转录因子bach2的表达。

本发明是在基础实验的基础上衍生而来的，涉及转录因子bach2在保护心肌细胞中的应用，包括多种心血管疾病模型，如高血压、糖尿病心肌损伤、药物性心肌损伤及心肌梗死等。

a)高血压模型：采用c57bl/6j雄性小鼠6周进行主动脉弓缩窄手术，造成心肌肥厚及心衰模型。在此基础上心脏原位过表达bach2，可观察到bach2可以改善心肌肥厚及心衰等指标。在细胞模型中亦证实在心肌肥厚模型不同时间点，bach2的表达先上升后下降，对心肌细胞起重要保护作用。人体心肌样本中也证实bach2的表达与高血压之间的相关性。

b)糖尿病心肌损伤模型：普通c57小鼠经过高脂喂养四周后，腹腔小剂量注射链脲霉素(40mg/kg)，隔天注射，共三次；造模完成后连续两天检测随机血糖均高于16.7mmol/l便表示造模成功。在糖尿病小鼠中心脏原位过表达bach2可发现bach2可显著改善糖尿病引起的心肌损伤。细胞模型中亦证实bach2能够缓解由高糖引起的心肌细胞损伤；在人体心脏样本中检测到bach2在糖尿病心脏中表达降低，与血糖等指标呈负相关。

c)药物性心肌损伤模型：研究了抗精神病药及抗肿瘤药物的毒副作用。首先在普通c57小鼠中隔天注射抗肿瘤药物，造成心肌损伤后进行心脏原位过表达bach2，观察到小鼠的心肌损伤症状得以缓解。

d)心肌梗死：小鼠造心肌梗死模型(开胸，充分暴露左冠状动脉前降支，于左心耳下缘进针，缝线穿过lad，完成阻断lad血流)，在此基础上过表达bach2发现心肌梗死的症状得以缓解。

实施例1

高血压模型：采用c57bl/6j雄性小鼠6周进行主动脉弓缩窄手术，造成心肌肥厚及心衰模型。在此基础上心脏原位过表达bach2，可观察到bach2可以改善心肌肥厚及心衰等指标(如图1)。采用c57bl/6j雄性小鼠6周分为四组：假手术组(con-sham)、tac模型组(con-tac)、假手术+bach2过表达组(oe-sham)、tac模型+bach2过表达组(oe-tac)，每组8只小鼠。tac模型为主动脉弓缩窄手术，造成心肌肥厚及心衰模型，在此基础上心脏原位过表达bach2(通过心脏原位注射aav9-bach2)，在低倍镜下发现con-tac组小鼠心脏呈现出明显的心肌肥厚，bach2可以改善这一改变(如图1中a图)。wga染色可以将心肌细胞膜染出，图1中a图可观察到由tac模型导致的心肌细胞肥大被bach2所显著抑制(绿色荧光cytoflammafluro)。左心室收缩末期内径(leftventricularendsystolicdimension，lv-s)、左心室舒张末期内径(leftventricularenddiastolicdimension，lv-d)是衡量心脏功能的重要指标，图1中b图和c图显示模型组lv-s及lv-d显著升高，bach2过表达后几乎恢复到正常水平。左室短轴缩短率(fractionalshortening，fs)及射血分数(ejectionfraction，ef)是心脏功能的直接指标，图1中d图和e图可以发现模型组fs及ef水平均显著下降，而过表达bach2能够逆转tac模型造成的心肌损伤。

实验结果表明：tac模型能够显著诱导心肌肥厚，心肌细胞体积增大，但是过表达bach2后心肌肥厚的指标得以缓解(如图1中a图)。在心肌肥厚模型中，lv-s及lv-d较正常组上升，而ef及fs较正常组下降，过表达bach2后明显逆转了由tac造成的心肌细胞损伤(图1中b图-e图)。图1中标识：h&e：(haematoxylin-eosinstaining,苏木素-伊红染色)；wga：(wheatgermagglutininstaining,麦胚凝集素染色)；lv-d:(leftventricularenddiastolicdimension,左心室舒张末期内径)；lv-s:(leftventricularendsystolicdimension,左心室收缩末期内径)；fs:(fractionshortening,左心室短轴缩短率)；ef：(ejectionfraction,射血分数)。

实施例2

在高血压模型中随着iso(isoprenaline,异丙肾上腺素)刺激的时间的延长，发现bach2的表达呈现早期上升晚期下降的趋势。另外在乳鼠原代心肌细胞中证实过表达bach2后，心肌肥厚及心衰的指标anp(atriopeptin,心钠素)、bnp(brainnatriureticpeptide,脑钠肽)及myh7(myosineheavychain7,肌浆球蛋白重链7)等均显著下降，进一步证实bach2能够保护心脏免受高血压的损伤(如图2)。

实施例2结果表明：用iso刺激乳鼠原代心肌细胞不同的时间发现bach2的表达在6h时显著上升，随后呈现下降趋势(如图2中a图和b图)。在乳鼠原代心肌细胞中过表达bach2则发现bach2显著抑制了心肌肥厚及心衰的指标anp、bnp及myh7等(如图2中c图和d图)。图2中图标：iso：(isoprenaline,异丙肾上腺素)；anp:(atriopeptin,心钠素)；bnp:(rainnatriureticpeptide,脑钠肽)；myh7:(myosineheavychain7,肌浆球蛋白重链7)；β-actin：(β-肌动蛋白)；erk：(extracellularsignalregulatedkinase，细胞外信号调节激酶)；actinin:(辅肌动蛋白)。图c中的con代表空白对照组，con+iso代表iso处理造模组，b2oe+iso代表bach2过表达后加iso处理组。图d中bach2-oe代表bach2过表达，iso(min)代表用异丙肾上腺素处理细胞不同的时间。

实施例3

糖尿病心肌损伤模型：普通c57小鼠经过高脂喂养四周后，腹腔小剂量注射链脲霉素(40mg/kg)，隔天注射，共三次；造模完成后连续两天检测随机血糖均高于16.7mmol/l便表示造模成功。建模成功的糖尿病小鼠随机分为四组：vehicle-1组(心脏原位注射过表达的对照腺相关病毒aav9-con)、bach2组(心脏原位注射bach2过表达的腺相关病毒aav9-bach2)、vehicle-2组(心脏原位注射敲除的对照腺相关病毒aav9-shnc)、shbach2组(心脏原位注射bach2敲除的腺相关病毒aav9-shbach2)，每组小鼠10只。在糖尿病小鼠中心脏原位过表达bach2可发现bach2可显著改善糖尿病引起的心肌损伤，而敲除bach2则加剧了糖尿病心肌损伤(如图3)。

实施例3结果表明：在糖尿病小鼠心脏原位过表达bach2与对照组相比(vehicle-1组)改善了糖尿病小鼠心脏的纤维化(如图3中a图)及心脏的射血分数(ef)(如图3中b图)、左室缩短分数(fs)(如图3中c图)。相反的，在糖尿病小鼠心脏原位敲除bach2与对照组(vehicle-2组)小鼠相比加剧了糖尿病小鼠心脏的纤维化(如图3中a图)及心脏的射血分数(ef)(如图3中d图)、左室缩短分数(fs)(如图3中e图)。图3中图标为：h&e：(haematoxylin-eosinstaining,苏木素-伊红染色)；siriusred：(天狼星红染色)；ihc：(immunohistochemistrystaining,免疫组织化学染色)；ef：(ejectionfraction,射血分数)；fs：(fractionshortening,左心室短轴缩短率)。

实施例4

在人体样本中，检测发现bach2的蛋白及rna水平在糖尿病心肌损伤模型中均表达下降，且与心肌损伤的程度呈负相关(如图4)。发明人收集了7例对照心脏组织(没有心血管病的死者)和5例糖尿病(diabeticmellitus,dm)死者的心脏组织，提取rna及蛋白，检测bach2的表达及心肌损伤的水平，结果显示bach2的表达在糖尿病(dm)心脏中明显下调，而心肌损伤则显著增加，如tgfβ1(transforminggrowthfactorβ1，转化生长因子β1)、rip1(receptor-interactingproteinkinase1，受体相互作用蛋白激酶1)、rip3(receptor-interactingproteinkinase3，受体相互作用蛋白激酶3)及mlkl(mixedlineagekinasedomainlike,混合谱系激酶结构域样蛋白)(如图4中a图和b图)。另外收集了对照及糖尿病死者的心脏石蜡组织各14例，每一例均包括左心室(lv)、室间隔(ivs)及右心室(rv)，免疫组织化学染色统计bach2的表达。

结果表明：rna水平上糖尿病患者心脏组织中bach2的表达是降低的，但是心肌损伤的指标如mlkl及tgfβ1等则表达上升(如图4中a图)。蛋白水平中呈现相同的趋势(如图4中b图和c图)。统计分析发现不论在左心室、室间隔还是右心室，bach2的蛋白表达均显著下调(如图4中d图)。图4中图标：dm：(diabeticmellitus,糖尿病)；tgfβ1：(transforminggrowthfactorβ1，转化生长因子β1)；rip1：(receptor-interactingproteinkinase1，受体相互作用蛋白激酶1)；rip3：(receptor-interactingproteinkinase3，受体相互作用蛋白激酶3)；mlkl：(mixedlineagekinasedomainlike,混合谱系激酶结构域样蛋白)；lv：(leftventricle,左心室)；ivs：(interventricularseptal，室间隔)；rv：(rightventricle，右心室)。

实施例5

药物性心肌损伤模型：研究了抗精神病药及抗肿瘤药物的毒副作用，其中ibi308是一种靶向pd-1的抗肿瘤药物，原名为信迪利单抗(sintilimab)，在我们的实验中用ibi308进行心肌细胞药物毒副作用的造模。体外培养小鼠及人的心肌细胞hl-1及ac16，分离小鼠原代心肌细胞，通过药物诱导产生心肌损伤模型，在体外干预bach2(质粒转染过表达)，发现bach2能显著改善药物性心肌损伤(如图5)。结果表明：体外过表达bach2可以减缓抗肿瘤药物引起的心肌细胞焦亡，从而保护心脏组织，减轻症状。

实验中con+higg4组:为对照组用对照免疫球蛋白处理；con+ibi308组:为对照组用ibi308处理；b2+igg4组:为bach2过表达用对照免疫球蛋白处理组；b2+ibi308组：为bach2过表达用ibi308处理组。图5中图标：nlrp3：(nucleotide-bindingoligomerizationdomain,leucine-richrepeatandpyrindomain-containing3，核苷酸结合寡聚结构域)；asc：(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingacard，凋亡相关颗粒样蛋白)；gsdmd：(gasdermind蛋白)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。