一种超声响应性复合水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及超声响应性复合水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.避孕是比较重要且研究较少的热点问题，尤其是男性避孕，现有的男性避孕方式如输精管结扎术和避孕套等仍不能取得令人满意的效果。一方面，输精管结扎术是一种永久性避孕方式，可逆性差，即便可以通过手术进行复通，但是，术后效果多不如意；另一方面，避孕套是性生活中男性应用最为广泛的避孕工具，但是其造成的性生活质量差，令很多男性使用意愿差，即便使用，方法不当也容易破损，致使避孕失败，从而造成意外怀孕率升高；不仅如此，女性避孕也同样存在手术复通，可逆性差的问题。因此，鉴于避孕面临的诸多问题，探索一种安全有效、接受性高并可根据人们的意愿随时恢复生育能力的可逆性避孕新方法已经成为了临床上迫切需要解决的实际问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种超声响应性复合水凝胶及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，实现对输精管/输卵管的有效封堵，并在体外超声作用后实现输精管/输卵管的再通，保证良好的可逆避孕效果。
4.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
5.本发明的目的之一是提供一种超声响应性复合水凝胶，所述水凝胶是由海藻酸钠与缩硫酮乙二胺交联后，加入二氧化钛，然后与氯化钙反应得到。
6.本发明的目的之二是提供一种上述超声响应性复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将海藻酸钠水溶液与缩硫酮乙二胺混合，反应得sa
‑
tk溶液；
8.(2)向sa
‑
tk溶液中加入二氧化钛，反应得到sa
‑
tk@tio2溶液；
9.(3)将sa
‑
tk@tio2溶液与氯化钙混合，得到所述超声响应性复合水凝胶。
10.海藻酸钠(sodium alginate，sa)是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，是一种天然大分子，具有良好的组织亲和力，对周围组织几乎没有刺激性，其分子由β
‑
d
‑
甘露糖醛酸(β
‑
d
‑
mannuronic，m)和α
‑
l
‑
古洛糖醛酸(α
‑
l
‑
guluronic，g)按(1
→
4)键连接而成。因其分子中含有
‑
coo
‑
基团，当向海藻酸钠的水溶液中添加钙离子时，g单元中的na
+
会与这些二价阳离子发生交换，使海藻酸钠溶液向凝胶转变。形成一种时间可控，可注射的白色均质的水凝胶。它比常规合成的生物材料更接近活体组织，表面不易与细胞和蛋白质粘连，在性质上类似于细胞外基质部分。通过各种结构改造，海藻酸钠水凝胶可具有更多的功能并进行临床转化应用。
11.在声催化领域，纳米tio2作为声催化剂具有稳定、高效、无毒及廉价等优点，但纳米tio2的声响应范围较窄,活性成分损失大，不利于超声的应用。对纳米tio2进行表面改性,
可增大声波吸收范围，提高声催化效率，此外，利用生物相容性较好的聚合物对纳米tio2表面进行修饰，可以增强其在体内的稳定性。本发明首先制备了生物相容性好、胶体稳定性高的功能性高分子聚合物，并以这些聚合物为表面改性剂，对声敏剂tio2进行表面改性，实现水凝胶的可逆降解。
12.进一步地，所述海藻酸钠水溶液的浓度为1.0％
‑
5.0％；所述缩硫酮乙二胺与海藻酸钠的摩尔比为500:1。
13.进一步地，所述二氧化钛与sa
‑
tk溶液的质量体积比为(1.0
‑
2.0)mg:1000ul。
14.进一步地，所述氯化钙为水溶液形式，浓度为10
‑
50mg/ml；所述sa
‑
tk@tio2溶液与氯化钙水溶液的体积比为1:1。
15.进一步地，所述氯化钙水溶液的浓度为10
‑
30mg/ml。
16.进一步地，在海藻酸钠水溶液与缩硫酮乙二胺混合前，还包括向海藻酸钠水溶液中加入羧基活化剂、多肽缩合剂进行反应的步骤。
17.所述羧基活化剂为1
‑
乙基
‑
(3,3
’‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)；
18.所述多肽缩合剂为n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)。
19.进一步地，所述海藻酸钠与羧基活化剂、多肽缩合剂的摩尔比为2:1:1；反应时间不短于10min。
20.本发明的目的之三是提供一种上述超声响应性复合水凝胶在制备节育药物中的应用。
21.进一步地，所述节育药物为可逆性节育药物。
22.本发明公开了以下技术效果：
23.本发明公开了一种可逆避孕的超声可降解复合水凝胶，所述的复合水凝胶主要由海藻酸钠(sa)、缩硫酮乙二胺(tk)、氯化钙(cacl2)以及二氧化钛(tio2)纳米颗粒四个组分构成，通过sa与tk之间的共价交联和sa与ca
2+
的离子交联共同维持水凝胶结构，实现阻塞输精管/输卵管的效果，同时具有成胶以及远程无创降解功能，能够在输精管/输卵管处原位形成富有弹性的水凝胶结构；复合水凝胶分子间的缩硫酮键具有活性氧切割响应功能，凝胶中复合的tio2纳米颗粒在超声波的作用下可以产生大量活性氧分子，促使tk分子的缩硫酮键断裂，从而破坏水凝胶的离子交联，打破凝胶的整体平衡，最终转化为溶液，经输精管/输卵管排出体外，实现无创输精管/输卵管再通并恢复生育能力的目的，实现了在输精管/输卵管原位快速形成超声可降解水凝胶，进行一种可逆的输精管/输卵管阻塞避孕。
24.本发明在海藻酸钠的基础之上接枝功能性官能基团，构建生物相容性更好的功能性高分子聚合物，从而实现安全、无创可逆的高效避孕。
25.本发明首先制备了生物相容性好、胶体稳定性高的功能性高分子聚合物，并以这些聚合物为表面改性剂，实现对声敏剂tio2的表面改性，实现了水凝胶的可逆降解，进一步扩大了纳米tio2在生物医学领域的应用。
26.本发明能够实现复合水凝胶长效稳定滞留在输精管/输卵管中，持续堵塞输精管/输卵管，形成水凝胶阻碍壁垒，从而阻止精子/卵子通过输精管/输卵管排出，实现有效避孕，特别是随后给予体外超声波处理后水凝胶可原位降解，从自然管腔排出体外，从而恢复生育功能，真正实现一种无创可逆的避孕策略。同时，该超声响应性水凝胶在体内亦不会产生明显的副作用，能够在体内稳定存在，能起到持久避孕的效果，是避孕的理想材料。
27.本发明的超声响应性复合水凝胶不仅可用于无创可逆恢复男性/女性生育能力，对于雄性、雌性动物的可逆避孕同样适用。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为本发明超声响应性复合水凝胶的设计原理图；
30.图2为复合水凝胶材料超声产生活性氧的荧光测定结果；
31.图3为体外模拟水凝胶超声降解功能的效果；
32.图4为各组凝胶质量定量变化曲线图；
33.图5为将实施例1的凝胶组成成分、pbs缓冲液以及sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2凝胶超声降解前后的成分，分别处理细胞，并在显微镜下对细胞进行观察；
34.图6为利用cck8实验验证实施例1的凝胶组成成分以及sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2凝胶超声降解前后的成分对细胞的生物毒性结果；
35.图7为雌性sd大鼠的发情周期以及雌雄合笼后的交配监测；
36.图8为在动物水平上水凝胶长效稳定封堵输精管并在超声作用下可自清除并恢复生育能力的示意图；
37.图9动物水平上验证的水凝胶长效稳定封堵输精管并在超声作用下可自清除并恢复生育能力的效果图。
具体实施方式
38.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
39.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
40.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
41.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
42.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即
意指包含但不限于。
43.图1为本发明超声响应性复合水凝胶的设计原理图。
44.本发明的超声响应性复合水凝胶主要由四种组分组成，分别是海藻酸钠(sa)、缩硫酮乙二胺(tk)、氯化钙(cacl2)以及二氧化钛(tio2)纳米颗粒。通过sa与tk之间的共价交联和sa与ca
2+
的离子交联共同维持水凝胶结构，阻塞输精管/输卵管，实现节育功能。复合水凝胶分子间的缩硫酮键具有活性氧切割响应功能，经过体外超声作用后，其中的超声响应分子tio2纳米颗粒产生大量活性氧，促使缩硫酮键断裂，凝胶解散，实现无创输精管/输卵管再通，恢复生育能力。
45.首先，sa与tk分子在体外通过分子间共价交联形成一种介于流体和凝胶状态之间的sa
‑
tk，随后将tio2纳米颗粒均匀混入sa
‑
tk中得到sa
‑
tk@tio2，随后，sa
‑
tk@tio2与cacl2溶液同时原位注射到输精管中，迅速形成水凝胶，阻断输精管，阻止精子，有效实现避孕。
46.本发明的复合水凝胶在多种分子共同存在下，保持稳定的凝胶状态。
47.本发明的超声响应性复合水凝胶用于治疗时，可原位注射形成水凝胶，将输精管/输卵管堵塞，进而阻止精子/卵子排出实现避孕。随后通过体外超声波处理后，凝胶降解自行排出体外，可实现无创可逆恢复生育能力的目的。
48.本发明优选的给药方式有原位注射，尿路逆行灌注；进一步优选为原位注射给药。
49.一、超声响应性复合水凝胶的制备
50.实施例1
51.一种超声响应性复合水凝胶，制备方法包括以下步骤：
52.(1)称量海藻酸钠(sa)并投入到装有蒸馏水的血清瓶中，配制成均匀的1.0％(w/v)sa溶液；
53.(2)以sa单体与1
‑
乙基
‑
(3,3'
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)摩尔比2∶2∶1的剂量，向反应体系中加入edc、nhs，搅拌10min以上，从而活化sa分子上的羧基，催化并稳定sa与缩硫酮乙二胺(tk)反应过程；
54.(3)以sa单体与tk分子摩尔比500：1的剂量向溶液中加入tk分子并持续搅拌至少6h，制成sa
‑
tk溶液，
‑
20℃冷藏备用；
55.sa
‑
tk的结构如式1所示：
[0056][0057]
(4)室温下，向sa
‑
tk溶液中以2.0mg:1000ul比例加入tio2纳米颗粒并持续搅拌10min以上，混合均匀，配制成sa
‑
tk@tio2溶液，
‑
20℃冷藏备用；
[0058]
(5)室温下，将sa
‑
tk@tio2与cacl2水溶液(浓度为30mg/ml)按照1:1的体积比混合，得到超声响应性复合水凝胶sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2(式2)。
[0059][0060]
实施例2
[0061]
一种超声响应性复合水凝胶，制备方法包括以下步骤：
[0062]
(1)称量海藻酸钠(sa)并投入到装有蒸馏水的血清瓶中，配制成均匀的5.0％(w/v)sa溶液；
[0063]
(2)以sa单体与1
‑
乙基
‑
(3,3'
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)、n
‑
羟基琥珀酰
亚胺(nhs)摩尔比2∶2∶1的剂量，向反应体系中加入edc、nhs，搅拌10min以上，从而活化sa分子上的羧基，催化并稳定sa与缩硫酮乙二胺(tk)反应过程；
[0064]
(3)以sa单体与tk分子摩尔比500：1的剂量向溶液中加入tk分子并持续搅拌至少6h，制成sa
‑
tk溶液，
‑
20℃冷藏备用；
[0065]
(4)室温下，向sa
‑
tk溶液中以1.5mg:1000ul比例加入tio2纳米颗粒并持续搅拌10min以上，混合均匀，配制成sa
‑
tk@tio2溶液，
‑
20℃冷藏备用；
[0066]
(5)室温下，将sa
‑
tk@tio2与cacl2水溶液(50mg/ml)按照1:1的体积比混合，得到超声响应性复合水凝胶sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2。
[0067]
实施例3
[0068]
一种超声响应性复合水凝胶，制备方法包括以下步骤：
[0069]
(1)称量海藻酸钠(sa)并投入到装有蒸馏水的血清瓶中，配制成均匀的2.0％(w/v)sa溶液；
[0070]
(2)以sa单体与1
‑
乙基
‑
(3,3'
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)摩尔比2∶2∶1的剂量，向反应体系中加入edc、nhs，搅拌10min以上，从而活化sa分子上的羧基，催化并稳定sa与缩硫酮乙二胺(tk)反应过程；
[0071]
(3)以sa单体与tk分子摩尔比500：1的剂量向溶液中加入tk分子并持续搅拌至少6h，制成sa
‑
tk溶液，
‑
20℃冷藏备用；
[0072]
(4)室温下，向sa
‑
tk溶液中以1.0mg:1000ul比例加入tio2纳米颗粒并持续搅拌10min以上，混合均匀，配制成sa
‑
tk@tio2溶液，
‑
20℃冷藏备用；
[0073]
(5)室温下，将sa
‑
tk@tio2与cacl2水溶液(10mg/ml)按照1:1的体积比混合，得到超声响应性复合水凝胶sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2。
[0074]
二.材料超声产生活性氧功能验证
[0075]
利用荧光分光光度计和活性氧检测探针dcfh对凝胶在超声作用下激发活性氧功能进行验证。
[0076]
dcfh本身没有荧光，然而在活性氧存在的条件下，其可被氧化成为荧光物质dcf，其荧光强度与活性氧水平成正比。通过检测dcf的荧光信号可以得到活性氧水平。
[0077]
具体操作方法：在小烧杯中将dcfh探针溶液与实施例1制备的复合水凝胶sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2混合后，给予混合溶液2.25w/cm2功率的超声波处理，实验结果表明，随着超声时间延长，溶液的荧光强度逐渐升高，证明了复合水凝胶能够在超声刺激下逐渐产生活性氧分子，并且随着超声时间延长活性氧生成速度逐渐加快(图2)。最终证明了复合水凝胶可以在超声刺激下生成活性氧。
[0078]
三、体外模拟凝胶超声降解功能
[0079]
为了验证超声无创恢复生育能力策略的可行性，进行体外模拟实验。将sa
‑
tk@tio2与cacl2溶液注射到聚乙烯塑胶软管中，使其在管内形成水凝胶。然后对其中一组给予2.25w/cm2功率的超声波处理，超声每持续5min后停止30s进行凝胶状态观察以及称量剩余凝胶质量。随着超声过程延长，凝胶逐渐降解，30min后凝胶全部降解，而对照组不给予超声，凝胶无明显变化。
[0080]
具体操作方法：
[0081]
以聚乙烯塑胶软管模拟输精管，在体外验证超声无创恢复生育策略。取实施例1制
备的sa
‑
tk@tio2与cacl2水溶液(浓度30mg/ml)以1:1的体积比同时注入聚乙烯塑胶软管中，静置3min，凝胶形成并稳定滞留在管中。随后，实验组(ultrasound+)使用2.25w/cm2功率的超声波处理，对照组(ultrasound
‑
)置于室温中不予处理，随着超声过程延长，实验组凝胶逐渐降解，30min后凝胶全部降解，而对照组凝胶无明显变化(图3)，凝胶剩余质量时间曲线见图4。
[0082]
四、水凝胶在细胞水平上的安全性验证
[0083]
实验所选细胞为人脐静脉内皮细胞huvec以及小鼠成纤维细胞l929细胞系。将实施例1的凝胶组成成分、pbs缓冲液以及sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2凝胶超声降解前后的成分，分别处理细胞，并在显微镜下对细胞进行观察，发现各组分对细胞生长均无明显影响(图5)。图5中gel(
‑
)为未经超声处理的sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2凝胶组，gel(+)为经超声处理的sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2凝胶组。
[0084]
cck8实验验证了实施例1的凝胶组成成分以及sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2凝胶超声降解前后的成分对细胞生长无明显毒性(图6)。图6中gel(
‑
)为未经超声处理的sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2凝胶组，gel(+)为经超声处理的sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2凝胶组。
[0085]
以上所有实验共同证明了水凝胶以及其各组分对细胞安全性良好。
[0086]
五、在动物水平上水凝胶实现了长效稳定避孕和远程无创超声自清除恢复生育能力的功能
[0087]
进行动物实验，进一步验证水凝胶长效稳定避孕效果以及远程无创超声自清除恢复生育能力的效果。
[0088]
实验组将实施例1制备的sa
‑
tk@tio2与cacl2水溶液(浓度为30mg/ml)以1:1的体积比原位注射到大鼠输精管中，对照组1将pbs注射到大鼠输精管中，对照组2给大鼠实行输精管结扎手术，处理完毕后6天将各雄鼠与雌鼠合笼，观察并记录其性行为(图7)。对照组1中，在合笼后18天，有小鼠出生，而实验组第54天时仍然没有新生鼠，证明了水凝胶具有稳定的避孕效果，随后第54天时，在体外给予超声处理大鼠8min后，继续观察大鼠性行为，结果超声处理后18天，实验组也出现了新生鼠。证明了水凝胶在超声处理后成功降解，输精管再通，大鼠恢复了生育能力。而对照组2进行输精管结扎术组则始终没有新生鼠。图8为在动物水平上水凝胶长效稳定封堵输精管并在超声作用下可自清除并恢复生育能力的示意图；图9为动物水平上验证了试验组水凝胶长效稳定封堵输精管，并在超声作用下可自清除并恢复生育能力的效果图。
[0089]
以上结果均证明复合水凝胶(sa
‑
tk
‑
ca
2+
@tio2)具有长效稳定的避孕效果，并且具有远程无创超声清除能力，实现无创恢复生育功能的效果。
[0090]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。