一种急性肾损伤至慢性肾脏病的动物模型构建方法与流程

本发明涉及医学领域，具体是指一种急性肾损伤至慢性肾脏病的动物模型构建方法。

背景技术：

急性肾损伤(aki)是指由多种原因导致的肾功能急速下降的常见急危重症。而急性肾损伤后慢性肾脏病的发生机会会显著上升并进展至终末期肾病，具流行病学研究表明我国慢性肾脏病(ckd)的发病率为10.8％。近年来急性肾损伤的发生率逐年上升。肾脏是由丰富的微血管网构成的，是机体能耗最高的器官之一。无论急性肾损伤的基础病因如何，毫无例外都是首先引起血管内皮损伤并启动炎症等效应，进而导致肾脏局部微循环障碍。因此肾脏缺血再灌注损伤是各种原因导致急性肾损伤的共同的病理生理基础，也一直是急性肾损伤及后期慢性肾脏病研究的关键科学问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是目前肾脏缺血再灌注致急性肾损伤后慢性肾脏病动物模型的构建方案较多，但普遍看来，步骤较为繁琐，死亡率较高，成模率参差不齐，多采用单侧肾造模以至于同临床的契合度不佳。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种急性肾损伤至慢性肾脏病的动物模型构建方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、实验准备，实验器材包括3％戊巴比妥钠、1ml注射器、高压消毒手术器械、胶皮手套、3-0手术缝合线、75％酒精、医用碘伏、生理盐水、无菌棉签、泡沫板手术台；

步骤二、选取20-25g左右小鼠(c57，icr均可)，术前一晚禁食，不禁水；

步骤三、备好实验器械及耗材，放至实验台，空调调至27摄氏度，电热毯打开，紫外线照台30分钟；

步骤四、3％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，小鼠取俯卧位固定于泡沫板(不易导热保暖性较好)手术台上，背部去毛备皮，碘伏消毒；

步骤五、沿小鼠背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5-1cm处剪开皮肤(u型切口)，并用碘伏消毒，在左右肾脏竖脊肌外侧缘剪开筋膜0.5cm，使用无齿弯镊及无齿弯钳自切口沿竖脊肌外侧缘由浅入深，小心分离竖脊肌与附着其外侧缘的脂肪，即可暴露出两侧肾脏的肾动静脉；用自制血管拉钩小心勾选出两侧肾脏血管并留置拉钩于切口处，持右侧血管拉钩向上轻提右侧肾脏血管并迅速用动脉夹夹闭右侧肾动静脉，左侧肾血管夹闭方式同右侧；肾脏血管夹闭后即可见到双侧肾脏由鲜红变黑紫，镊子整理切口并用碘伏消毒皮肤覆盖创口，生理盐水浸湿纱布后平铺于小鼠背部，使其保持充分水化，防止切口干燥，将小鼠置于电热毯上，维持小鼠术中体温；

步骤六、肾脏血管夹闭50分钟后取小鼠于泡沫板上，先右后左依次松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况；

步骤七、分两层(皮下筋膜层及皮肤)缝合切口，并注意碘伏消毒；

步骤八、待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具并放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录，术后1-2天为急性肾损伤期，继续饲养1个月以上即可发展至慢性肾脏病阶段。

本发明与现有技术相比的优点在于：步骤清晰合理，实验数据、手术方式和模型构建完整，步骤较现有方法更加简单易懂，提高了整体普适性，降低了样本死亡率，成模率高且质量优秀，满足临床科研需要。

作为改进，步骤一的高压消毒手术器械包括剪刀(眼科剪2把，弯剪1把)、止血钳(弯头2把，直头1把)、持针器、手术缝针(圆形缝针1个，三角形缝针1个)、自制拉钩(2只)、镊子(皮镊2把，弯镊1把)。

作为改进，步骤一中选用的泡沫板不易导热，保暖性较好。

作为改进，步骤五中背部切口的切割方式可以不必使用u型切口，背部正中单切口或背部脊柱两旁双切口均可。

作为改进，步骤六中肾脏血管夹闭时间可根据实际实验情况进行选择，范围是35-55分钟。

作为改进，步骤五中由于右侧肾动静脉较短应先夹闭。

作为改进，步骤四至步骤七中全程消毒。

作为改进，步骤五中肾动静脉采用一次性夹闭成功的方式进行操作，避免发生肾脏缺血预适应，影响造模成功。

作为改进，步骤五中皮肤切口切勿与筋膜切口内外位置重合，皮肤切口宜位于筋膜切口外侧(内侧亦可)，此举可使皮肤覆盖筋膜切口，防止感染的发生。

附图说明

图1是实施例一中aki造模时不同属种的示意图。

图2是实施例一中aki造模时c57样本的示意图。

图3是实施例二中akitockd时c57样本的示意图。

图4是实施例二中sham组和造模组的示意图。

图5是实施例一中aki造模时的病理结果示意图。

图6是实施例二中akitockd时的病理结果示意图。

图7是实施例三中电镜图的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。

本发明在具体实施时，一种急性肾损伤至慢性肾脏病的动物模型构建方法，包括以下步骤：

步骤一、实验准备，实验器材包括3％戊巴比妥钠、1ml注射器、高压消毒手术器械、胶皮手套、3-0手术缝合线、75％酒精、医用碘伏、生理盐水、无菌棉签、泡沫板手术台；

步骤二、选取20-25g左右小鼠(c57，icr均可)，术前一晚禁食，不禁水；

步骤三、备好实验器械及耗材，放至实验台，空调调至27摄氏度，电热毯打开，紫外线照台30分钟；

步骤四、3％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，小鼠取俯卧位固定于泡沫板(不易导热保暖性较好)手术台上，背部去毛备皮，碘伏消毒；

步骤五、沿小鼠背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5-1cm处剪开皮肤(u型切口)，并用碘伏消毒，在左右肾脏竖脊肌外侧缘剪开筋膜0.5cm，使用无齿弯镊及无齿弯钳自切口沿竖脊肌外侧缘由浅入深，小心分离竖脊肌与附着其外侧缘的脂肪，即可暴露出两侧肾脏的肾动静脉；用自制血管拉钩小心勾选出两侧肾脏血管并留置拉钩于切口处，持右侧血管拉钩向上轻提右侧肾脏血管并迅速用动脉夹夹闭右侧肾动静脉，左侧肾血管夹闭方式同右侧；肾脏血管夹闭后即可见到双侧肾脏由鲜红变黑紫，镊子整理切口并用碘伏消毒皮肤覆盖创口，生理盐水浸湿纱布后平铺于小鼠背部，使其保持充分水化，防止切口干燥，将小鼠置于电热毯上，维持小鼠术中体温；

步骤六、肾脏血管夹闭50分钟后取小鼠于泡沫板上，先右后左依次松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况；

步骤七、分两层(皮下筋膜层及皮肤)缝合切口，并注意碘伏消毒；

步骤八、待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具并放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录，术后1-2天为急性肾损伤期，继续饲养1个月以上即可发展至慢性肾脏病阶段。

所述步骤一的高压消毒手术器械包括剪刀(眼科剪2把，弯剪1把)、止血钳(弯头2把，直头1把)、持针器、手术缝针(圆形缝针1个，三角形缝针1个)、自制拉钩(2只)、镊子(皮镊2把，弯镊1把)。

所述步骤一中选用的泡沫板不易导热，保暖性较好。

所述步骤五中背部切口的切割方式可以不必使用u型切口，背部正中单切口或背部脊柱两旁双切口均可。

所述步骤六中肾脏血管夹闭时间可根据实际实验情况进行选择，范围是35-55分钟。

所述步骤五中由于右侧肾动静脉较短应先夹闭。

所述步骤四至步骤七中全程消毒。

所述步骤五中肾动静脉采用一次性夹闭成功的方式进行操作，避免发生肾脏缺血预适应，影响造模成功。

所述步骤五中皮肤切口切勿与筋膜切口内外位置重合，皮肤切口宜位于筋膜切口外侧(内侧亦可)，此举可使皮肤覆盖筋膜切口，防止感染的发生。

本发明的工作原理：本发明提供了一种新的肾脏缺血再灌注所致小鼠急性肾损伤至慢性肾脏病的模型构建方法，具体实验器材、方法及结果如下：

实验器材：

3％戊巴比妥钠、高压消毒手术器械(剪刀(眼科剪2把，弯剪1把)、止血钳(弯头2把，直头1把)、持针器、手术缝针(圆形缝针1个，三角形缝针1个)、自制拉钩(2只)、镊子(皮镊2把，弯镊1把)、胶皮手套、3-0手术缝合线、75％酒精、医用碘伏、生理盐水、无菌棉签、泡沫板手术台。

1、选取20-25g左右小鼠(c57，icr均可)，术前1晚禁食，不禁水。

2、备好实验器械及耗材，放至实验台，空调调至27摄氏度，电热毯打开，紫外线照台30分钟。

3、3％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，小鼠取俯卧位固定于泡沫板(不易导热保暖性较好)手术台上，背部去毛备皮，碘伏消毒。

4、沿小鼠背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5-1cm处剪开皮肤(u型切口，注：背部切口的切割方式可以不必使用u型切口，背部正中单切口或背部脊柱两旁双切口均可)，并用碘伏消毒。在左右肾脏竖脊肌外侧缘剪开筋膜0.5cm，使用无齿弯镊及无齿弯钳自切口沿竖脊肌外侧缘由浅入深，小心分离竖脊肌与附着其外侧缘的脂肪，即可暴露出两侧肾脏的肾动静脉。用自制血管拉钩小心勾选出两侧肾脏血管并留置拉钩于切口处，持右侧血管拉钩向上轻提右侧肾脏血管，并迅速用动脉夹夹闭右侧肾动静脉，左侧肾血管夹闭方式同右侧。肾脏血管夹闭后即可见到双侧肾脏由鲜红变黑紫。镊子整理切口并用碘伏消毒。皮肤覆盖创口，生理盐水浸湿纱布后平铺于小鼠背部，使其保持充分水化，防止切口干燥。将小鼠置于电热毯上，维持小鼠术中体温。

5、肾脏血管夹闭50分钟后(注：动脉夹夹闭时间在35-55分钟均可)，取小鼠于泡沫板上，先右后左依次松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。

6、分两层(皮下筋膜层及皮肤)缝合切口，并注意碘伏消毒。

7、待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具并放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。术后1-2天为急性肾损伤期，继续饲养1个月以上即可发展至慢性肾脏病阶段。

注意：1、由于右侧肾动静脉较短应先夹闭；2、注意术中消毒；3、肾动静脉需一次性夹闭成功，避免发生肾脏缺血预适应，影响造模成功；4、动脉夹夹闭时间勿大于55分钟；5、皮肤切口切勿与筋膜切口内外位置重合，皮肤切口宜位于筋膜切口外侧(内侧亦可)，此举可使皮肤覆盖筋膜切口，防治感染的发生。

步骤五中所用血管拉钩为自制，它能让肾动静脉更好的与周围结缔组织分离，使得肾动静脉的夹闭更容易实现。

步骤八中继续饲养1个月以上即可发展至慢性肾脏病阶段，是指因个体差异，个别小鼠可于术后1个月进展至慢性肾脏病阶段。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。