本发明涉及中药
技术领域：
，特别涉及一种广谱抗病毒中药挥发油制剂及其应用。
背景技术：
：人类副流感病毒(hpivs)常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(rsv)。与rsv一样，人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染(如感冒和喉咙痛)，它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病(如肺炎，支气管炎和细支气管炎)，特别是在老年人中和有免疫缺陷人群中。人冠状病毒229e属α群正链rna病毒冠状病毒，主要引起人类呼吸道感染。人冠状病毒感染呈全球性分布，人群普遍易感，多项血清学研究结果表明，几乎100%的儿童在幼年早期均感染过hcov-229e和nl63。hcov-229e主要感染呼吸道和肠黏膜表面。感染呼吸道主要引起轻度呼吸道感染症状，典型表现为流涕、咽喉肿痛、咳嗽、头痛、发热等普通感冒症状，少部分病例因上呼吸道感染住院。研究表明，引起呼吸道感染的病例中，出现呼吸困难症状66.6%是由hcov-229e引起的。目前西药治疗由上述病毒引起的疾病只能临时控制病情，服用太多消炎药、抗生素或磺胺类药会导致人体阴阳失去平衡、免疫功能低下，抵抗力减退，致使病情反复难愈。而我国传统中药具有副作用小、调理功能出众、对抗病毒具有较好疗效等特点。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种广谱抗病毒中药挥发油制剂及其应用，以解决上述技术问题。为了实现上述目的，本发明的技术方案为：第一方面，本发明提供的一种广谱抗病毒中药挥发油制剂，按重量份数计，包括如下原料：茶树挥发油10~20份、山腊梅挥发油10~20份、百里香挥发油10~20份、月桂叶挥发油5~10份、尤加利挥发油5~10份、柠檬挥发油5~10份、鱼腥草挥发油5~10份、香桃木挥发油5~10份、罗纹莎叶挥发油5~10份、大西洋雪松挥发油5~10份、艾叶挥发油5~10份。优选的，所述广谱抗病毒中药挥发油制剂，按重量份数计，包括如下原料：茶树挥发油15份、山腊梅挥发油15份、百里香挥发油15份、月桂叶挥发油6份、尤加利挥发油6份、柠檬挥发油6份、鱼腥草挥发油7份、香桃木挥发油7.5份、罗纹莎叶挥发油7.5份、大西洋雪松挥发油7.5份、艾叶挥发油7.5份。优选的，所述茶树挥发油、山腊梅挥发油、月桂叶挥发油、尤加利挥发油、香桃木挥发油、罗纹莎叶挥发油、大西洋雪松挥发油和艾叶挥发油分别以茶树叶片、山腊梅叶片、月桂叶片、尤加利叶片、香桃木叶片、罗纹莎叶片、大西洋雪松针叶和艾叶为原料，分别通过下述方法制得：将对应的叶片原料洗净后平铺在烘房中，放置15~25小时，蒸汽杀青后，气流干燥处理至叶片的水分含量不高于20%，粉碎得到粉末，在0~10℃下冷冻4~10小时，再恢复至25~35℃，再加入0.5~2倍重量的水中，在30~50℃下超声处理2~8小时，然后抽真空蒸馏1~3次，收集蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取即可。进一步优选的，所述蒸汽杀青的条件为：温度为120~130℃，时间为20~40s。进一步优选的，所述气流干燥的条件为：气流速率2~5m3/h。进一步优选的，所述抽真空蒸馏的条件为：真空度0.3~0.8pa，蒸馏温度40~50℃，冷凝温度3~5℃。进一步优选的，所述超临界二氧化碳萃取的条件为：萃取压力为15~18mpa，萃取时间为60~90min，萃取温度为45~55℃，二氧化碳的流速为20~40l/h。优选的，所述百里香挥发油和鱼腥草挥发油分别以百里香全草和鱼腥草全草为原料，分别通过下述方法制得：将新鲜的全草原料洗净后干燥至水分不高于15%，粉碎后加入5~10倍重量的水中，在30~50℃下超声处理1~2小时，然后水蒸气蒸馏提取1~3小时，收集蒸馏液，将蒸馏液进行减压精馏，分离出挥发油。进一步优选的，所述减压蒸馏的条件为：温度为50~80℃，真空度为50~90pa，搅拌速率为100~300r/min。优选的，所述柠檬挥发油为采用下述方法制得：将新鲜的的柠檬果皮粉碎得到柠檬皮碎粒，将柠檬片碎粒加入1~3倍重量的水中，在30~50℃下超声处理30~60min，然后水蒸气蒸馏提取2~4小时，收集蒸馏液，，将蒸馏液进行减压精馏，分离出柠檬挥发油。进一步优选的，所述减压蒸馏的条件为：温度为50~70℃，真空度为50~90pa，搅拌速率为200~500r/min。优选的，所述广谱抗病毒中药挥发油制剂是将茶树挥发油、山腊梅挥发油、百里香挥发油、月桂叶挥发油、尤加利挥发油、柠檬挥发油、鱼腥草挥发油、香桃木挥发油、罗纹莎叶挥发油、大西洋雪松挥发油、艾叶挥发油混合均匀而成的。第二方面，本发明提供的一种如第一方面所述的广谱抗病毒中药挥发油制剂在制备抗病毒药物中的应用。优选的，所述抗病毒药物是由药学可接受的载体与所述广谱抗病毒中药挥发油制剂制备而成的剂型。进一步优选的，所述药学上可接受的载体选自赋形剂、黏合剂、填充剂、润滑剂、抗氧剂、防腐剂和增稠剂中的一种或多种。进一步优选的，所述剂型选自滴鼻剂、凝胶剂、膏剂、贴剂、搽剂、酊剂、洗剂、涂膜剂和贴膏剂中的任意一种。优选的，所述抗病毒药物为抗人类副流感病毒药物、抗人冠状病毒药物中的任意一种。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明茶树挥发油、山腊梅挥发油、百里香挥发油、月桂叶挥发油、尤加利挥发油、柠檬挥发油、鱼腥草挥发油、香桃木挥发油、罗纹莎叶挥发油、大西洋雪松挥发油、艾叶挥发油，这十一种挥发油中的有效成分各不相同，各组分协同作用，对不同的病毒引起的疾病有着不错的治疗作用，可降低肺指数，减少死亡率，延长生存时间；经试验证明，本发明提供的中药挥发油制剂对副流感病毒（仙台株）所致小鼠肺炎模型和人冠状病毒229e所致小鼠肺炎模型的肺指数均有明显降低作用。本发明包含的中药成分的作用如下：山腊梅：腊梅科植物，其主要成分包括α-蒎烯、β-莰烯、蒎烯、1,8-桉叶素、樟脑、龙脑、异龙脑，山腊梅挥发油中含有脱氢香橙烯，其次是(-)-匙叶桉油烯醇,α-杜松醇,(+)-匙叶桉油烯醇，山腊梅对流感病毒有着很好的抑制作用，广泛应用于感冒等疾病，其挥发油也有着镇痛、止咳、平喘的作用；茶树：山茶科植物，其挥发油主要成分包括对伞花烃、松油烯-4-醇、萜品油烯、1,8-桉叶素、α-pine烯、γ-萜品烯等化合物，有着不错的抗炎、抗菌、抗病毒作用；月桂叶：樟科植物，其挥发油主要成分包括1,8-桉油醇、乙酸松油脂、丁香酚甲醚、去氢夙毛菊内酯、α-松油醇等，有着抗病毒活性，也对各种细菌有着很好的抑制作用；尤加利：也叫桉树，桃金娘科植物，主要含有1,8-桉叶醇、桉叶油素、萜烯、异戊叶油、葛缕酮、胡薄荷酮、胡椒酮等物质，有着不错的抗炎，抗肿瘤，抗病毒作用；柠檬：芸香科植物，其挥发油主要含有对甲苯、柠檬烯、芳香醇，一有研究表明，其对新型冠状病毒有着很好的抑制作用；鱼腥草：三百草科植物，其挥发油主要含有β-蒎烯、d-柠檬烯、甲基正壬酮、ɑ-蒎烯、乙酸龙脑酯、β-月桂烯和4-萜品醇等化合物，有着不错的抗炎、抗病毒、抗菌等作用；香桃木：桃金娘科植物，主要含有槲皮素和杨梅素两种化合物，主要有着抗氧化、抗炎、抗病毒作用；罗纹莎叶：樟科植物，以抗病毒作用闻名，有着很好的挥发性，其挥发油主要含有桉叶油醇、樟脑、香树烯、对伞花烃、β-蒎烯等物质，有着很好的抑菌作用；百里香：唇形科植物，百里香挥发油主要含有对异丙基甲苯、百里酚、芳樟醇、α-蒎烯、α-松油醇、β-月桂烯等化合物，有着很好的抗病毒作用；大西洋雪松：松科植物，其挥发油主要含有雪松烯、雪松醇、大西洋酮等，有着很好的安抚情绪的作用，抗菌活性强，有助于提高免疫系统；艾叶：菊科植物，其挥发油主要含有单萜类、倍半萜类、黄酮类和酚酸类等物质，包括桉油精、樟脑和龙脑，市面上常用于抗菌、抗炎。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。在以下实施例和对比例中，茶树挥发油、山腊梅挥发油、月桂叶挥发油、尤加利挥发油、香桃木挥发油、罗纹莎叶挥发油、大西洋雪松挥发油和艾叶挥发油分别以茶树叶片、山腊梅叶片、月桂叶片、尤加利叶片、香桃木叶片、罗纹莎叶片、大西洋雪松针叶和艾叶为原料，分别通过下述方法制得：将对应的叶片原料洗净后平铺在烘房中，放置20小时，以125℃的蒸汽杀青30s，气流干燥处理至叶片的水分含量为12~15%，粉碎得到100目的粉末，在5℃下冷藏6小时，再恢复至30℃，再加入1倍重量的水中，在45℃下超声处理4小时，然后在真空度0.6pa、蒸馏温度45℃、冷凝温度4℃的条件下抽真空蒸馏2次，收集蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取即可，其中，超临界二氧化碳萃取的条件为：萃取压力为16mpa，萃取时间为70min，萃取温度为50℃，二氧化碳的流速为30l/h。在以下实施例和对比例中，百里香挥发油和鱼腥草挥发油的制备方法，包括如下步骤：百里香挥发油和鱼腥草挥发油分别以百里香全草和鱼腥草全草为原料，将新鲜的全草原料洗净后干燥至水分10~15%，粉碎后加入6倍重量的水中，在45℃下超声处理1.5小时，然后将超声处理后的料液转入蒸馏设备中，水蒸气蒸馏提取2小时，收集蒸馏液，将蒸馏液进行减压精馏，分离出挥发油，其中，所述减压蒸馏的条件为：温度为70℃，真空度为70pa，搅拌速率为200r/min。在以下实施例和对比例中，柠檬挥发油的制备方法，包括如下步骤：将新鲜的的柠檬果皮粉碎得到柠檬皮碎粒，将柠檬片碎粒加入相同重量的水中，在40℃下超声处理45min，然后水蒸气蒸馏提取3小时，收集蒸馏液，将蒸馏液进行减压精馏，其中，所述减压蒸馏的条件为：温度为60℃，真空度为60pa，搅拌速率为400r/min，分离出柠檬挥发油。实施例1~5称取如下表1所示重量份数的原料，将茶树挥发油、山腊梅挥发油、百里香挥发油、月桂叶挥发油、尤加利挥发油、柠檬挥发油、鱼腥草挥发油、香桃木挥发油、罗纹莎叶挥发油、大西洋雪松挥发油、艾叶挥发油混合均匀即可。表1各原料的配比原料/(单位：重量份)实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5茶树挥发油1510181220山腊梅挥发油1520181210百里香挥发油1520151210月桂叶挥发油656810尤加利挥发油656810柠檬挥发油610685鱼腥草挥发油710685香桃木挥发油7.55685罗纹莎叶挥发油7.55685大西洋雪松挥发油7.557810艾叶挥发油7.556810（一）中药挥发油制剂对副流感病毒（仙台株）致小鼠肺炎模型的治疗作用1.实验材料1.1动物及分组选用spf级icr小鼠50只，雌雄各半，9-12周龄，体重13-15g，购于江西中医药大学实验动物科技中心[合格证号：scxk（赣）2018-0003]。清洁级动物房饲养，统一光照时间为06:00～18:00，恒温，恒湿，自由饮水，饲固体饲料。适应性喂养3d后用于实验。按随机数字表法分为以下5组，每组10只：正常对照组、模型对照组、中药挥发油制剂大、中、小三个剂量组1.2实验药物由实施例1的方法制备中药挥发油制剂。1.3主要试剂trizolreagent购于ambionbylifetechnology（批号：257403）、influenzavirusarealtimert-pcrkit购于上海之江生物科技股份有限公司（批号：nop20200101）、乙醚购于上海市鸿盛精细化工有限公司（批号：20181009）、小鼠α干扰素（ifn-α）酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：no03/2019）、小鼠mda酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：no07/2020）、小鼠肿瘤坏死因子α（tnf-α）酶联免疫分析购于美国bio-techne（批号：no546999）。1.4主要仪器a2型生物安全柜（型号：thermomsc1.8），a2型生物安全柜（型号：thermomsc1.2）均购于美国thermo公司，a2型生物安全柜（型号：nuairenu-425-400e）购于美国nuaire，电子天平（型号：yp1002max100g）购于上海越平科学仪器有限公司，电子分析天平（型号：ltem-ar1140max110g）购于ohauscorp.brock.wj.usa，电子天平（型号：al204）购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，real-timepcrinstrument（型号：quantstudio5）购于appliedbiosystems，八连排管迷你离心机（型号：lx-300）购于kylin-belllabinstruments，迷你涡旋振荡器（型号：ql-901）购于海门市其林贝尔仪器制造有限公司，低温高速离心机（型号eppendorf-5810r）购于eppendorf，电子分析天平（型号：ar1140）购于ohauscorp.brock.nj.usa，多功能酶标仪（型号enspire）购于perkinelmer，超声细胞破碎仪（型号：sonicruptor400）购于monihomogenizercompany，震荡裂解仪（型号：fastpreptm-24）购于mpbiomedicals，ivc小鼠饲养笼（型号：zj-4）购于苏州市冯氏实验动物设备有限公司。2.实验方法2.1除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个ld50副流感病毒（仙台株）滴鼻感染，每只45μl。感染当天开始给药，大、中、小剂量组每次以滴鼻方式给药，给药剂量如表2所示，每天1次，连续4天，正常对照组和模型对照组在同等条件下蒸馏水滴鼻。第5天称重后解剖。取肺称肺重，计算肺指数及肺指数抑制率。结果采用组间比较t检验进行统计学处理。计算公式如下：肺指数(%)=[肺湿重(g)/体重(g)]×100%；肺指数抑制率(%)=[模型对照组肺重(g)-给药组肺重(g)]/[模型对照组肺重(g)-正常对照组肺重(g)]×100%。2.2统计方法采用spss22.0软件进行统计，组间比较采用对照t检验和单因素方差分析，以`x±s表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析（anova），然后进行dunnet检验用于多重比较组间差异，以p<0.05表示统计结果差异具有统计学意义。3实验结果表2对副流感病毒（仙台株）感染小鼠肺炎模型的治疗作用注：与正常组比较##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.014.讨论采用副流感病毒（仙台株）感染小鼠后，小鼠肺指数明显增高，与正常对照组比较有明显性差异（p<0.01）；感染当天开始给予中药挥发油制剂治疗4天后，中药挥发油制剂大、中剂量组肺指数明显降低，与模型对照组比较有明显性差异（p<0.05，p<0.01），肺指数抑制率分别为45.75%、37.01%。（二）中药挥发油制剂对人冠状病毒229e致小鼠肺炎模型的治疗作用1.实验材料1.1动物及分组选用spf级icr小鼠50只，雌雄各半，9-12周龄，体重13-15g，购于江西中医药大学实验动物科技中心[合格证号：scxk（赣）2018-0003]。清洁级动物房饲养，统一光照时间为06:00～18:00，恒温，恒湿，自由饮水，饲固体饲料。适应性喂养3d后用于实验。按随机数字表法分为以下5组，每组10只：正常对照组模型对照组中药挥发油制剂大、中、小三个剂量组1.2实验药物由实施例1的方法制备中药挥发油制剂。1.3主要试剂trizolreagent购于ambionbylifetechnology（批号：257403）、influenzavirusarealtimert-pcrkit购于上海之江生物科技股份有限公司（批号：nop20200101）、乙醚购于上海市鸿盛精细化工有限公司（批号：20181009）、小鼠α干扰素（ifn-α）酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：no03/2019）、小鼠mda酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：no07/2020）、小鼠肿瘤坏死因子α（tnf-α）酶联免疫分析购于美国bio-techne（批号：no546999）。1.4主要仪器a2型生物安全柜（型号：thermomsc1.8），a2型生物安全柜（型号：thermomsc1.2）均购于美国thermo公司，a2型生物安全柜（型号：nuairenu-425-400e）购于美国nuaire，电子天平（型号：yp1002max100g）购于上海越平科学仪器有限公司，电子分析天平（型号：ltem-ar1140max110g）购于ohauscorp.brock.wj.usa，电子天平（型号：al204）购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，real-timepcrinstrument（型号：quantstudio5）购于appliedbiosystems，八连排管迷你离心机（型号：lx-300）购于kylin-belllabinstruments，迷你涡旋振荡器（型号：ql-901）购于海门市其林贝尔仪器制造有限公司，低温高速离心机（型号eppendorf-5810r）购于eppendorf，电子分析天平（型号：ar1140）购于ohauscorp.brock.nj.usa，多功能酶标仪（型号enspire）购于perkinelmer，超声细胞破碎仪（型号：sonicruptor400）购于monihomogenizercompany，震荡裂解仪（型号：fastpreptm-24）购于mpbiomedicals，ivc小鼠饲养笼（型号：zj-4）购于苏州市冯氏实验动物设备有限公司。2.实验方法2.1除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以100tcid50人冠状病毒229e病毒液滴鼻感染，每只45μl。感染当天开始给药，大、中、小剂量组每次以滴鼻方式给药，给药剂量如表3所示，每天1次，连续4天，正常对照组和模型对照组在同等条件下蒸馏水滴鼻。第5天称重后解剖。取肺称肺重，计算肺指数及肺指数抑制率。结果采用组间比较t检验进行统计学处理。计算公式如下：肺指数(%)=[肺湿重(g)/体重(g)]×100%；肺指数抑制率(%)=[模型对照组肺重(g)-给药组肺重(g)]/[模型对照组肺重(g)-正常对照组肺重(g)]×100%。2.2统计方法采用spss22.0软件进行统计，组间比较采用对照t检验和单因素方差分析，以`x±s表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析（anova），然后进行dunnet检验用于多重比较组间差异，以p<0.05表示统计结果差异具有统计学意义。3实验结果表3对人冠状病毒229e感染小鼠肺炎模型的治疗作用注：与正常组比较##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.014讨论采用人冠状病毒229e感染小鼠后，小鼠肺指数明显增高，与正常对照组比较有明显性差异（p<0.01）；感染当天开始给予中药挥发油制剂治疗4天后，中药挥发油制剂大、小剂量组肺指数明显降低，与模型对照组比较有明显性差异（p<0.05），肺指数抑制率分别为20.76%、23.46%。对比例1为了进一步说明本发明的有益效果，本对比例采用超声-水蒸气蒸馏-减压精馏的方法提取挥发油，茶树挥发油、山腊梅挥发油、月桂叶挥发油、尤加利挥发油、香桃木挥发油、罗纹莎叶挥发油、大西洋雪松挥发油、艾叶挥发油、柠檬挥发油、百里香挥发油和鱼腥草挥发油分别以茶树叶片、山腊梅叶片、月桂叶片、尤加利叶片、香桃木叶片、罗纹莎叶片、大西洋雪松针叶、艾叶、柠檬果皮、百里香全草和鱼腥草全草为原料，分别通过下述方法制得：将各原料粉碎得到碎粒，将碎粒加入相同重量的水中，在40℃下超声处理45min，然后水蒸气蒸馏提取3小时，收集蒸馏液，将蒸馏液进行减压精馏，其中，所述减压蒸馏的条件为：温度为60℃，真空度为60pa，搅拌速率为400r/min，分离出挥发油。按照实施例1的原料配比和方法制得中药挥发油制剂。对比例2为了进一步说明本发明的有益效果，采用与实施例1类似的方法制得中药挥发油制剂，本对比例与实施例1的区别仅在于：本对比例未添加鱼腥草挥发油。对比例3为了进一步说明本发明的有益效果，采用与实施例1类似的方法制得中药挥发油制剂，本对比例与实施例1的区别仅在于：本对比例未添加艾叶挥发油和月桂叶挥发油。（四）各实施例和对比例对各病毒感染小鼠模型的治疗作用为了进一步说明本发明的有益效果，按照实施例1的试验方法，对上述实施例2~5及对比例1~3所得产品的药效进行测试，测试结果如下表4~6所示。表4对副流感病毒（仙台株）感染小鼠肺炎模型的治疗作用注：与正常组比较##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01表5对人冠状病毒229e感染小鼠肺炎模型的治疗作用注：与正常组比较##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。当前第1页12