素馨针提取物或其有效成分在制备弹性蛋白酶抑制剂中的应用的制作方法

1.本发明属于药物技术领域，具体涉及素馨针提取物或其有效成分在制备弹性蛋白酶抑制剂中的应用。


背景技术：

2.弹性蛋白酶是一种内肽酶，可水解弹性蛋白和胶原蛋白，而弹性蛋白和胶原蛋白的水解会导致皮肤失去弹性、松弛、出现皱纹等老化表现，虽然这一进程是健康皮肤老化条件下的正常过程，但是环境因素和内部细胞如真皮层中成纤细胞内氧化水平(ros)的氧化应激，不仅会使弹性蛋白酶过度表达，促进弹性蛋白和胶原蛋白的水解进而加剧了皮肤机械结构的丧失，导致皮肤失去弹性、松弛、出现皱纹，还减少皮肤真皮层中成纤细胞数量、改变成纤细胞形态，从而加速皮肤老化；另外，在正常生理条件下，弹性蛋白酶可以协助吞噬细胞消除有害病菌，促进伤口的愈合和组织再生，但是其过量表达会引起机体炎症反应，促进癌细胞增殖和转移，诱发包括肺气肿在内的多种疾病。因而，开发弹性蛋白酶抑制剂，利用其抑制弹性蛋白酶的活性，避免弹性蛋白酶的过度表达，能够有效避免诱发机体炎症反应，减缓弹性蛋白和胶原蛋白的水解，增强皮肤毛发的弹性，减少皱纹及色素沉着，对于延缓皮肤衰老及避免诱发相关炎症反应具有重要意义。
3.弹性蛋白酶抑制剂可以抑制弹性蛋白酶的活性，从而减少机体的炎症反应，从而延缓皮肤衰老，天然产物衍生的弹性蛋白酶抑制剂可以有效的减慢弹性蛋白的降解速度，起到延缓衰老、减少皱纹产生的作用，与人工合成的抑制剂相比，具有来源丰富、绿色安全的优势，拥有更为广阔的开发前景。


技术实现要素：

4.本发明旨在开发一种源于天然产物的弹性蛋白酶抑制剂，具体涉及素馨针提取物或其有效成分在制备弹性蛋白酶抑制剂中的应用。
5.基于上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.第一方面，本发明提供素馨针提取物或其有效成分在制备弹性蛋白酶抑制剂中的应用，其中，素馨针提取物为素馨针的乙酸乙酯层提取物；素馨针提取物的有效成分包括橄榄苦苷(ole)和羟基酪醇(ht)。
7.素馨针提取物以及由素馨针提取物进一步提取纯化得到的ole和ht均具有抑制弹性蛋白酶活性的作用，且对弹性蛋白酶活性的抑制呈浓度依赖性，随着素馨针提取物或ole、ht浓度的增加，其对弹性蛋白酶的抑制作用逐步增强，因而本发明素馨针提取物、ole、ht能够用于制备弹性蛋白酶抑制剂。另外，用于制备弹性蛋白酶抑制剂的素馨针提取物、ole、ht，具有来源丰富、绿色安全的优势，具有较高的应用前景。
8.进一步地，用于制备弹性蛋白酶抑制剂的橄榄苦苷和羟基酪醇的摩尔浓度比为1:1，且体积比为1:1。
9.本发明的ole、ht均具有抗弹性蛋白酶的效果，其中，ole通过与弹性蛋白酶底物竞争酶活性中心结合而引起酶活性的可逆的抑制作用。ht通过与酶
‑
底物复合物结合，而不与游离酶结合而引起酶活性降低的抑制作用。试验结果表明，当等摩尔浓度的ole和ht以体积比1:1混合时，对弹性蛋白酶活性具有较好的协同抑制效果。
10.进一步地，素馨针提取物的制备方法包括如下步骤：
11.将素馨针干燥、粉碎后于体积分数为75％～95％的乙醇水溶液中经浸提、浓缩得乙醇提取物，将乙醇提取物加水复溶后经乙酸乙酯萃取、浓缩得素馨针的乙酸乙酯层提取物。
12.进一步地，素馨针提取物中有效成分ole的制备方法包括如下步骤：
13.以二氯甲烷、甲醇混合液为洗脱液，对素馨针的乙酸乙酯层提取物进行梯度洗脱收集洗脱液，洗脱液经再经氯仿、甲醇混合液洗脱后，再以甲醇水溶液进行反相柱层析收集洗脱液，即得素馨针提取物的有效成分ole。
14.进一步地，利用二氯甲烷、甲醇混合液进行梯度洗脱过程中，二氯甲烷与甲醇的体积比依次为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1，收集由体积比为6:1的二氯甲烷、甲醇混合液洗脱的馏分进行下一步洗脱；氯仿、甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1:1；甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％。
15.进一步地，素馨针提取物中有效成分ht的制备方法包括如下步骤：
16.以石油醚、乙酸乙酯混合液为洗脱液，对素馨针的乙酸乙酯层提取物进行梯度洗脱收集洗脱液，洗脱液经氯仿甲醇混合液洗脱收集到的洗脱液，即得素馨针提取物的有效成分ht。
17.进一步地，利用石油醚、乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱过程中，石油醚与乙酸乙酯的体积比依次为50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1、0:1，收集由体积比为1:1石油醚与乙酸乙酯混合液洗脱的馏分进行下一步洗脱；氯仿甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1:1。
18.第二方面，本发明提供一种弹性蛋白酶抑制剂，该弹性蛋白酶抑制剂包括素馨针提取物或其有效成分；素馨针提取物的有效成分包括ole和ht。
19.进一步地，ole和ht的摩尔浓度比为1:1，且体积比为1:1。
20.第三方面，本发明弹性蛋白酶抑制剂在制备抗衰老化妆品中的应用。
21.本发明弹性蛋白酶抑制剂包括素馨针提取物或其有效成分ole、ht，试验证明，素馨针提取物及其有效成分不仅能够显著抑制弹性蛋白酶活性，并能够降低由h2o2氧化诱导的皮肤真皮层成纤维细胞内的ros水平，降低环境因素和内部细胞如真皮层中成纤细胞内氧化水平(ros)的氧化应激，避免弹性蛋白酶过度表达，从而延缓皮肤老化，故而本发明弹性蛋白酶抑制剂能够用于制备抗衰老化妆品。
22.进一步地，化妆品包括爽肤水、精华、面霜、面膜或身体乳。
23.第四方面，本发明弹性蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗肺气肿的药物中的应用。
24.本发明弹性蛋白酶抑制剂能够降低由h2o2氧化诱导的皮肤真皮层成纤维细胞内的ros水平，降低环境因素和内部细胞如真皮层中成纤细胞内氧化水平(ros)的氧化应激，抑制弹性蛋白酶过度表达，从而避免了由弹性蛋白酶过量表达诱发的肺气肿。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
26.本发明橄榄苦苷、羟基酪醇或素馨针提取物均具有抑制弹性蛋白酶活性的效果，
避免弹性蛋白酶的过度表达而引起的皮肤老化以及肺气肿等疾病，且当橄榄苦苷和羟基酪醇的摩尔浓度比为1:1时，对弹性蛋白酶的抑制作用更强。因此，本发明橄榄苦苷、羟基酪醇或素馨针提取物为改善皮肤衰老或者治疗肺气肿慢性并发症提供新选择。
附图说明
27.图1为不同浓度的素馨针提取物(extract)、ole、ht以及不同比例的ole和ht对弹性蛋白酶的抑制效果图；
28.图2为ole和ht对弹性蛋白酶的协同抑制效果图；
29.图3为ole和ht的双倒数曲线图；
30.图4为ole、ht与弹性蛋白酶的结合位点示意图；
31.图5为ole、ht降低h2o2诱导人真皮成纤细胞中ros水平图。
32.图6为ole和ht协同降低h2o2诱导人真皮成纤细胞中ros水平图。
具体实施方式
33.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
34.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.实施例1素馨针提取物及其有效成分的提取纯化
36.将素馨针晾晒烘干后粉碎制成粉末，取8kg素馨针粉末在常温常压下用10l、体积分数为80％乙醇水溶液提取三次，每次提取3天，得到素馨针醇提液，将其减压浓缩制得乙醇提取物；随后向乙醇提取物中加入2l蒸馏水使其溶解，再依次经1l石油醚萃取三次(1l
×
3)、剩余物再依次经1l乙酸乙酯萃取三次(1l
×
3)和1l正丁醇萃取三次(1l
×
3)，合并收集乙酸乙酯萃取液，经浓缩后得到素馨针的乙酸乙酯层提取物。
37.素馨针的乙酸乙酯层提取物中有效成分包括ole和ht，利用素馨针的乙酸乙酯层提取物分离纯化制得ht的方法如下：
38.将素馨针的乙酸乙酯层提取物用中压制备色谱分离，以石油醚和乙酸乙酯的混合液作为洗脱液，对素馨针的乙酸乙酯层提取物进行梯度洗脱，在洗脱过程中，石油醚与乙酸乙酯的体积比依次为50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1、0:1，收集由体积比为1:1的石油醚与乙酸乙酯混合液洗脱下来的馏分，将收集到的馏分再经lh
‑
20凝胶柱层析，以体积比为1:1的氯仿
‑
甲烷作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液并浓缩得到ht。
39.利用素馨针的乙酸乙酯层提取物分离纯化制得ole的方法如下：
40.将素馨针的乙酸乙酯层提取物用中压制备色谱分离，以二氯甲烷和甲醇分别按照体积比10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1对素馨针的乙酸乙酯层提取物进行梯度洗脱，收集由体积比为6:1的二氯甲烷与甲醇混合液洗脱下来的馏分，将其经lh
‑
20凝胶柱层析，并以体积比为1:1的氯仿
‑
甲醇作为流动相进行洗脱后，再经反相硅胶柱层析，以体积分数为40％的甲醇水溶液作为流动相进行洗脱，收集由其洗脱下来的馏分，并将其浓缩制得化合物ole。
41.实施例2素馨针提取物及其有效成分对弹性蛋白酶的抑制效果试验
42.本实施例以探讨ole和ht对弹性蛋白酶的抑制效果试验，具体试验方法如下：
43.1、测试液的准备：
44.用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，dmso)将由实施例1制得的素馨针乙酸乙酯层提取物配制成浓度为100mg/ml的原液，并依次稀释，最终浓度为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml。
45.用dmso将由实施例1制得的ht配制成浓度为100mm的原液，并依次稀释，最终浓度为1000μm、500μm、250μm、125μm、62.5μm。。
46.用dmso将由实施例1制得的ole配制成浓度为100mm的原液，并依次稀释，最终浓度为1000μm、500μm、250μm、125μm、62.5μm。。
47.2、测试方法如下：
48.以120μl、20mmol/l的tris
‑
hcl缓冲溶液(ph＝8.0)为测试体系，向测试体系中先加入20μl由tris
‑
hcl缓冲液溶解的弹性蛋白酶溶液，再向测试体系中加入10μl不同浓度的测试液，最后向测试体系中加入50μl底物n
‑
琥珀酰
‑
ala
‑
ala
‑
ala
‑
对硝基苯胺(n
‑
succinyl
‑
ala
‑
ala
‑
ala
‑
p
‑
nitroanilide，购于sigma
‑
aldrich公司)溶液，混匀，使用酶标仪测定波长为410nm的吸光度值。另外，以10μl的tris
‑
hcl缓冲溶液替代测试液作为空白加入，作为对照组。
49.3、测试结果
50.不同测试样品对弹性蛋白酶的抑制作用如图1所示，其中，图1a为不同浓度的素馨针提取物对弹性蛋白酶活性的影响。空白对照组处理的弹性蛋白酶的活力设定为100％，对弹性蛋白酶活性无抑制作用。由图1a可以看出，空白对照组的弹性蛋白酶活性最高，而加入不同浓度的素馨针提取物后弹性蛋白酶的活性均低于空白对照组，表明素馨针提取物对弹性蛋白酶具有抑制作用；随着加入素馨针提取物的浓度的升高，弹性蛋白酶的活性越低，表明素馨针提取物对弹性蛋白酶的抑制作用具有浓度依赖性，素馨针提取物的浓度越高，对弹性蛋白酶的抑制作用越强。
51.图1c为不同浓度的ole对弹性蛋白酶的抑制效果图；由图1c可以看出，经不同浓度的ole处理后的弹性蛋白酶的活性显著低于对照组，表明ole对弹性蛋白酶的活性具有抑制作用；并且，随着ole浓度的增加，弹性蛋白酶的活性越低，表明ole对弹性蛋白酶的抑制作用具有浓度依赖性，浓度越高，对弹性蛋白酶的抑制作用越强。
52.图1d为不同浓度的ht对弹性蛋白酶的抑制效果图；由图可以看出，经不同浓度的ht处理后的弹性蛋白酶的活性均低于对照组，表明ht对弹性蛋白酶的活性具有抑制作用；并且，随着ht浓度的增加，弹性蛋白酶的活性越低，表明ht对弹性蛋白酶的抑制作用具有浓度依赖性，浓度越高，对弹性蛋白酶的抑制作用越强。
53.接下来测试了相同浓度(250μm)不同体积比的ole和ht对弹性蛋白酶的抑制作用，结果如图1b所示，可见当ole和ht的体积之比为1：1时，对弹性蛋白酶的抑制作用更强。
54.实施例3橄榄苦苷和羟基酪醇对弹性蛋白酶的协同抑制效果试验
55.本实施例以探究橄榄苦苷(ole)和羟基酪醇(ht)对弹性蛋白酶是否具有协同抑制效果，具体试验方法如下：
56.1、弹性蛋白酶活性抑制试验
57.(1)试样准备：
58.将浓度为100mm的样品依次稀释，使得ole、ht的最终浓度为62.5μm、125μm、250μm、500μm、1000μm作为待测样品；同时将等体积、等摩尔浓度的ole、ht的混合物(ole+ht)为待测样品。
59.(2)测试方法及测试结果
60.分别取10μl不同浓度的待测样品加入到96孔板，随后向96孔板中加入120μl的tris
‑
hcl缓冲液(浓度为2mm，ph＝8)，再向96孔板中加入20μl、浓度为0.5u/ml的弹性蛋白酶溶液。
61.将96孔板置于37℃恒温培养箱中孵育15min，然后加入50μl、浓度为1mg/ml的底物(n
‑
succinyl
‑
ala
‑
ala
‑
ala
‑
p
‑
nitroanilide)，使用酶标仪测量样品在410nm下的吸光度，并计算待测样品对弹性蛋白酶活性抑制率。弹性蛋白酶活性抑制率由如下公式计算得到：
62.弹性蛋白酶活性抑制率(％)＝[(
△
a
‑△
b)/
△
a]
×
100％，
△
a表示不含待测样品的空白对照组吸光度值，
△
b代表不同浓度测试液吸光度值。
[0063]
测试结果如图2a所示，可以看出，随着待测样品浓度的增加，ole、ht、ole+ht对弹性蛋白酶活性抑制率均呈增加趋势，且在等浓度的条件下，ole+ht对弹性蛋白酶活性抑制率高于ole以及ht单独对弹性蛋白酶的抑制率，表明ole与ht对弹性蛋白酶活性可能具有协同抑制作用。
[0064]
为更进一步确定等量混合的ole和ht对弹性蛋白酶的协同抑制效果，以不同浓度梯度的ht+ole(等摩尔浓度等体积混合液)作为待测液，参照上述方法测定待测液对弹性蛋白酶的抑制率，利用compusyn软件测量两者的协同指数(combination index,ci)以评价两者的协同作用，其中，ci<1生物学效应定义为协同效应，ci＝1定义为累加效应，ci>1定义为拮抗作用。
[0065]
通过测试ole和ht联合用药对弹性蛋白酶的抑制作用，结果如图2b所示，ole与ht以等摩尔浓度等体积混合时，不同浓度的ole+ht处理后的ci值均小于1，表明ole和ht按照等摩尔浓度等体积混合对弹性蛋白酶具有协同抑制作用，此结果为ole和ht的联合用药提供了理论依据。
[0066]
2、ole、ht对弹性蛋白酶抑制类型分析
[0067]
通过酶促反应动力学测试ole和ht对弹性蛋白酶的抑制类型，设置ole、ht的浓度梯度为0μm、250μm、500μm、1000μm；底物的浓度依次为4mg/ml、2mg/ml、1.32mg/ml、1mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml，参照上述方法，在动力模式下测试410nm下的吸光度，使用lineweaver
‑
burk图对抑制剂进行动力学分析，以确定ole和ht对弹性蛋白酶的抑制模式。
[0068]
lineweaver
‑
burk图如图3所示，不同浓度的ole的直线在y轴处相交(图3a)，当ole浓度增加时，ole的michaelis
‑
menton常数(km)增大，而其最大反应速度(vmax)保持不变(图3c)，表明ole是竞争性抑制弹性蛋白酶的活性。而不同浓度的ht的直线平行(图3b)，且随着ht浓度的升高，其km和vmax降低(图3c)，这表明ht以反竞争性方式抑制了弹性蛋白酶活性。
[0069]
3、分子对接试验
[0070]
随后利用分子对接预测ole和ht与弹性蛋白酶结合的作用力，其中，ole与ht及弹性蛋白酶的化学结构可从美国国家生物技术信息中心获得。使用autodock 4.2，在罗德岛
大学(ri
‑
inbre)提供的计算模型饱和条件下进行了分子对接分析。从rcsb蛋白数据库(www.rcsb.org)中以pdb格式检索了弹性蛋白酶蛋白(pdb id：1lvy)的晶体结构，并使用autodock tools分配了部分电荷并除去了水分子和添加了氢原子。弹性蛋白酶蛋白的刚性结构用作对接计算的受体，discovery studio软件用于获得合理的活性结合位点。用lamarckian遗传算法进行对接模拟，并基于其自由带能和氢键获得了优化的蛋白质结构，侧链和环的构建，结合位点以及配体的结合分数。
[0071]
通过计算机分子对接研究以预测弹性蛋白酶蛋白与其抑制剂之间的相互作用，如图4所示，ole和ht能够在不同的结合位点与弹性蛋白酶蛋白结合，其自由结合能分别为
‑
7.21kcal/mol和
‑
4.72kcal/mol。位于弹性蛋白酶蛋白催化位点的ole结合位点包括val85、asp60、leu63、val90、glu62在内的氨基酸残基相互作用，这有助于形成4个氢键和一个碳氢键来稳定酶
‑
配体复合物。ht与弹性蛋白酶蛋白相互作用，并与氨基酸残基leu73，glu70，gln34，gln38和arg65a形成4个氢键和一个pi
‑
阳离子键(图4)。这一结果从理论上支持了ole和ht可以抑制弹性蛋白酶的活性。
[0072]
实施例4橄榄苦苷和羟基酪醇协同降低h2o2诱导的成纤细胞内ros水平试验
[0073]
由于皮肤真皮中最重要的细胞成分是成纤维细胞，其数量减少、形态改变、分泌合成功能减弱或衰退与皮肤衰老密切相关，活性氧(reactive oxygen species，ros)在自然老化和光老化中发挥着重要作用，它通过对细胞成分的损伤作用来诱导皮肤衰老。皮肤细胞的内源性衰老和外源性衰老有着共同的分子机制，即均遭受ros所致的氧化应激，并发生一系列后续效应，共同影响着皮肤细胞乃至皮肤的衰老。因此，本实施例以探究ole、ht对人真皮成纤维细胞中ros水平的影响，具体试验方法如下：
[0074]
将人真皮成纤维细胞以每孔约5000～6000个细胞的密度接种在96孔板中，使其附着12小时，然后用不同浓度的测试样ole、ht、ole+ht处理24小时，其中，测试样的浓度依次为12.5μm、25μm、50μm、100μm。随后除去培养基，向每孔加入100μl含20μm荧光试剂2'，7'
‑
二氯荧光素二乙酸酯(dcf
‑
da)的新鲜培养基，并与细胞孵育20分钟。然后将细胞用100μl、100μm的h2o2处理1小时，使用酶标仪测量激发和发射波长分别为485nm和525nm的每个孔的荧光强度。
[0075]
通过测量无毒浓度(6.25～100μm)的ole和ht对人皮肤成纤维细胞中氧化应激诱导的活性氧水平的改善来评估ole和ht抗氧化作用，过氧化氢被用作氧化应激诱导剂，其中以未加入过氧化氢同时未添加ole或ht的样品作为空白对照，以加入过氧化氢，但未添加ole或ht的样品作为h2o2刺激组，结果如图5所示，与空白对照组相比，h2o2刺激的细胞中的ros水平提高了6.8倍。尽管ole(12.5、25、50和100μm)的处理略有降低h2o2诱导的ros水平的趋势，但在成纤维细胞中并未显示出明显的抗氧化作用。较高浓度(50和100μm)的ht分别将h2o2诱导的ros水平分别降低了14.5％和15.2％。
[0076]
此外，通过计算ci值评估了ole和ht的组合对成纤维细胞中氧化应激的协同作用。ole和ht的比例为1:1(从6.25/6.25μm到100/100μm)的组合在成纤维细胞中显示出协同保护作用，这是由于与h2o2刺激组相比，ole+ht使成纤维细胞中的ros水平分别降低了7.6、18.4、21.0、27.6和37.3％(图6a)，皆高于单独作用时对成纤维细胞中ros水平降低的程度。此外，ole和ht的组合的ci值(从6.25/6.25μm到100/100μm)均小于1(分别为0.44、0.17、0.26、0.28和0.27)，表明ole和ht在成纤维细胞中发挥了协同的细胞保护作用(图6b)。
[0077]
上述结果表明ole和ht抑制了弹性蛋白酶的活性，并且其组合在抑制弹性蛋白酶测定中发挥了协同作用，这可能有助于含有ole和ht的植物提取物的总体抗皮肤衰老作用。另外，ole和ht的组合协同降低了人真皮成纤维细胞内的活性氧水平。因此，ole和ht能够用作有前景的抗氧化剂和皮肤护理产品的生物活性药妆产品。
[0078]
综上所述，素馨针提取物、ole和ht均具有抗弹性蛋白酶的效果，其中，ole和ht以等摩尔浓度且等体积混合时可以增强对弹性蛋白酶的抑制率，显著降低弹性蛋白酶的活性，因此，素馨针乙酸乙酯层提取物、ole和ht可用于制备抗衰老的化妆品、预防或治疗肺气肿并发症的药物。
[0079]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。