一种利用微波-亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法

一种利用微波
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亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法
技术领域
1.本发明属于生物和医药技术领域，更具体地说，涉及一种利用微波
‑
亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法。


背景技术：

2.从古至今，人们对于美白的追求就像人类对于光明的追求一样从未停止。据统计，全球大约有15％的人会购买美白产品，其中亚洲占主导地位。这些皮肤美白产品的作用机制主要是减少黑色素，而黑色素是决定皮肤颜色的主要来源，黑色素越多，皮肤颜色越深，反之则浅，因此，美白化妆品功效评价往往通过皮肤黑色素含量的减少程度来进行评判。目前，人工合成的美白剂很大一部分是自然界中原本不存在的，它们在实现某种功能的同时不可避免地存在着负面的效应，因此，从自然界中寻求天然来源的美白剂成为科研、市场和消费者关注的热点。
3.市面上大多数化妆品或美白剂都是采用酪氨酸酶抑制剂，如对苯二酚、曲酸及衍生物、熊果苷及其衍生物等已被用作美白剂。对苯二酚是一种活性较高的黑色素抑制剂，但性质很不稳定，易在空气中氧化变色，且有引起皮肤永久性白斑的报道，因此，对苯二酚已被国内外限制或禁止使用于美白化妆品中，仅在临床上用于治疗皮肤色素沉着性疾病。曲酸是真菌好氧发酵的一种产物，部分曲酸衍生品已在化妆品领域得到市场化，但是曲酸潜在的致癌性和贮存过程中的不稳定性限制了其在化妆品中的应用。熊果苷是天然活性物质，祛斑和美白效果好，且毒副作用极小，是目前国内外常用的有效的高端化妆品美白添加剂。熊果苷有α
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熊果苷和β
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熊果苷两种异构体，α
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熊果苷在美白功效和安全性上远远优于β
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熊果苷，但两者来源完全不同，β
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熊果苷可通过植物提取、植物细胞培养和人工合成三种方法获得，由于天然资源匮乏、提取步骤复杂及提取产率低等局限，目前市场上的β
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熊果苷基本都是由对苯二酚人工合成的，存在对苯二酚残留的风险；α
‑
熊果苷一般通过不同的微生物转化法和酶合成法进行制备，产量少。脱氧熊果苷是基于熊果苷的活性，根据定量构效关系设计合成的高效酪氨酸抑制剂，其效果是一般熊果苷的350倍，但存在收率低、成本高、污染大、操作复杂、难以实现工业化生产等缺点。因此，迫切需要开发具有高活性、高稳定性、高安全性且易得的新型酪氨酸酶抑制剂。
[0004]6′‑
o
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咖啡酰熊果苷是从雀嘴茶中发现的一种新型黑色素抑制化合物，研究表明6
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o
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咖啡酰熊果苷的黑色素抑制活性优于β
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熊果苷，毒性却低于β
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熊果苷。雀嘴茶是一种传统的民间饮品，除了6
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o
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咖啡酰熊果苷，其提取物中的绿原酸和β
‑
熊果苷也是主要活性成分，也都具有黑色素抑制作用，因此，以雀嘴茶提取物直接作为黑色素抑制剂不仅可以降低生产成本，而且由于抗氧化活性成分之间的协同作用可起到增效作用。
[0005]
目前雀嘴茶中活性成分的提取技术主要有水提和醇提，由于醇提存在溶剂残留等问题，水提是较为普遍采用的技术。然而与醇提物相比，水提法由于提取的有效成分较少，所得提取物活性较低。此外，无论是水提还是醇提，都具有流程长、耗时多等问题。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用微波
‑
亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法，具有不采用溶剂、流程短等优势，所得雀嘴茶提取物对酪氨酸酶具有显著的单酚酶抑制和二酚酶抑制作用，且活性优于传统水提所得的雀嘴茶提取物。
[0007]
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0008]
一种利用微波
‑
亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法，将雀嘴茶粉碎过筛，置入消解罐，加入水作为萃取剂，将消解罐置于微波消解仪中，在控制压力和微波功率，使得水处于亚临界状态下进行萃取，获得提取液，经过滤、干燥后，即得雀嘴茶提取物。
[0009]
所述的雀嘴茶粉碎过筛为过20目和40目筛，保留40目筛物料使用。
[0010]
所述的利用微波
‑
亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法，雀嘴茶粉与去离子水的料液比为1g∶20～40ml。
[0011]
所述的利用微波
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亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法，萃取压力为0
‑
20mpa。
[0012]
所述的利用微波
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亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法，微波功率400～800w下，提取10～30min。
[0013]
所述的利用微波
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亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法，将雀嘴茶提取物进行甲醇或乙醇重结晶，得到精制的雀嘴茶提取物。
[0014]
所述的利用微波
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亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法，将干燥的雀嘴茶粉碎过筛，取1g置入消解罐，加入30ml去离子水作为萃取剂，将消解罐置于微波消解仪中，在萃取压力0～15mpa、微波功率600w下，提取15min；所得提取液经过滤、干燥后，即得雀嘴茶提取物。
[0015]
所述的利用微波
‑
亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法，将干燥的雀嘴茶粉碎过筛，取1g置入消解罐，加入30ml去离子水作为萃取剂，将消解罐置于微波消解仪中，在萃取压力0～15mpa、微波功率600w下，提取15min；所得提取液经过滤、干燥后，即得雀嘴茶提取物；将雀嘴茶提取物进行甲醇或乙醇重结晶，得到精制的雀嘴茶提取物。
[0016]
所述的利用微波
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亚临界水萃取制备雀嘴茶提取物的方法所获得的雀嘴茶提取物及其精制产物。
[0017]
所述的雀嘴茶提取物及其精制产物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。
[0018]
有益效果：相比于现有技术，本发明的优势为：
[0019]
1)本申请利用微波
‑
亚临界水萃取技术来制备雀嘴茶提取物，方法简单，步骤少，容易操作，无溶剂参与，因此产物中无溶剂残留，是绿色环保的方法。
[0020]
2)实验证实，本申请所制备的雀嘴茶提取物，富含6
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o
‑
咖啡酰熊果苷、β
‑
熊果苷和绿原酸等成分，具有更好的抑制酪氨酸酶活性，降低黑色素生成的功能，可用作化妆品中的美白成分，也可作为食品添加剂及杀虫剂中的有效成分。
附图说明
[0021]
图1是雀嘴茶提取物3的单酚酶抑制活性测定结果图；
[0022]
图2是雀嘴茶提取物3的二酚酶抑制活性测定结果图。
具体实施方式
[0023]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0024]
以下实施例中，高效液相色谱条件：色谱柱为c
‑
18(150mm
×
4.6mm，5μm)柱，检测波长为280nm，流动相a为含1％乙酸的水，流动相b为甲醇，梯度洗脱条件为：0.0
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6.0min(5％b)，6.0
‑
6.1min(5％
‑
10％b)，6.1
‑
28.0min(10～70％b)，28.0
‑
28.1min(70％
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95％b)，28.1～38.0min(95％
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5％)，流速为1.0ml/min，进样量为5μl，柱温在检测过程中设定为25℃。
[0025]
提取率的计算：1)绘制标准曲线：称取6
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o
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咖啡酰熊果苷标准样品10mg，用去离子水溶解后，定容于100ml容量瓶中，摇匀后，得到质量浓度为1.0mg/ml的母液。分别精确量取2.00ml、4.00ml、6.00ml、8.00ml和10.00ml的母液于10ml的容量瓶中，去离子水定容至刻度后摇匀。利用高效液相色谱仪分别测定不同浓度的标准溶液，以峰面积为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。2)计算6
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o
‑
咖啡酰熊果苷提取率：将不同提取条件下获得的提取物稀释定容后，每个样品取5μl进行高效液相色谱分析，将所得的6
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o
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咖啡酰熊果苷色谱峰对应的峰面积代入标准曲线对应的线性回归方程，获得6
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o
‑
咖啡酰熊果苷在提取液中的质量浓度，根据公式1计算雀嘴茶中6
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o
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咖啡酰熊果苷提取率：
[0026][0027]
式中：c为根据标准曲线查到的6
′‑
o
‑
咖啡酰熊果苷在提取液中的质量浓度，单位为mg/ml，v为提取液的体积，单位为ml，m为雀嘴茶的质量，单位为g。
[0028]
实施例1
[0029]
方案1：将干燥的雀嘴茶粉碎过筛(过20目和40目，留40目)，取1g置入消解罐，加入30ml去离子水作为萃取剂，料液比1∶30，将消解罐置于微波消解仪中，在萃取压力0mpa、微波功率600w下，提取15min。所得提取液经过滤、干燥后，即得雀嘴茶提取物1。
[0030]
方案2：将干燥的雀嘴茶粉碎过筛，置入消解罐，以亚临界水为萃取剂，保证料液比1∶30，将消解罐置于微波消解仪中，在萃取压力1.5mpa、微波功率600w下，提取15min。所得提取液经过滤、干燥后，即得雀嘴茶提取物2。
[0031]
利用高效液相色谱仪分析提取液中6
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o
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咖啡酰熊果苷、β
‑
熊果苷和绿原酸的含量，采用外标法，分别采用6
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o
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咖啡酰熊果苷标准品、β
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熊果苷标准品和绿原酸标准品绘制标准曲线，将提取液的液相色谱图中每个活性物质对应的峰面积分别代入标准曲线中对应的线性回归方程，获得各物质在提取液中的质量浓度，结合提取液稀释倍数求得样品溶液中各活性物质的含量，单位用mg/g表示。
[0032]
表1雀嘴茶提取物中6
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o
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咖啡酰熊果苷、β
‑
熊果苷和绿原酸的含量
[0033][0034]
从表1的数据可知，雀嘴茶提取物中含有6
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o
‑
咖啡酰熊果苷、β
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熊果苷和绿原酸三种成分，且6
′‑
o
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咖啡酰熊果苷含量高于绿原酸和β
‑
熊果苷。
[0035]
雀嘴茶提取物的单酚酶抑制活性测定：将不同浓度的雀嘴茶提取物溶液、pbs溶
液、酪氨酸酶溶液依次加入到96孔板，设3个复孔，再37℃下孵育10min，再向每个孔加入一定量的l
‑
酪氨酸底物触发反应，混合均匀，以熊果苷为阳性对照，用酶标仪检测溶液在475nm处连续测定30min，重复测定3次。计算抑制率。
[0036]
雀嘴茶提取物的二酚酶抑制活性测定：将不同浓度的雀嘴茶提取物溶液、pbs溶液、酪氨酸酶溶液依次加入到96孔板，设3个复孔，再37℃下孵育10min，再向每个孔加入一定量的l
‑
多巴底物触发反应，混合均匀，以熊果苷为阳性对照，用酶标仪检测溶液在475nm处连续测定30min，重复测定3次。计算抑制率。
[0037]
表2雀嘴茶提取物的酶抑制活性测定结果
[0038] 单酚酶抑制率二酚酶抑制率雀嘴茶提取物126.13％12.05％雀嘴茶提取物246.93％86.73％
[0039]
从表2的结果可知，
[0040]
实施例2
[0041]
取实施例1制备的雀嘴茶提取物1，经甲醇或乙醇重结晶后，可得到雀嘴茶提取物3，收率为90％，经检测主要成分为6
′‑
o
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咖啡酰熊果苷产品，对其进行酶活测定。其中，甲醇或乙醇重结晶精制为：将提取物加甲醇或乙醇制成热的饱和溶液，冷却结晶，抽滤除去杂质，重复1次。
[0042]
雀嘴茶提取物3的单酚酶抑制活性测定：将不同浓度的雀嘴茶提取物溶液、pbs溶液、酪氨酸酶溶液依次加入到96孔板，设3个复孔，再37℃下孵育10min，再向每个孔加入一定量的l
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酪氨酸底物触发反应，混合均匀，以熊果苷为阳性对照，用酶标仪检测溶液在475nm处连续测定30min，重复测定3次，抑制率达59.16％(图1)。
[0043]
雀嘴茶提取物3的二酚酶抑制活性测定：将不同浓度的雀嘴茶提取物溶液、pbs溶液、酪氨酸酶溶液依次加入到96孔板，设3个复孔，再37℃下孵育10min，再向每个孔加入一定量的l
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多巴底物触发反应，混合均匀，以熊果苷为阳性对照，用酶标仪检测溶液在475nm处连续测定30min，重复测定3次，抑制率达95.62％(图2)。
[0044]
雀嘴茶提取物3对小鼠的急性毒性试验：用cmc
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na溶解雀嘴茶提取物3获得不同浓度的溶液，观察24h内多次灌胃对小鼠产生的急性毒性反应和死亡情况，并连续观察14天。结果显示，雀嘴茶提取物3在24h内2次灌胃给予小鼠，其最小致死量(mld)为23.848g
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kg
‑1(分别相当于临床人拟用剂量14306倍、折合小鼠等效临床剂量的1312倍)，最大耐受量(mtd)为20.272g
·
kg
‑1(分别相当于临床人拟用剂量12161倍、折合小鼠等效临床剂量的1116倍)。证实雀嘴茶提取物3是安全可靠的。