Corilagin在制备用于支架涂层药物中的应用

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及corilagin在制备用于支架涂层药物中的应用。

背景技术：

心脑血管疾病(cardiovasculardiseases,cvd)是一类严重危害人类健康和生命的重大疾病，在世界范围内，每年约有1670万人死于cvd，占全球死亡率第一位，而动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)是cvd发生发展的重要病理基础。冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病，是血管疾病中的常见病和多发病，严重危害人类的健康。经皮腔内冠状动脉介入治疗(percutaneouscoronaryintervention,pci)已成为当前治疗冠心病的主要手段，是目前冠心病血运重建的主要方法之一，但术后支架内再狭窄(intra-stentrestenosis，isr)在一定程度上限制了其应用，支架的置入虽然可以防止血管的弹性回缩和其晚期重塑，但isr发生率仍在15％～30％左右。isr的发生原因多是由于支架植入局部微血栓形成和并发炎症反应。支架植入后受损内皮的皮下组织暴露,激活血小板,造成血小板在局部粘附和聚集,释放多种血管平滑肌生长因子和凝血因子,作用于血管平滑肌细胞(vsmc),使之由静息状态进入到增殖状态,从而导致vsmc的迁移、增生和基质改建,共同形成增生的内膜组织。

临床上pci术后一般口服氯吡格雷和阿司匹林等药物以防治isr的发生，虽然有一定疗效，但对isr致急性冠脉事件发生的预后仍不乐观。长期以来试图通过药物抑制新生内膜形成一直是国内外研究的主要热点，近年来，欧美等国家已先后从具有免疫活性的药物中筛选出多种药物用于预防支架内isr的药物，如雷帕霉素(sirolimus,rapamycin)，紫杉醇、依维莫司等，部分药物在临床上已取得了很好疗效，因此从毒副作用相对较小的中药中寻找抗isr药物已成为国内外新的研究热点。因此，无论从基础研究还是从临床应用角度，寻找疗效肯定、不良反应较少的抗rs的药物是十分必要和迫切的。

技术实现要素：

本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：

本发明corilagin在制备用于支架涂层药物中的应用。

优选地，所述corilagin为corilagin单体和/或corilagin盐。

优选地，所述corilagin通过抑制vsmcs的增殖、迁移，同时诱导平滑肌细胞的凋亡而发挥抗isr的作用。

优选地，corilagin涂层支架为0.6-2.8μg/mm²，可有效抑制猪冠状动脉内膜增生，显示出良好的组织相容性和安全性。

优选地，所述corilagin具有抗isr的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为:

1)本发明建立egf诱导的vsmcs增殖模型，结果证实corilagin能够抑制vsmcs的增殖、迁移，同时诱导平滑肌细胞的凋亡，为进一步验证corilagin预防pci术后抗isr的价值，我们建立临床前猪冠状动脉支架模型，将不同剂量的corilagin涂层在支架表面，以雷帕霉素涂层支架为阳性对照组，金属裸支架为阴性对照组，冠脉造影评估corilagin涂层支架预防pci术后再狭窄的安全性和有效性，研究结果证实:corilagin涂层支架可有效抑制猪冠状动脉内膜增生，且显示出良好的组织相容性和安全性。

2)本发明为corilagin作为天然来源的药物支架涂层临床用于防治pci术后isr提供理论依据和实验支持。

以下将结合附图与具体的实施例对本发明进行详细的解释说明。

附图说明

图1为本发明提供的corilagin的化学结构式意图。

图2为本发明提供的corilagin在不同时间点抑制vsmcs的迁移。

图3为本发明提供的corilagin抑制vsmcs的迁移的统计学分析。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

corilagin(β-1-o-galloyl-3,6-(r)-hexahydroxydiphenoyl-d-glucose，1-酰-3,6六羟基联苯二甲酰基葡萄糖，图1)，是从云南省特色药用植物叶下珠中提取的水溶性多酚类单体化合物。我们前期研究显示，corilagin能保护血管内皮细胞，明显减少lox-1的蛋白和mrna表达；corilagin能降低血管平滑肌细胞中nf-κb的蛋白及mrna表达；corilagin还能下调巨噬细胞中炎症疾病标志物crp的蛋白及mrna表达，提示corilagin在防治isr方面具有进一步深入研究的价值。

corilagin，购自中国药品生物制品检定所，分子量634.46，纯度99.5％，为黄褐色粉状物，无臭，避光干燥保存。(1)人脐动脉来源vsmc购自上海沪峰生物科技有限公司，为防止因传代次数过多，细胞性质改变而影响实验结果，文献上多用较早期的细胞：3-8代vsmc，本实验选择生长良好的第4-10代细胞用于实验。

1.vsmcs培养与传代

vsmcs细胞用含有10％胎牛血清的dmem完全培养基，在37℃，5％co2，95％饱和湿度的co2培养箱中培养。细胞80％～90％融合后，弃培养基，用pbs液清洗3次，加入0.25％胰酶消化，摇动并轻轻拍打培养瓶使细胞脱离瓶壁，显微镜下观察。当细胞收缩变圆，脱离瓶壁后，加入完全培养基中止消化，1000r/min离心5min，弃上清液，加入新的完全培养基把细胞吹散，分瓶传代。传代培养后，3天更换一次培养基。

(2)实验分组：

将细胞随机分为8个组

1)对照组(control)：正常血管平滑肌细胞(vsmcs)

2)模型组(model)：egf10ng/ml+vsmc

3)corilagin组：corilagin25ug/ml+egf15ng/ml+vsmcs

4)corilagin组：corilagin50ug/ml+egf15ng/ml+vsmcs

5)corilagin组：corilagin100ug/ml+egf15ng/ml+vsmcs

6)辛伐他汀组：10ug/ml+egf15ng/ml+vsmcs

以上各组细胞置于含10％胎牛血清(gibco)的dmem高糖培养基。37℃，5％co2、饱和湿度培养箱内培养。

2.corilagin抑制vsmcs的增殖

用mtt比色法测量各组光密度(od)值，od值反映细胞生长与增殖情况。egf模型组od值与对照组相比明显升高，(p<0.01)，提示egf可促进vsmcs的增殖，造模成功，见表1。

表1.mtt法检测corilagin对vsmcs增殖的影响

空白对照组与模型组比较，**p<0.01

分别用含有不同浓度(25,50,100ug/ml)corilagin的完全培养液与vsmcs共同孵育48小时，mtt比色分析结果显示随着药物浓度的增加细胞存活率逐渐下降，与模型组的差异有显著地统计学意义(p<0.01)，证实corilagin有明显抑制vsmcs增殖的作用，见表2。

为测定不同时间点corilagin对vsmcs的作用，于加药(25，50,100ug/ml)后的第24、48、72小时进行mtt比色测定，结果证实各浓度组均具有显著抑制作用(p<0.01)。corilagin对vsmcs的存活率的影响随着孵育时间的延长而逐渐下降，至72小时各浓度组vsmcs的存活率分别达26％、8.9％、5.9％，证实corilagin对vsmcs的抑制作用呈浓度和时间依赖性。(表3)

表2不同浓度corilagin作用于vsmcs48h后对细胞存活率的影响

注：各实验组与模型组相比，*表示p<0.01

表3不同浓度和时间corilagin作用于vsmcs后对细胞存活率的影响

注：各实验组与模型组相比，*表示p<0.01。

3.corilagin抑制vsmcs的迁移

单层培养细胞刮片法统计分析结果表明，与对照组相比，不同浓度的corilagin对vsmcs迁移距离抑制均有显著的统计学意义(p<0.01),且corilagin的这种抑制作用与其浓度呈现依赖性，50ug/ml浓度的corilagin对vsmcs迁移的抑制率为49.8％，而100ug/ml浓度的corilagin对vsmcs的迁移抑制率达79.3％，见图2。

4.corilagin诱导vsmcs的凋亡

流式细胞术检测不同浓度corlagin处理vsmcs细胞48h后发生细胞调亡的变化。50ug/ml和100ug/mlcorilagin处理vsmc48h后发生晚期调亡的细胞比例分别为9.59土2.13％和20.35土3.52％；正常活细胞的比例分别为82.20土1.43％和62.85土1.35％，与空白对照组相比，p<0.01，结果有显著的统计学差异；100ug/mlcorilagin处理vsmc48h后发生早期调亡的细胞比例为8.36土2.92％，p<0.05,有统计学差异，见表4。

表4流式细胞术检测corilagin处理vsmc细胞48h细胞凋亡的变化

与空白对照组(control)相比，^#p＜0.05，有统计学差异；*p＜0.01，有显著的统计学差异；^△△p＜0.01，有显著的统计学差异。

实施例3：临床前猪冠状动脉支架模型的建立及冠脉造影检查

1.小型猪的分组，处理

(1)将20头小型猪随机平均分为阴性对照组(baremetalstent,bms)、corilagin低剂量支架组(0.14μg/mm²)、corilagin中剂量支架组(0.70μg/mm²)、corilagin高剂量支架组(2.8μg/mm²)、阳性对照组(sirolimus-elutingstent,ses)，并记录小型猪身上所标记的数码。

(2)冠脉造影及支架植入术冠脉造影

实验动物全麻后通过右股动脉或左股动脉途径行左、右冠状动脉造影，于前降支(leftanteriordescendingbranch,lad)、右冠状动脉(rightcoronaryartery,rca)或回旋支(leftcircumflex,lcx)分别置入同一类型支架各一枚，支架血管直径比率为1.1～1.2:1，应用oct技术观察支架贴壁情况，所有观察对象28天均再次行冠脉造影，冠脉造影定量测量参照血管内径，支架内最小内径，计算狭窄程度。

3.结果

3.1冠脉造影及定量分析

支架置入28天后行冠脉造影评估，中剂量corilagin组及阳性对照组目测法未见支架内明显狭窄，阴性对照组、低剂量corilagin组、高剂量corilagin组可见不同程度支架内再狭窄。定量测量并计算各组狭窄程度：阴性对照组0.25±0.05，低剂量corilagin组0.25±0.03，中剂量corilagin组0.10±0.03，高剂量corilagin组0.20±0.02，阳性对照组0.10±0.05。狭窄程度＝(参照血管内径-支架最小内径)/参照血管内径(见表5)

表528天组血管造影定量结果

注：和阴性对照组相比,*p<0.05,**p<0.01

结果提示，和阴性对照组相比，corilagin中、高剂量组、阳性对照组狭窄程度差异有统计学意义(p＜0.05)。corilagin涂层支架中、高剂量组可呈剂量依赖性抑制小型猪冠状内膜增生，低剂量组无明显效果，同时阴性对照组、corilagin低、中剂量组均见不同程度血管腔的狭窄，高剂量和阳性对照组未见明显的血管腔狭窄。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。