海参内脏提取皂苷和黏多糖的生产工艺及其用于制备海参丹的应用的制作方法

1.本发明属于海洋生物技术领域，具体报道了一种从刺海参内脏提取海参皂苷和黏多糖的生产工艺。应用该提取的海参皂苷和黏多糖为主要成分，添加少量的超氧化物歧化酶、活性多肽、核苷酸、ve、vb等，制备海参精华素高级营养品海参丹。该海参丹具有显著的提高免疫能力、抗癌防癌作用、抗衰老、抗凝血/血管损伤等生理功效。


背景技术：

2.海参是一种珍贵的海洋生物,海参富含蛋白质,含有少量脂肪,几乎不含胆固醇,是优良的滋补食品。作为我国的一种传统中药,海参有着养血润燥、补肾益精等功效,自古以来便是滋补的名贵食品和防治一些疾病的良药。近年来,海参中多种具有调节生理活性的功能性化学物质被陆续分离获得,如海参多糖、三萜皂苷、脂肪酸、多肽、神经节苷脂等。传统海参干品的加工方法粗糙，水发时间长，营养损失大。近几年市场上出现了一些深加工的产品，深加工的海参产品附加值高，增加了科技含量，但是缺乏产品的有效成分鉴定和质量控制指标。
3.皂苷是海参的次级代谢产物，也是海参进行化学防御的物质基础。海参皂苷的分离纯化过程繁琐复杂，要得到单体化合物具有很大的困难。不同海参受分类和生长环境的影响，所含皂苷成分各不相同，同一种海参体内也存在着一系列差别细微、结构相似的皂苷类成分，这些更增加了海参皂苷分离纯化的困难。海参皂苷具有十分复杂的化学结构，具有较大的分子量，一般都在1000以上。研究早期，主要借助于繁杂的化学方法来研究海参皂苷的结构组成，随着质谱技术和核磁共振技术的发展，海参皂苷的结构测定速度和准确度都得到了极大的提高。海参皂苷的结构鉴定主要依靠ms、nmr等光谱手段，同时需要借助一些化学反应来确定糖链、取代基、双键等结构信息。
4.海参皂苷生理功能具有降脂减肥作用。摄食海参总皂苷的小鼠脂肪细胞比高脂小鼠明显变小，甚至小于正常组。说明摄食海参总皂苷对小鼠食欲影响很小，却能明显使小鼠脂肪细胞变小，短期内体重即能明显减轻小鼠体重。海参总皂苷具有很好的降脂减肥作用。
5.降尿酸作用。海参总皂苷元在次黄嘌呤和氧嗪酸钾造成的大鼠高尿酸血症模型中都可以降低血清尿酸值，总皂苷元活性随剂量增大而升高，药物需要剂量较大，活性明显低于阳性药别嘌呤醇，但作为食物来源的提取物，海参总皂苷元有望开发成为防治高尿酸血症的新药或前体药物。抗菌和抗肿瘤作用，三萜皂苷类化合物，其抗真菌及抗肿瘤活性从实验数据分析与糖链长短呈正比关系，进一步说明了化合物中的糖链结构与其活性之间存在一定的关系。溶血作用，大多数海参皂苷都具有较强的溶血活性。海参是民间珍贵的药膳食品，海参体壁中含有的多糖成分具有抗肿瘤、抗血凝、抗放射、增强免疫力等多种生理功能。海参多糖具有良好的保健功能，许多海参多糖的产品已作为保健食品进行开发。以海参为原料研制的海参口服液，认为其对机体的免疫调节和抗肿瘤的作用显著。海参多糖中氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、硫酸酯含量分别为16.40％、19.40％、11.08％、和28.15％。海
参多糖的结构特性包括其相对分子质量、单糖组成、一级结构以及高级结构。在不同种类的海参中，两种形式的海参多糖sc-fcs和sc-fuc的结构特性间存在较大差异。海参多糖一级结构的研究主要侧重于其单糖间连接方式、支链及硫酸化模式。具有随机螺旋或刚性棒状链构象，其链构象由多种因素 (分子量、硫酸盐含量、海参种类及盐溶液浓度)综合决定。
6.本研究的目的是报道一种从海参内脏提取海参皂苷和黏多糖的生产工艺。应用该提取的海参皂苷和黏多糖为主要成分，添加超氧化物歧化酶、活性多肽、核苷酸、ve、vb等，制备海参高级营养品海参丹。该海参丹具有显著的提高免疫能力、抗癌防癌、抗衰老、抗凝血等生理功效。因此，海参内脏提取的海参皂苷和黏多糖及用其制备的海参丹在高级营养食品、特异功能保健品和海洋生物医药开发方面具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

7.1、海参内脏提取海参皂苷和黏多糖的生产工艺，其特征为：(1)取鲜海参内脏，经细胞破壁机破碎，用60％乙醇在50度水浴中回流提取，高速离心，收取上层清液，旋蒸干后，用95％乙醇再次提取，提取液旋蒸干，经纯化得到海参皂苷和多糖；(2)海参皂苷的纯化，初产物用大孔树脂层析分离，穿流收集，用于进一步纯化海参多糖；吸附在大孔树脂层析柱上的皂苷用80％乙醇洗脱，洗脱液旋蒸干燥，进而用正丁醇萃取，正相和反相硅胶柱层析，最后经高压液相色谱分离纯化； (3)在(2)中大孔树脂层析柱流窜溶液海参多糖，再经deae
‑ꢀ
sepharose f.f.柱层析进行分级纯化,以氯化钠溶液梯度洗脱海参多糖, 收集组分,真空冷冻干燥得白色海参纯品。
8.2、海参丹的组成及制备方法。其特征为：(1)海参丹的主要成分包括但不限于海参皂苷、海参多糖、海参活性多肽、氨基酸、核苷酸、超氧化物歧化酶、ve、vb等；(2)以上成分按配比混合后，添加调味剂、防腐剂，做成各样剂型。
9.3.基于权利要求2，海参丹包含不同规格的单位制剂，包括但不限于胶丸、胶囊、含片、肠溶性胶囊、速溶颗粒、糕方、口服液、鼻腔滴注、鼻腔喷剂等。
10.4、基于权利要求2，海参丹可用于特异功效的保健品、营养食品，调节生理功能，预防疾病的发生发展，包括但不限于提高免疫力、防止肿瘤、心脑血管硬化损伤、自身免疫疾病、预防神经退行性疾病等。
11.5、海参丹在海洋生物医药开发方面的应用，在制备多种疾病药物中的应用，包括但不限于肿瘤、自身免疫疾病、神经退行性疾病、心脑血管损伤、糖尿病等药物中的应用。
附图说明
12.图1：海参皂苷化合物
ⅰ‑ⅲ
的结构式
具体实施方式
13.下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
14.实施例1：从海参内脏提取、分离与纯化海参皂苷
15.海参来源：蓬莱海洋(山东)股份有限公司鲜海参820克具体步骤：820克新鲜海参内脏222g用细胞破碎机破碎，用60％的乙醇在50 度回流浸提12h，减压旋蒸回收乙醇，得到
的浸膏用水溶解，上样于hp-20型的大孔树脂柱中，分别用水，80％以及95％的乙醇溶液进行洗脱，收集80％乙醇洗脱部分减压旋蒸、干燥，得到粗海参皂苷(干重，4.81克)。粗总皂苷进一步用正相硅胶柱层析，以氯仿：甲醇：水(10:1:0.1-7:3:0.3,体积分数)进行梯度洗脱，洗脱组分经硅胶板薄层层析检测后，合并迁移率相同的洗脱组分，用制备型hplc纯化(色谱柱：aa12s05-2510wt ods c18，流动相：甲醇-水，流速： 1.5ml
·
min-1，检测波长：205nm)。将粗总皂苷进一步经硅胶柱层析,合并迁移率相同的洗脱组分，获得3个组分，得到海参皂苷化合物ⅰ(7.5mg)和海参皂苷化合物ⅱ(33.5mg)，海参皂苷化合物ⅲ(12.8mg)。
16.海参皂苷的结构鉴定：海参皂苷具有十分复杂的化学结构，具有较大的分子量，一般都在1000以上。海参皂苷的结构鉴定依靠ms、nmr等光谱手段，同时需要借助一些化学反应来确定糖链、取代基、双键等结构信息。海参皂苷化合物
ⅰ‑ⅲ
的的结构式如附图1所示。
17.皂苷的产率：海参皂苷定量分析方法用比色法。比色法主要采用香草醛-高氯酸作为三萜皂苷的显色剂。将echinoside a标准品于105度干燥至恒重，精准称取10.69mg皂苷用60％乙醇定容至10ml配置成标准溶液，分别取0.1，0.2， 0.3，0.4，0.5ml皂苷标准溶液于6*10ml具塞试管中，90度挥发干溶剂，加测试溶液(5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，混匀，60℃水浴15min，冰水浴冷却，加冰醋酸5ml，混匀，室温放置10min)，反应溶液于560nm处比色测定。测定得到的的精品皂苷总量为1.49g，海参皂苷的产率为0.67％。
18.实施例2：从海参内脏提取分离纯化海参多糖
19.新鲜海参内脏222g用细胞破壁机破碎，用60％的乙醇50度回流浸提12h，减压旋蒸得到流浸膏，用纯净水溶解，经过hp-20型的大孔树脂柱分离，hp-20型的大孔树脂柱穿流液再用deae-sepharose f.f.柱层析进行纯化,以2.0mol/l 氯化钠溶液梯度洗脱deae-sepharose f.f.柱，得到海参多糖,真空冷冻干燥得白色纯品，以硫酸-苯酚比色法，用葡萄糖与苯酚做标准曲线，测定多糖含量，得到3.5克海参内脏多糖，产率是1.6％(鲜海参内脏222克)。
20.实施例3：海参丹的制备
21.原料：海参皂苷(实施例1制备)、海参多糖(实施例2制备)、超氧化物歧化酶 (杭州星鳌生物科技公司)、海参冻干粉(蓬莱海洋(山东)股份有限公司)、维生素e(济南东轩生物工程有限公司)、复合维生素b(湖南世纪华星生物工程有限公司)、薄荷提取物(陕西森弗天然制品有限公司)。
22.制备方法：称取海参皂苷(5克)、海参多糖(75克)、超氧化物歧化酶(8克)、海参活性肽/核苷酸(1克)、维生素e(5克)、复合维生素b(5克)、薄荷提取物(1克)。混合均匀，粉碎成细粉。该细分可以制成各种剂型，包括但不限于胶囊、肠溶性胶囊等。胶囊外壳可用丙烯酸酯/或醋酸纤维素酞酸酯涂抹制成肠溶性胶囊剂。
23.实施例4：采用小鼠皮下移植瘤模型研究海参丹抗肿瘤作用
24.动物及其饲养条件：balb/c普通小鼠、c57bl/6普通小鼠，雄性，体重20 －22g，7-8周龄，spf级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23
±
2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为spf级。
25.剂量设置：1克/kg/天；
26.阴性对照：pbs溶液；
27.给药方法
28.给药途径：灌胃给药
29.给药体积：300微升/只
30.给药次数：每天1次，连续21天
31.每组动物数：10只
32.肿瘤细胞株
33.小鼠结直肠癌细胞株ct26，小鼠乳腺癌细胞株4t1，均购自中国科学院细胞库。
34.试验主要步骤
35.肿瘤模型鼠的建立与干预
36.细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0
×
107)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2ml细胞悬液(细胞数目为2.0
×
106个/只)，8天左右致瘤成功，随机均分为5组，分别为a：阴性对照组(pbs组)、b：海参丹1组(海参丹0.5克/kg)、c：海参丹2组(海参丹1.0克/kg)；d，海参皂苷 (0.5克/kg)、e，海参多糖(0.5克/kg)。每天给药1次，连续给药21天。21天后，处死小鼠并称瘤体重量，抑瘤率＝[1-实验组平均瘤重/a组平均瘤重]]
×
100％。考察海参丹抗肿瘤效果。
[0037]
统计分析
[0038]
数据用x
±
s表示，利用spss10.0软件进行处理，采用单因素方差分析 (one-way anova)检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a＝0.05。
[0039]
实验结果
[0040]
小鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功皮下移植瘤模型，海参丹有明显抑制肿瘤生长效果，给药21天后的瘤重均显著低于阴性对照组(p《0.05，p《0.01)。海参丹组具有明显的量效关系，海参丹组的抗肿瘤效果显著比海参皂苷或海参多糖组的药效好。具体结果见下表1。
[0041]
表1.海参丹对balb/c鼠结直肠癌细胞ct26皮下移植瘤的抑制作用 (n＝10，mean
±
sd)
[0042][0043]
注：*p《0.05vs阴性对照组；**p《0.01vs阴性对照组.
[0044]
表2.海参丹对balb/c鼠乳腺癌4t1皮下移植瘤的抑制作用 (n＝10，mean
±
sd)
[0045][0046]
注：*p《0.05vs阴性对照组；**p《0.01vs阴性对照组.
[0047]
实施例5：海参丹诱发免疫功能研究
[0048]
小鼠免疫：c57bl/6雄性小鼠，6-8周，体重20-22克；
[0049]
小鼠分组：每10只一组，共5组，分别为，a：ova+海参丹1；b:ova + 海参丹2；c：ova；d，ova+海参皂苷；e，ova+海参多糖。
[0050]
每只小鼠腹腔注射10微克ova和100微克(海参丹1)或200微克(海参丹2)的海参丹(海参丹粉末溶于pbs，配制成200微升)，100微克(海参皂苷)； 100微克(海参多糖)。分别在第1，7，14天各免疫一次，在第21天取血样。用elisa法测定海参丹诱导产生抗体的效价。实验结果见表3.测定结果显示，海参丹能有效诱导免疫功能，其效果比海参皂苷或海参多糖单独显著提高。
[0051]
表3.海参丹诱发免疫效价
[0052][0053]
实施例6：海参丹诱发免疫细胞功能效价研究
[0054]
小鼠饲养、采血等见实施例5。同型对照流式抗体购自ebiosciences,抗体磁株购于militeny biotech,流式细胞仪购于bd公司，免疫14天后取小鼠脾脏，分别研磨捣碎，过40微米孔脱过滤细胞，1000rpm离心10分钟，分离未被裂解的免疫细胞，用抗体磁株分离dc(cd40\cd80\cd86\mhcii)、t(cd8+)细胞，加入对应的fac抗体(用facs缓冲液稀释)，同型对照抗体作为阴性对照，抗体加入后孵育1小时后离心，用pbs清洗，用流式细胞仪分析样品，分选合适的细胞，测定选定细胞的荧光强度(mfi)，流式结果见表4.流式细胞测定结果显示，海参丹能显著活化树突状细胞dc和t细胞，海参丹的效果比单独的海参皂苷或海参多糖显著提高。
[0055]
表4.海参丹诱发免疫细胞活化效价
[0056][0057][0058]
实施例7：海参丹抗凝血/抗血栓功能研究
[0059]
小鼠：balb/c普通雄性小鼠，6-8周，体重20-22克；
[0060]
小鼠分组：每10只一组，共5组，分别为，
[0061]
a：空白对照组(pbs)；b：海参皂苷对照组；c：海参多糖对照组；d：海参丹1；e海参丹2。
[0062]
给药方式：每只小鼠腹腔注射给药；
[0063]
给药剂量：每天每只小鼠给药剂量：均为100微克
[0064]
在第药7天取血样，测血液中血小板、红细胞、白细胞数值。实验结果见表 5。
[0065]
表5.小鼠血常规检查结果
[0066][0067]
结果表明，小鼠给海参丹后，血小板量明显减少，而血小板数量减少是由于海参丹使血小板自身聚集性增高，导致血小板自身聚集体增多，海参丹从而达到抗凝血和抗血栓的目的。海参丹的效果比单一的海参皂苷、海参多糖的抗凝血/ 抗血栓的效果更加显著。因此，海参丹在医学中有广泛的应用前景。
[0068]
实施例8：海参丹对老年痴呆小鼠认知能力的影响
[0069]
app/ps1转基因ad模型小鼠:购自南方模式生物技术股份有限公司，4月龄，体重24-26g。
[0070]
ad鼠随机均分为5组，每组10只,5组分别为：
[0071]
a：ad模型组，阴性对照(生理盐水)；
[0072]
b：海参皂苷组，阳性对照(100微克/天/只)；
[0073]
c：海参多糖组，阳性对照(100微克/天/只)；
[0074]
d：海参丹1组，保健品(100微克/天/只)；
[0075]
e：海参丹2组，保健品(200微克/天/只)；
[0076]
溶媒：生理盐水。
[0077]
配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。
[0078]
给药方式：腹腔注射；
[0079]
给药次数：每天1次，连续60天。
[0080]
morris水迷宫实验装置及方法:
[0081]
圆形水池，直径1m，高50cm，水深30cm，池底白色，水温保持在23
±
2℃；池壁上标记四个等距离点n、e、s、w作为试验的起始点，分水池为四个象限，在第三象限中央放置平台(平台与池壁圆心距离相等)；没于水下1cm，使平台不可见。水池周围贴有丰富的参照线索(不同颜色三角形、四方形、圆、菱形置于各个象限)且保持不变，供小鼠用来定位平台。定位航行试验:试验共历时6天，每天定于固定时间段训练4次。训练开始时，将平台置于第一象限，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径，4次训练即将小鼠分别从四个不同的起始点(不同象限)放入水中。小鼠找到平台后或90秒内找不到平台(潜伏期记为90秒)，则由实验者将其引导到平台，在平台上休息10秒，再进行下一次试验。
[0082]
空间探索试验：
[0083]
定位航行试验结束24h后，撤除站台。然后将鼠由第三象限放入水中，记录鼠在180s内的游泳路径，记录鼠在目标象限(第三象限)的停留时间和穿越原站台所在位置的次数，观察受试鼠的空间定位能力。利用spss10.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-way anova)检验比较各组差异的显著性。实验结果如表6所示(a:ad模型对照组，b:海参皂苷组，c:海参多糖组,d:海参丹1组,e:海参丹2组。
[0084]
研究结果表明：海参丹组小鼠给药后60天均能明显改善阿尔茨海默症小鼠认知能力。海参丹有明显的量效关系，海参丹比单独海参皂苷或海参多糖在改善 ad模型鼠认知能力方面有明显进步，效果好。
[0085]
表6.海参丹对阿尔兹海默症小鼠认知能力改善作用
[0086]