芍药甘草汤制剂在防治肿瘤疾病中的应用

本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体涉及芍药甘草汤制剂作为唯一或主要有效成分在防治肿瘤疾病中的新用途。

背景技术：

近些年来，癌症逐渐入侵到我们的日常生活之中，其发病率呈现出明显的上升趋势并具有极高的死亡率，成为了危及人类生命与健康的重大疾病之一。随着科研的深入，人们发现许多中药组合物都表现出了潜在的良好的抗肿瘤作用。

我国是天然中草药的故乡，拥有上万种药材及上千种中成药。古代经典医疗典籍中明确记载的名方制剂更是蕴含着华夏人民在五千多年的生活实践中不断积攒起来的医疗经验，是我国传统中医药文化的精髓所在，具有十分重要的临床研究价值。

芍药甘草汤是我国古代经典名方之一，源于医圣张仲景所著的《伤寒杂病论》。本方虽然仅包含白芍和甘草(炙)两味药，但其药效成分却十分复杂，具有显著的酸甘化阴、柔肝舒筋、缓急止痛等功效。在目前的临床用药过程中，有关芍药甘草汤制剂的研究主要集中于镇痛以及抗炎作用，但关于该汤剂整体的抗肿瘤作用的研究却未见报道。

技术实现要素：

基于芍药甘草汤目前的应用情况，发明人进一步对其进行了研究，发现芍药甘草汤的抗肿瘤作用。为此，本发明提供芍药甘草汤制剂作为防治肿瘤疾病的新用途。

所述芍药甘草汤由白芍、炙甘草按照1:1重量比，加水煎煮提取而成；或将提取液过滤，取滤液，冷冻干燥机，得冻干粉。

本发明所涉及的原料药白芍及炙甘草均符合《中国药典》(2020版)的记载。本发明组方中，白芍性苦、酸，归肝、脾经，既养阴益血又缓急止痛，为君药；炙甘草性温，味甘，归心、肺、胃、脾经，可补中益气。

所述的肿瘤包括人食管癌、结肠癌、宫颈癌、胃癌。

为充分验证芍药甘草汤的抗肿瘤作用，进行如下研究：第一，进行芍药甘草汤的体外抗肿瘤活性评价，初步证明芍药甘草汤的确具有一定的抗肿瘤作用。

第二，进行细胞单克隆形成、细胞划痕实验，明确芍药甘草汤可以明显抑制癌细胞的生长、迁移。

第三，进行细胞凋亡实验，证实芍药甘草汤可以诱导癌细胞产生浓度依赖性凋亡，从而发挥直接抗肿瘤作用。

基于以上详细研究，本发明提供了芍药甘草汤作为唯一或主要有效成分在防治肿瘤疾病中的新用途，其组成中包括制药学上可接受的辅助成分。

本发明所提供的芍药甘草汤，其剂型可以为冻干粉针剂、汤剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂、注射剂、控释或缓释剂等。

与现有技术相比，本发明的优点表现在：

本发明将芍药甘草汤用于制备抗肿瘤药，不仅可以抑制癌细胞的生长、迁移，而且还可以诱导癌细胞发生凋亡，发挥直接抗肿瘤作用，拓展了芍药甘草汤新的医药作用，扩大了其临床应用范围，也为当前抗肿瘤药物的研究提供了新的研究思路与方向。对于开发自主知识产权的创新药物具有良好的指导及研究意义。

附图说明

图1为芍药甘草汤对te-1细胞生长能力的影响；

图2为芍药甘草汤对te-1细胞迁移能力的影响；

图3为芍药甘草汤对te-1细胞凋亡能力的影响。

具体实施例

为了更好的说明本发明的目的、技术方案、优点，下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细说明，但本发明的保护范围不仅限于此。

下述实施例中所用的实验材料，无特别说明，生物化学试剂均为本领域常规试剂，可以按照本领域常规方法配制而得或商购获得。

药材来源：白芍购买自安徽；甘草购买自内蒙。

药物配制：原料组成及重量配比为白芍：炙甘草＝1:1，加水煎煮提取，提取液过滤，取滤液，冷冻干燥机，得冻干粉。用二甲亚砜(dmso)将冻干粉溶解稀释为一定的浓度梯度。

实施例1芍药甘草汤对五种常见人瘤细胞(te-1，eca-109，sw-620，hela，mgc-803)的体外抗肿瘤活性评价

实验方法：

采用srb法，将处于对数生长期的肿瘤细胞消化离心并重悬计数，按照1000-10000个/孔细胞接种到96孔板中，放置于体积百分比5％co2，37℃细胞培养箱中培养24小时。待细胞完全贴壁后，弃掉旧培养基，设不加药只加培养基的阴性对照组，用完全培养基稀释药物至所需系列浓度，96孔板的每孔加入150μl相应药物浓度的含药培养基，每个浓度设3组复孔。将加完药的96孔板置于体积百分比5％co2，37℃细胞培养箱中培养48或72小时。48或72小时后将96孔板取出，弃含药旧培养基，每孔加入150μl质量百分含量10％三氯乙酸溶液，放入4℃冰箱固定两个小时。固定完成后取出，弃液，每孔每次加入300μl超纯水，洗涤三次，室温干燥一小时甚至更久。待其干燥后每孔加入200μl质量百分含量0.4％srb溶液进行染色，平板震荡20min，时间到后弃掉染色液，用质量百分含量1％乙酸洗涤三次，室温干燥透。干燥后每孔加入200μl10mmtris溶液，平板震荡20min使其充分溶解。本实验使用酶标仪在562nm处读取每孔的吸光度值,计算药物对细胞增值的抑制率，根据抑制率算出ic50值。实验平行三次，得到三次的平均值和标准差。其结果如表1。

表1芍药甘草汤的抗肿瘤抗肿瘤活性评价结果

结果分析：

从上表可以看出，芍药甘草汤对这5中常见人瘤细胞均具有较好的抗肿瘤活性，且呈现出明显的时间依赖性，可以应用于人食管癌、结肠癌、宫颈癌、胃癌细胞的抗增殖活性研究。

实施例2细胞单克隆实验

实验方法：

将对数生长期的te-1细胞以1×10⁴个/孔，接种到6孔板中，摇匀，放入细胞培养箱中。24h后，舍弃上清，沿孔壁加入空白和含有不同质量百分浓度药物的培养液(即0、2％、4％、6％)。将6孔板再次放入细胞培养箱中，每隔2-3天更换一次培养基。当细胞呈现肉眼可见的克隆时，舍弃上清，pbs清洗3次后，用多聚甲醛进行细胞固定。20min后，舍弃上清，pbs清洗3次，用结晶紫染液染色30min后，缓慢洗去染液，静置晾干，计算相应的克隆形成抑制率。

克隆形成抑制率(％)＝[(对照组的克隆数－实验组的克隆数)/对照组的克隆数]×100％

结果分析：

为探究芍药甘草汤是否会对te-1细胞的体外克隆形成能力产生影响，采用细胞单克隆实验进行验证。结果如图1所示，与nc组相比，随着受试药物浓度的增加，细胞克隆形成数量明显减少，当受试药物浓度达到6％时，几乎完全抑制了克隆形成，说明芍药甘草汤可以抑制te-1细胞的体外克隆形成。图中数据均为三次独立实验所取的平均值，其中*p＜0.05，**p＜0.01。

实施例3细胞划痕实验

实验方法：

接种te-1细胞于6孔板，摇匀后放入细胞培养箱。24h后，用100μl枪头的尖端垂直划下，进行划痕(枪头不可倾斜)。用1mlpbs清洗干净后，将空白及含有不同质量百分浓度药物的培养液(即0、2％、3％、4％、6％)沿壁加入6孔板中，放入37℃细胞培养箱中进行培养。分别于0、12、24h取样，在显微镜下进行拍照记录。

细胞迁移率(％)＝(0h的划痕宽度-培养若干小时后的划痕宽度)/0h的划痕宽度×100％

结果分析：

为探究芍药甘草汤是否会对te-1细胞体外侵袭迁移能力产生影响，采用细胞划痕实验进行验证。结果如图2所示，随着细胞培养时间的增加，nc组的划痕愈合趋势非常明显。加药组在药物浓度为2％时，对细胞划痕的愈合的抑制作用较弱。但当药物浓度达到4％-6％时，对细胞划痕的愈合具有很明显的抑制作用，表明芍药甘草汤可以抑制癌细胞的侵袭转移能力。图中数据均为三次独立实验所取的平均值，其中*p＜0.05，**p＜0.01。

实施例4细胞凋亡实验

实验方法：

采用annexinv-fitc/pi双染法，将te-1细胞以1×10⁵个/孔，接种到6孔板中，把细胞摇匀，放入细胞培养箱。24h后，舍弃上清，将空白及含有不同药物质量百分浓度的培养液(即0、24％、48％)沿侧壁加入对应孔中。把6孔板再次放入细胞培养箱中。24h后，观察细胞的生长状态，将每个孔内的悬浮细胞以及消化得到的细胞合并于同一ep管中，1000rpm离心5min，收集细胞。用bindingbuffer将细胞沉淀吹散均匀，向每个ep管中加入2μl的annexinv-fitc及2μl的pi染色液，涡旋混匀，放置在冰盒中，避光反应5-15min，用流式细胞仪进行检测。

结果分析：

分别用不同质量百分浓度的芍药甘草汤(0、24％、48％)作用于te-1细胞24h，用流式细胞仪，检测其对te-1细胞凋亡的影响。结果如图3所示，与nc组相比，随着受试药物浓度的增加，te-1细胞凋亡的比例也逐渐升高，表明芍药甘草汤可以通过诱导te-1细胞发生凋亡,发挥体外抗肿瘤作用,且具有浓度依赖性。图中数据均为三次独立实验所取的平均值，其中*p＜0.05，**p＜0.01。