含有榄香烯的药物组合物及其制备方法和用途与流程

含有榄香烯的药物组合物及其制备方法和用途
1技术领域
1.本发明涉及药物制剂领域，具体而言，涉及含有榄香烯的药物组合物及其制备方法和用途。
2

背景技术：

2.榄香烯是从植物温郁金(curcuma wenyujin y.h.chen et c.ling)、香茅(cymbopoqon citratus((dc.))stapt)等植物中提取的挥发性油状化合物。该化合物呈现淡黄色或黄色的澄明液体，有辛辣的茴香气味。目前临床上所用榄香烯为混合物，含有α-榄香烯、β-榄香烯、δ-榄香烯和γ-榄香烯，广泛用于恶性胸膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤以及其他浅表性肿瘤。由于目前上市的榄香烯以及制剂中含有蓖麻油聚羟氧酯等辅料具有较大的刺激性，因此上市药物用药后大部分病人会有较严重的静脉炎、发热、局部疼痛、过敏反应或者轻度消化道反应，以及发热等不良反应。在实际临床用药过程中由于其静脉炎的发生率过高，且复发率更高，对于静脉滴注的速度要求很高，要严格控制，造成滴注时间很长。
3.榄香烯在水中几乎不溶，脂溶性很强，尤其在石油醚、乙醚等有机溶剂中溶解性很好，其分子式为c
15h24
，仅由碳氢化合物组成。由于其独特的化学结构和理化性质，制成药物制剂时存在很大的难度和障碍，为了增加榄香烯的溶解度，将其制成注射液的过程中，上市处方添加了蓖麻油聚羟氧酯等辅料，造成其溶血严重、刺激性大的问题。另外，虽然紫杉醇白蛋白纳米制剂的上市，为解决临床副反应提供了一种新的药物制剂形式，但是常温下为油状的榄香烯的化学结构及其理化性质决定将其制备成白蛋白制剂存在诸多困难，因此，目前并未有相应研究和开发。
3

技术实现要素：

4.本技术提供了一种药物组合物，其包含榄香烯、注射用油和蛋白载体，其能有效地减少药物组合物给药到人体内的一种或多种副作用。
5.在本技术的一个或多个实施方式中，药物组合物中所用的蛋白载体包括蛋白质，可以使用任何合适的蛋白质。合适的蛋白质的实例包括但不限于白蛋白、免疫球蛋白，包括但不限于iga、脂蛋白、载脂蛋白b、α-酸性糖蛋白、β-2-巨球蛋白，甲状腺球蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白、因子vⅱ、因子viii、因子ix、因子x和类似物。蛋白载体可以是天然来源或是合成制备的。在一些实施方式中，蛋白载体是非血液蛋白质，如酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。在一些实施方式中，蛋白载体包括白蛋白，如人血清白蛋白(hsa)，牛血清白蛋白等。人血清白蛋白是高度可溶性球蛋白，mr65k，由585个氨基酸组成。hsa是血浆中最丰富的蛋白质，并且构成人血浆胶体渗透压的70-80％。
6.药物组合物，其包含β-榄香烯、注射用油和蛋白载体，其中β-榄香烯与注射用油的重量比为1:1～1:3；β-榄香烯与蛋白载体的重量比为1:0.5～1:3；最优选β-榄香烯:注射用油:蛋白载体的重量比为1：3：2.7。
7.本发明所述药物组合物的制备过程中含有有机溶剂，优选所述有机溶剂选自氯
仿、二氯甲烷、叔丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮中的一种或几种，优选所述有机溶剂为二氯甲烷与乙醇的混合溶剂；进一步优选所述乙醇与二氯甲烷与的体积比为1:1-8，更进一步优选所述乙醇与二氯甲烷与的体积比为3:7。
8.本发明药物组合物的制备过程包括以下步骤：
9.(1)称取处方量的β-榄香烯和大豆油，加入适量有机溶剂涡旋混匀，得到油相；
10.(2)取20％人血清白蛋白，加入适量超纯水稀释，得到适当浓度的人血清白蛋白水溶液作为水相；
11.(3)将油相缓慢逐滴加入至水相中，通过超声作用使油水两相均匀混合，形成初乳；将所得初乳通过高压均质机均质；
12.(4)均质后的乳液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，再通过微孔滤膜过滤除菌，即得β-榄香烯白蛋白纳米粒。
13.其中所述步骤(3)中，高压均质的压力为700-1000bar，优选1000bar；均质次数为10-25次，优选10-15次，最优选15次。
14.本发明所述药物组合物中还包含冻干保护剂，其中所述冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、海藻糖、甘氨酸、右旋糖酐中的一种或几种，进一步优选所述冻干保护剂为蔗糖，更进一步优选所述冻干保护剂的重量与所述药物组合物的溶液的体积之比为1:100-5:100g/ml，优选3:100g/ml。
15.本发明还提供了所述药物组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途，优选所述癌症包括肾上腺皮质癌、原因不明的髓样化生、aids相关的癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、颅咽管瘤、成血管细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤和恶性胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、类癌瘤、中枢神经系统淋巴瘤、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、慢性骨髓增生性疾病、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文肿瘤家族、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞癌瘤、妊娠滋养层肿瘤、头颈癌、肝癌、喉癌、白血病、唇及口腔癌、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性颈部鳞状细胞癌、多发性内分泌瘤形成综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、神经内分泌癌、口咽癌、脑肿瘤、骨转移癌、胃癌、肠癌、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、胸膜肺的胚细胞瘤、淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肺淋巴管肌瘤病、直肠癌、肾癌、肾盂及输尿管癌、横纹肌肉瘤、唾腺癌、皮肤癌、小肠癌、鳞状上皮细胞癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤及胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、或阴道癌；优选所述癌症为肺癌、肝癌、食道癌、鼻咽癌、脑肿瘤，骨转移癌、胃癌、肠癌、子宫癌、子宫颈癌、生殖细胞癌瘤、子宫内膜癌、妊娠滋养层肿瘤、乳腺癌、皮肤癌、淋巴癌、白血病、或恶性黑色素瘤；进一步优选所述癌症为脑肿瘤；更进一步优选所述脑肿瘤为神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、小脑或大脑的星形细胞瘤、恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、颅咽管瘤、成血管细胞瘤、成神经管细胞瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤或恶性胶质瘤；更进一步优选所述小脑或大脑的星形细胞瘤优选为纤维状细胞星形细胞瘤或弥漫星形细胞瘤或间变性(恶性)星形细胞瘤。
16.本发明所述药物组合物优选用于预防或治疗肺癌或脑胶质瘤。
17.本发明还进一步提供了所述药物组合物的给药方式，例如通过非肠道、通过吸入，腹腔内、膀胱内，肌肉内，静脉内、气管内，皮下，眼内，鞘内、透皮给药、直肠或阴道内给药，优选所述给药方式为静脉内给药。
18.本发明还进一步提供了盛放所述药物组合物的密封容器，优选所述密封容器为单位剂量容器或多剂量容器，优选所述药物组合物为液体组合物或干燥固体组合物，优选所述药物组合物是冻干的，优选所述药物组合物是无菌的，优选所述密封容器为预填充注射器。
19.在本技术的一个或多个实施方式中，本文所述的纳米制剂或纳米颗粒可以以干燥制剂形式存在(如冻干组合物)或悬浮于生物相容性介质中。合适的生物相容性介质包括但不限于水、含水缓冲介质、盐水、缓冲盐水、任选缓冲的氨基酸溶液、任选缓冲的蛋白质溶液、任选缓冲的糖溶液、任选缓冲的维生素溶液、任选缓冲的合成聚合物溶液、含脂类乳剂等。
20.除非另有清楚地指出，在本文中使用的“个体”是哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、人、牛、马、猫科动物、犬科动物或啮齿动物。
21.如在本文所使用，“治疗”是获得包括临床结果在内的有益或所需的结果的方法。对于本发明目的，有益或所需临床结果包括但不限于下列任一或多个：减少由疾病产生的一种或多种症状的、减轻疾病程度、稳定疾病(例如预防或延迟了疾病的恶化)、预防或延迟疾病播散(例如转移)、预防或延迟疾病发生或复发、延迟或减慢疾病进展、改善疾病状态、提供疾病的缓和(不论是部分或全部的)、减少一种或多种治疗疾病必需的其它药物的剂量、延迟疾病进展、增加生活质量和/或延长生存。在一些实施方式中，与在治疗之前相同受实验者中的相应症状相比或与没有接受组合物的其它受实验者中的相应症状相比，组合物减少了与癌症相关的一种或多种症状的严重性，为至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一种。“治疗”也包括癌症的病理后果减轻。本发明方法考虑了这些治疗方面中的任一或多种。
22.如在本文所使用的，“药学上可接受的”或“药理学相容的”意思是不是生物学的或另外不想要的物质，例如在没有引起任何显著不想要的生物效果或与组合物中包含的任何其它成分没有以有害方式相互作用的情况下，该物质可以被掺入给予患者的药物组合物中。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒物学和生产测试要求的标准。
23.在本文提及“大约”某个值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方式。例如，提及“大约x”的描述包括对“x”的描述。
24.本发明药物组合物有多种合适的制剂。下面的制剂和方法仅仅是示例性的，并不是限制性的。
25.口服给药的制剂可由(a)液体溶液，例如有效量的溶解在稀释剂如水，盐水或橙汁中的活性成分，(b)胶囊，香囊或片剂，每个含有预定量的固体或颗粒形式的活性成分，(c)在适当液体中的悬浮液，和(d)适当的乳剂。片剂形式可包括乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学相容的赋形剂中的一种或多种。含片形式可包含香料中的活性成分，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄
蓍胶，以及在惰性基质中包含活性成分的锭剂，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶，乳剂，凝胶等，除了活性成分外，还包含本领域已知的赋形剂。
26.胃肠外给药的制剂包括水性和非水性，等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的含水和非水无菌悬浮液。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓿和小瓶中，并且可在使用前立即在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要加入无菌液体赋形剂，例如水，用于注射。可由前述类型的无菌粉末，颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
27.气雾剂包含本发明的药物组合物，所述药物组合物包括水性和非水性，等渗无菌溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，以及可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液，其单独或与其它合适的组分组合，可制成气雾剂制剂，通过吸入给药。这些气溶胶制剂可被置于加压的可接受的推进剂中，例如二氟甲烷、丙烷、氮气等。它们也可以配制成非压力制剂的药物，例如在喷雾器或雾化器中。
28.其它合适的制剂也是可能的，例如栓剂可以通过使用各种碱例如乳化碱或水溶性碱来制备。阴道给药的制剂可呈现为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂，除了活性成分外，还含有本领域已知的合适的载体。
29.3说明书附图
30.图1表示实施例5的肺癌模型下的肿瘤体积的变化(a)、肿瘤重量的变化(b)、肿瘤生长抑制(c)和体重(d)，其中**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001.
31.图2表示实施例6的脑胶质瘤模型下不同药物组的生存期。
4具体实施方式
32.以下实施例是对本发明的进一步说明，并非本发明范围的限制。下面参考实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
33.实施例1
34.样品制备工艺如下：
35.(1)称取处方量的β-榄香烯和大豆油，加入适量有机溶剂涡旋混匀，得到油相。
36.(2)取20％人血清白蛋白，加入适量超纯水稀释，得到适当浓度的人血清白蛋白水溶液作为水相。
37.(3)将油相缓慢逐滴加入至水相中，通过超声作用使油水两相均匀混合，形成初乳；将所得初乳通过高压均质机均质。
38.(4)均质后的乳液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，再通过微孔滤膜过滤除菌，即得β-榄香烯白蛋白纳米粒。
39.1.1有机溶剂种类的选择
40.按照样品制备工艺制备，其中β-榄香烯原料药0.25g，大豆油0.75g，有机溶剂2.5ml；20％人血清白蛋白溶液3.375ml，制备成3％的人血清白蛋白水溶液为水相，具体的测试结果见表1所示。
41.表1.有机溶剂的影响
[0042][0043]
1.2人血清白蛋白用量的选择
[0044]
按照样品制备工艺制备，其中β-榄香烯原料药0.25g，大豆油0.75g，有机溶剂(二氯甲烷与乙醇的混合溶液(7:3,v/v))2.5ml；考察了人血清白蛋白浓度分别为1％(相当于0.225g白蛋白)、2％(相当于0.45g白蛋白)、3％(相当于0.675g白蛋白)时对制剂的影响，结果如表2所示。
[0045]
表2白蛋白用量的影响
[0046][0047]
1.3大豆油用量的选择
[0048]
按照样品制备工艺制备，其中β-榄香烯原料药0.25g，有机溶剂(二氯甲烷与乙醇的混合溶液(7:3,v/v))2.5ml；20％人血清白蛋白溶液3.375ml，制备成3％的人血清白蛋白水溶液为水相，具体的测试结果见表3所示。
[0049]
表3.大豆油用量的影响
[0050][0051]
1.4均质压力的考察
[0052]
表4处方用量
[0053][0054]
表4的处方用量按照样品制备方法，其中步骤(3)中经探头超声形成初乳后，将所制备的初乳转移至高压均质机进行乳匀，300～400bar循环4～5次后，分别在500bar、
700bar、1000bar条件下继续循环10次，以考察均质压力对制剂的影响。结果如表5所示，纳米粒粒径随均质压力的增加而减小，当均质压力为1000bar时所制得纳米粒粒径最小且放置稳定。
[0055]
表5.均质压力的影响
[0056][0057]
1.5均质次数的考察
[0058]
表4的处方用量按照样品制备方法，其中步骤(3)中经探头超声形成初乳后，将所制备的初乳转移至高压均质机进行乳匀，300～400bar循环4～5次后，在压力为1000bar条件下分别循环5、10、15、20、25次，以考察均质次数对制剂的影响。结果如表6所示，当均质次数逐渐增加时，所制备的纳米粒粒径随着均质次数的增加而减小。
[0059]
表6.均质次数的影响
[0060][0061]
实施例2
[0062]
(1)称取β-榄香烯原料药0.25g和大豆油0.75g溶于2.5ml二氯甲烷/乙醇(7：3)混合溶剂中，涡旋混匀得到油相。
[0063]
(2)取20％人血清白蛋白溶液3.375ml加入适量超纯水稀释得到浓度为3％的人血清白蛋白水溶液即为水相。
[0064]
(3)将油相缓慢逐滴加入至水相中，在超声作用下使油水两相混合均匀形成初乳后，再通过高压均质机进行均质，300～400bar循环4～5次后加压至1000bar继续循环15次，均质完成后通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，过滤除菌，即得β-榄香烯白蛋白纳米粒溶液。
[0065]
实施例3
[0066]
3.1主要仪器
[0067]
cpa225d电子天平(德国sartorius公司)；
[0068]
scientz
‑ⅱ
d细胞粉碎仪(宁波scientz公司)；
[0069]
n-1300旋转蒸发仪(上海eyela公司)；
[0070]
zetasizer nano zs90激光粒度分析仪(malvern公司)；
[0071]
ah-nano高压均质机(ats公司)；
[0072]
uph-ii-10t优普超纯水仪(成都ulupure公司)；
[0073]
3k-15台式高速离心机(sigma)；
[0074]
ultimate 3000高效液相色谱仪(thermo fisher)；
[0075]
h-600透射电镜(hitachi公司)。
[0076]
3.2药品与试剂
[0077]
实施例2制备的样品(β-ele-an)；
[0078]
乙腈(色谱纯)；
[0079]
超纯水(自制)；
[0080]
3.3粒径分布与zeta电位
[0081]
取β-ele-an 0.1ml，加入超纯水稀释约40倍后，马尔文粒径仪测定粒径和电位，测得样品的平均粒径为84.9
±
4.0nm，pdi为0.18
±
0.02，zeta电位为-23.5
±
4.0mv。
[0082]
3.4储存稳定性考察
[0083]
取β-ele-an分别放置在4℃、25℃条件下，于第1、3、5、7天测定其粒径和pdi，以考察纳米粒在以上两种条件下的稳定性。结果显示：在4℃、25℃条件下放置7天没有发现明显聚集或沉淀，且测得粒径无明显增大或减小。
[0084]
实施例4
[0085]
4.1主要仪器
[0086]
ultimate 3000高效液相色谱仪(thermo fisher)；
[0087]
1101378091e冷冻干燥机(美国labconco)。
[0088]
4.2药品与试剂
[0089]
实施例2制备的样品(β-ele-an)；
[0090]
甘露醇、乳糖(天津市津东天正精细化学试剂厂)；
[0091]
葡萄糖、蔗糖(成都chron chemicals)；
[0092]
4.3冻干保护剂的筛选
[0093]
取新制备的β-ele-an分装于西林瓶中，每瓶2ml，取适量的甘露醇、乳糖、葡萄糖和蔗糖，分别加入纳米粒溶液中，震摇使其完全溶解，于-40℃预冻过夜后，再转移至冻干机中进行冷冻干燥。冷冻干燥程序见表7。冻干完成后，观察冻干样品外观色泽，各加入2ml超纯水复溶，观察其分散性，并测定粒径和pdi。结果如表8所示。
[0094]
表7.冻干程序
[0095][0096]
表8.冻干保护剂的影响
[0097][0098]
实施例5
[0099]
5.1主要仪器
[0100]
cpa225d电子天平(德国sartorius公司)；
[0101]
zh-蓝星脑立体定位仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)。
[0102]
5.2主要药品与试剂
[0103]
β-ele-an(自制)；
[0104]
市售β-榄香烯注射液(石药集团远大制药有限公司)(β-ele-inj)；
[0105]
注射用生理盐水(四川科伦药业股份有限公司)；
[0106]
dmem不完全培养基(美国hyclone公司)；
[0107]
胎牛血清(gibco，美国)；
[0108]
胰蛋白酶(solarbio，中国)等。
[0109]
5.3实验中使用的细胞株
[0110]
健康雄性c57bl/6小鼠，体重20-22g；健康雄性昆明小鼠，体重20-22g；均购于成都达硕生物科技有限公司。标准饲料喂养，温度为25
±
2℃，湿度为50
±
10％，自由饮水进食。
[0111]
脑胶质瘤细胞株c6和lewis肺癌细胞株均购自上海细胞生物所。
[0112]
5.4 c57bl/6小鼠lewis肺癌小鼠模型的建立
[0113]
建立动物模型所需的lewis肺癌细胞进行细胞培养，具体条件如下：当细胞生长至90％左右，弃去培养基，加入pbs缓冲液，洗涤细胞一次，弃去pbs溶液后再加入2ml胰蛋白酶消化液，轻微摇晃使细胞表面完全被消化液浸湿，然后将培养皿在培养箱中放置2min后弃去消化液，加入2ml完全培养基使细胞终止消化。用移液枪轻轻吹打使细胞分散成单细胞悬液，将得到的细胞悬液按1:3的比例分皿传代，待细胞再次生长至90％，重复以上操作。
[0114]
实验当日，取生长状态良好的llc细胞，弃去培养基，加入pbs缓冲液洗涤细胞一次，向皿内加入2ml胰蛋白酶溶液，在细胞培养箱中消化细胞2min后弃去胰酶，再加入2ml完全培养基停止消化，用移液枪反复吹打皿底部使贴壁细胞成为单细胞悬液，收集细胞悬液后2000rpm离心3min，吸弃上层液体并加入pbs缓冲液重悬细胞沉淀，将细胞浓度调整为1
×
106个/100μl。取6～8周龄的雄性c57bl/6小鼠，将小鼠右侧腹部毛发剔除，用酒精棉花擦拭剔除毛发区域进行消毒后，用1ml注射器皮下接种100μl事先调整至适合浓度的llc细胞悬液，过程中尽可能避免llc细胞悬液渗漏。当观察到接种部位有小的肿瘤突起，说明建模成功。
[0115]
5.5给药方法
[0116]
在接种llc细胞的第12天，将建模成功的小鼠随机分成3组，每组6只，分别在第12、14、16、18天尾静脉注射生理盐水、β-ele-inj和β-ele-an，给药剂量为60mg/kg。每隔一天测定一次肿瘤的长、短径，同时记录小鼠体重，根据公式计算肿瘤的大小：tumorvolume(mm3)＝1/2
×
width2×
length。接种后第24天处死全部小鼠，取出肿瘤组织，洗净后吸干水分并拍照称重，按照公式计算抑瘤率：tir％＝(w
control
–wtreated
)/w
control
×
100％。然后将肿瘤组浸入4％多聚甲醛溶液中固定，过夜后更换为新鲜固定液保存48h，用于切片。
[0117]
5.6肿瘤体积的考察
[0118]
图1为各组小鼠肿瘤大小及体重变化。肿瘤体积大小结果为：生理盐水组》β-ele-inj组》β-ele-an组。在第24天，当给药剂量为60mg/kg时，观察到生理盐水组的肿瘤体积平均值达到了1135.99mm3，市售注射液组肿瘤体积为452.83mm3，而β-ele-an组的平均肿瘤体积为198.05mm3。与生理盐水组相比，β-ele-an组与β-ele-inj组均有显著的肿瘤生长抑制作用。并且在同等给药剂量下，β-ele-an组的平均肿瘤体积小于市售注射液组的平均肿瘤体积，后者是前者的2.29倍，两者具有显著性差异。在第24天剖取肿瘤组织后拍照，如图1所示，生理组的平均瘤重为0.8776g，β-ele-an组的平均瘤重为0.2063g，肿瘤抑制率达到了76％；而β-ele-inj组平均瘤重为0.4698g，明显大于β-ele-an组.
[0119]
实施例6
[0120]
6.1荷c6胶质瘤小鼠模型的建立
[0121]
本试验使用c6细胞建立脑胶质瘤模型，细胞培养方式如下：当细胞生长至90％左右，弃去培养基，加入pbs缓冲液，洗涤细胞一次，弃去pbs溶液后再加入2ml胰蛋白酶消化液，轻微摇晃使细胞表面完全被消化液浸湿，然后将培养皿在培养箱中放置2min后弃去消化液，加入2ml完全培养基使细胞终止消化。用移液枪轻轻吹打使细胞分散成单细胞悬液，将得到的细胞悬液按1:3的比例分皿传代，待细胞再次生长至90％，重复以上操作。
[0122]
试验当日，取生长状态良好的c6细胞，弃去培养基，加入pbs缓冲液洗涤细胞一次，向皿内加入2ml胰酶，在37℃孵箱中消化细胞1min后弃去胰酶，再加入2ml完全培养基停止消化，用移液枪反复吹打皿底部使贴壁细胞成为单细胞悬液，收集细胞悬液后2000rpm离心3min，吸弃上层液体并加入pbs缓冲液重悬细胞沉淀，将细胞浓度调整为1
×
106个/5μl。
[0123]
取健康雄性昆明小鼠，腹腔注射适量4％水合氯醛将小鼠麻醉后剔除头顶毛发，用酒精棉花涂抹消毒，用已消毒的眼科剪沿头部矢状中线剪开一小口，用沾有10％双氧水的棉签快速擦拭去除组织膜分离出颅骨，再用沾有pbs缓冲液的棉签擦去残余双氧水溶液。将小鼠头部固定于脑立体定位仪上，定位距离前囟点右1.8mm，后0.6mm，在定位处，用2ml的注
射器针头钻一个小孔，注意钻入深度不得过深以免出血。用微量进样针吸取c6细胞5μl，垂直小孔注射，进针4mm后退针1mm，缓慢注射细胞悬液至脑内，进样针在孔内停留5min后取出，以防止细胞液渗出。最后用带针手术线将伤口缝合，并用蘸有双抗的棉签涂抹伤口表面，防止感染。
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6.2给药方案
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荷c6胶质瘤昆明小鼠模型建立后8天，将小鼠随机均分为3组，每组10只，建模成功后的第8、10、12、14天分别静脉注射生理盐水、β-ele-inj和β-ele-an，其中β-ele的剂量为40mg/kg。及时记录动物死亡只数与天数，利用graphpad软件计算各组荷瘤小鼠的存活率，中位生存期等数据，并绘制生存曲线图。
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6.3生存期考察
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原位c6胶质瘤无法记录肿瘤体积变化与瘤重大小，使用生存期考察试验来验证β-ele-an的抗胶质瘤动物体内药效试验。生存期考查结果如图2所示，实验结果表明给予β-ele-an的荷c6胶质瘤小鼠，表现出更长的生存期。生理组小鼠的中位生存期为15天，β-ele-inj组小鼠的中位生存期为25天，β-ele-an组小鼠的中位生存期为42天。60天后，生理组小鼠全部死亡，β-ele-inj组30％小鼠存活，β-ele-an组仍有50％小鼠存活。实验结果表明β-ele-an可以有效地延长荷c6胶质瘤小鼠的生存期。