从二代测序数据挖掘植物ITSs序列并用于鉴别品种家系

本发明涉及一种使用二代测序数据挖掘itss序列并用于分析鉴别品种家系的方法。
背景技术：
：食用玫瑰属于蔷薇科蔷薇属(rosal.)植物，是一类以鲜花入食的蔷薇属植物的统称。在我国主要以新鲜或者干燥花瓣用于食品加工，以作为色素、香味、维生素等的来源。在国内主要产品形式有干燥玫瑰花蕾、玫瑰酱、玫瑰糖、玫瑰酒、玫瑰饼、玫瑰露等。国家食品安全标准与监测评估司发布的《关于批准dha藻油、棉籽低聚糖等7种物品为新资源食品及其他相关规定的公告(2010年第3号)》，文件明确玫瑰花(‘重瓣红玫瑰’rosarugosa‘plena’)作为普通食品生产经营。然而这一规定仅明确了‘重瓣红玫瑰’一个品种的食用合法性。根据文献调查和实地调查，国内各地引种栽培的油用玫瑰品种开拓应用范围到食用领域，这些品种包含国际精油用‘大马士革’、山东平阴玫瑰研究所培育的‘紫枝玫瑰’和‘丰花玫瑰’、甘肃的‘苦水玫瑰’等。到底哪些是符合国家新食品资源标准的品种，可以被合法的用于食品加工，而其他种类的食用是否存在一定的风险，都是亟待解决的问题。在植物学种的概念上，根据植物志记载，我国野生的玫瑰为蔷薇科蔷薇属的一个物种(rosarugosathunb.)。‘重瓣红玫瑰’被认为是野生玫瑰的重瓣栽培品种。然而这一关系并没有遗传方面的证据。蔷薇属栽培品种由于杂交频繁，形态相似度高，传统基于形态学进行品种区分难度较大。国内目前主要使用的食用玫瑰品种有约20种，然而这些被用作食用玫瑰的品种缺乏背景资料记载，不同栽培区相互引种，且常出现同物异名的现象，对食用玫瑰品种的选择、新品种培育及整个食用玫瑰产业的健康发展极为不利。而近些年来，被称为玫瑰的品种越来越多，这些被称为玫瑰的品种与野生种玫瑰以及‘重瓣红玫瑰’的关系尚不清楚。理清玫瑰的家系对于玫瑰品种的选择利用、新品种培育以及玫瑰市场的健康发展至关重要。国内对于玫瑰品种的区分和鉴别做了一些尝试，然而并没有提供一个清晰的玫瑰家系，不同玫瑰的来源和遗传背景仍然不清楚，市场上玫瑰品种依旧很混乱。以往发表的区分物种或者品种的方法，基于限制性片段多态性或者扩增片段多态性的实验重复性差，且获取的关系往往不够直接；基于少量叶绿体片段的，信息量太少，鉴别能力有限，且只能提供母系遗传的信息；基于少量单拷贝核基因片段的，由于多数单拷贝核基因在物种内的变异度较大，需要较多的居群采样，才能代表一个物种，且单拷贝核基因在基因组内的只有一个拷贝，引物设计和扩增难度较大，失败率高。核糖体基因在植物单个细胞内的拷贝数很多，成百上千。核糖体基因(rdna)转录间隔区(internaltranscribedspacers，its)序列在植物种属关系研究中得到广泛的使用，然而一般认为its序列在个体内会经历同质性进化，从而实现个体内不同拷贝的its序列保持高度一致，因此its的应用一般停留在野生植物属下种间的关系研究上。对于植物内its序列多样性及其应用的报道较少见。一些研究蔷薇属栽培品种起源的研究，尝试了its序列的适用性，然而克隆测序实验繁琐且价格昂贵，而由于采用传统通过pcr测序获取its序列的方法不能得到同一个体内的不同单倍型，未能得到理想的效果。以往利用叶绿体基因组单个基因片段或者数个基因联合片段作为种间关系研究的尝试也只能得到较低的分辨率，并且由于母系遗传，叶绿体基因或叶绿体基因组对于同一母本种下的品种没有区分能力。技术实现要素：本发明开发了一种通过二代测序数据准确组装个体内its不同单倍型的方法，通过一次浅层的二代测序，同时获取代表母系信息的叶绿体基因组和代表双亲信息的高拷贝的核糖体基因转录间隔区its序列，通过序列比对和系统发育关系分析，能够直观的判断食用玫瑰品种的双亲来源及食用玫瑰品种之间的遗传关系，不仅能够准确快速鉴定品种及家系，还能为待测品种的育种途径和可能的改良方向提供重要的指导信息。本发明的目的通过以下技术方案予以实现：第一方面，本发明提供一种使用二代测序数据组装植物样本itss序列的方法，所述方法包含以下步骤：1)制备待测样本总dna的二代测序文库；2)将所述二代测序文库进行测序，得到测序数据；3)将所述测序数据分别进行its1、its2序列拼接和注释，所述its1、its2序列拼接和注释可包括：以任一近缘类群品种的核糖体dna为rdna参考序列，将所述测序数据回贴(map)到所述rdna参考序列上富集its1和its2区的读序(reads)，标记每一个多样性位点的覆盖度和碱基组成；利用富集到的reads进行从头组装，选择保留变异信息，得到重叠群(contigs)，然后将得到的contigs重新回贴到rdna参考序列，查找its1和its2区的重叠群，依据读序回贴标记的所述多样性位点的信息提取出重叠群(覆盖度可≥5％)，作为可靠的its1和its2序列组成本发明的itss。任选地，步骤2)所述测序的单条读序的读长≥100碱基(bp)，如为≥150bp。任选地，步骤2)所述测序为双端测序。任选地，步骤2)所得测序数据为浅层测序数据，其数据量可≥1gb，如≥2gb。任选地，待测样本来自蔷薇科，优选为蔷薇属。更具体的，其中：步骤1)所述待鉴别样本总dna的提取方法为：改良的ctab法，优选试剂公司生产的植物总dna提取试剂盒提取；其中，步骤1)所述二代测序文库的制备：参照illumina文库构建流程，将所述总dna构建为片段大小为400-600bp的双末端高通量测序文库；第二方面，本发明对应提供了种系鉴别用itss序列，各品种itss序列如下表所示：表1学名中文名its1各单倍型序列号its2各单倍型序列号rosarugosa'plena'‘重瓣红玫瑰’seqidno.1-2seqidno.3-4rosa×centifolial.‘千叶玫瑰’seqidno.5-7seqidno.8-11rosa×damascenaherrm.‘大马士革’seqidno.12-14seqidno.15-18rosa'bajiemeigui'‘八街玫瑰’seqidno.19-21seqidno.22-24rosa'dianhong'‘滇红玫瑰’seqidno.25-27seqidno.28-30rosa'dingtaomeigui'‘定陶玫瑰’seqidno.31-33seqidno.34-36rosa'jinbian'‘金边玫瑰’seqidno.37-40seqidno.41-43rosa'kushui'‘苦水玫瑰’seqidno.44-45seqidno.46-47rosa'ruoshuiming'‘若水茗’seqidno.48-50seqidno.51-54rosa'shangshuimeigui'‘商水玫瑰’seqidno.55-57seqidno.58-60rosa'tuwei'‘荼薇花’seqidno.61-63seqidno.64-68rosa'crimsonglory'‘墨红玫瑰’seqidno.69-70seqidno.71-72rosa'fenghua'‘丰花玫瑰’seqidno.73-74seqidno.75-76rosa'guomeigui'‘果玫瑰’seqidno.77-78seqidno.79-80rosa'miaofengshan'‘妙峰山玫瑰’seqidno.81-82seqidno.83-84rosa'zizhi'‘紫枝玫瑰’seqidno.85seqidno.86-89比如，‘重瓣红玫瑰’its1包括seqidno.1-2所示序列，its2包括seqidno.3-4所示序列。第三方面，本发明对应提供了植物种系鉴别用指纹库，该指纹库含有至少一种品种的上述itss序列及该品种的叶绿体基因组序列。基于上述方面，本发明进而提供了其于种系、家系鉴别的应用，以蔷薇为例，该应用包括：0)根据在先权利要求所述方法组装出至少一种蔷薇属植物的itss序列，汇总该itss序列信息及所属物种的叶绿体基因组序列，得到蔷薇属样本指纹库；1)根据在先权利要求所述方法组装出待鉴别样本x的its1s、its2s序列，并获得该样本x的叶绿体基因组序列；2)进行样本x与所述指纹库物种的叶绿体基因组、its1、its2序列比对，以鉴别样本x与该指纹库中物种的家系关系。本专利家系泛指起源、亲缘关系，所述序列比对结果为序列(指叶绿体基因组、its1s、its2s3组序列)一致时，则可以判断该待测样品与该已知玫瑰品种同属于一个家系，遗传关系密切；如不一致，为获悉更精确的家系关系，可与指纹库中另1蔷薇属植物进行比对(第2比对)，如第2比对的结果仍为不一致，为获悉更精确的家系关系，可进一步分析，比如进化树构建及相关分析，可包括：a)基于叶绿体基因组构建的进化树上，与样本x聚在一枝且分支枝长接近甚至为0的野生种被认定为该样本的母系祖先，与样本x聚在一枝且分支枝长接近甚至为0的蔷薇品种被认定为与该样本x来自于共同的母系祖先；b)基于its1和its2构建的进化树上，与样本x聚在一枝且分支枝长接近甚至为0的野生种被认定为该样本x的母系和/或父系祖先，与样本x聚在一枝且分支枝长接近甚至为0的蔷薇品种被认定为与该样本x来自共同的母系或父系祖先；c)基于its1和its2构建的进化树认定的祖先，同时也是基于叶绿体基因组构建的进化树认定的母系祖先时，确定该祖先为母系祖先，而基于its1和its2构建的进化树认定的其余的祖先被认定为父系祖先。任选地，所述指纹库还使用分类学上蔷薇族其他属的种作为外类群，所述外类群含有的物种的种类可≥2，如为2-5种。任选地，所述蔷薇属植物包括但不限于以下品种：‘滇红玫瑰’(rosa'dianhong')、‘金边玫瑰’(rosa'jinbian')、‘八街玫瑰’(rosa'bajiemeigui')、‘墨红玫瑰’(rosa'crimsonglory')、‘大马士革’(rosa×damascena)、‘千叶玫瑰’(rosa×centifolia)、‘若水茗’(rosa'ruoshuiming')、‘商水玫瑰’(rosa'shangshuimeigui')、‘定陶玫瑰’(rosa'dingtaomeigui')、‘紫枝玫瑰’(rosa'zizhi')、‘重瓣红玫瑰’(rosarugosa'plena')、‘丰花玫瑰’(rosa'fenghua')、‘妙峰山玫瑰’(rosa'miaofengshan')、‘果玫瑰’(rosa'guomeigui')、‘苦水玫瑰’(rosa'kushui')、‘荼薇花’(rosa'tuwei')、rosabanksiaerosabr.，rosabrunoniilindl.，rosacaninal.，rosachinensisf.mutabilis(correvon)rehder，rosachinensis'oldblush'，rosachinensisvar.spontanea(rehder&e.h.wilson)t.t.yu&t.c.ku，rosadavuricapall.，rosafedtschenkoanaregel，rosagallical.，rosahelenaerehder&e.h.wilson，rosakweichownensisvar.sterilis，rosalaevigatamichx.，rosalichiangensist.t.yu&t.c.ku，rosalongicuspisbertol.，rosamajalisherrm.，rosamoschataherrm.，rosamultiflorainermis(hisauti)sugim.，rosamultiflorathunb.，rosaodorata'glandularsepal'，rosaodorata'pinkblush'，rosaodoratavar.erubescens(focke)t.t.yu&t.c.ku，rosaodoratavar.gigantea(collettexcr，p.)rehder&e.h.wilson，rosaodoratavar.pseudindica(lindl.)rehder，rosaroxburghiif.normalisrehder&e.h.wilson，rosaroxburghiitratt.，rosarugosathunb.，rosataiwanensisnakai，rosawichuraiana'basye'sthornless'，rosawichuraianacrép，rosaxanthinalindl.任选地，所述序列比对方法包括：优选geneious软件中的mafft插件进行序列比对，比对好的序列去除两端的不平序列，将比对好的矩阵输出为fasta文件。任选地，以最大似然法构建进化树，方法可包括：将所述矩阵文件导入软件1计算最佳碱基替代模型，所述矩阵文件导入软件2构建进化树，设置最佳碱基替代模型，进化树迭代次数(bootstrap)设为1000次。优选地，所述软件1为jmodeltest。优选地，所述最佳碱基替代模型为gtrgammai。优选地，所述软件2为raxml8.2.11。附图说明图1为‘大马士革’(rosa×damascenal1)its1单倍型序列组装模型图。a：为测序原始数据回帖到its1区域后，每个可能的多样性位点的不同碱基及其组成比例，每个位点的总覆盖度记录在位点下面的括号内。该数据可以通过geneious软件逐位点查看并人工记录，用于验证图中c所识别组装的its1单倍型在该区域测序数据中的比例。b：为测序原始数据回帖到its1区域时，支持不同类型its单倍型的reads的分布及其可能的规律。每条灰线代表一条read，灰线上的碱基代表该位点相对参考序列和其他reads的差异碱基。c:依照b识别的不同类型的reads按照无错配连接得到的不同its1单倍型。每条单倍型序列上的碱基所在位点与b中reads及参考序列的位点一一对应，黑色箭头所指的碱基为对应单倍型序列的特异碱基，每条单倍型序列的比例为该单倍型各特异碱基的比例的平均值。图2.rosa×damascenal1its克隆测序得到的4条序列对比，图中显示每种序列类型在多样性位点对应的碱基类型，序列的相同部分未展示。图3.rosa×damascenal1its克隆测序结果与基于二代测序数据组装itss序列的对应关系，克隆测序的序列类型后面括号内为得到的同一类型序列的单克隆数目。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂为常规市购或商业途径获得的生化试剂，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。实施例1从8个主要食用玫瑰产区搜集16个食用玫瑰品种共23个材料，另外采集了蔷薇属野生种或品种26种(均见表2)。采集不同来源各个品种和种的健康幼叶，标记好，由测序公司完成总dna提取、二代测序文库构建、上机测序和质控。dna提取采用改良的ctab法(doyle和doyle1987)。dna建库和测序实验流程按照illumina公司提供的标准protocol执行，包括样品质量检测、文库构建、文库质量检测和文库测序等流程，测序平台为illuminaxten，采取双端测序技术，测序读长为双末端150bp。最终得到双端cleanreads各700,000-1,000,000条，每样品的总数据量2-3gb。叶绿体基因组组装：将上述双端cleanreads依照getorganelle组装流程，采用spades3.12.0进行叶绿体组装，然后用bandage0.8.1检查组装结果，选择组装出来的叶绿体contigs导出到geneious9.1.4软件中，参考已发表的无刺光叶蔷薇(rosawichuraiana'basye'sthornless')的叶绿体基因组(genbankaccessionnumber:mn689790)进行叶绿体基因组注释。its1、its2序列组装：在geneious9.1.4软件中，以‘大马士革’的rdna为参考，将上述步骤所得测序数据map到rdna上富集its1和its2区的reads(readsmapping)，同时查看its区不同reads组分，记录单个多样性位点的碱基组成和覆盖度。利用富集到的reads进行从头组装，选择保留contigs的变异信息。然后再将得到的contigs重新map到rdna参考序列，查找its1和its2区的contigs，依据readsmapping结果提取覆盖度大于5％的contigs，作为可靠的its1和its2序列，并依据获得的its1和its2序列单倍型数目，将its1、its2单倍型按覆盖度从多到少依次标记为a、b、c、d、e等。its1和its2组装示例见图1。组装出的各食用玫瑰的itss序列列在序列表，‘重瓣红玫瑰’的its1a为seqidno.1，其its1b如seqidno.2所示序列，its2a、its2b亦依次如seqidno.3、seqidno.4所示。为了确保its1和its2序列组装结果的准确性和个体内所有its单倍型的全覆盖，依照传统的its序列pcr扩增测序方法，随机对10个品种的its序列进行了扩增和sanger测序，通过对测序结果仔细观察并与组装的its1s和its2s序列比对矩阵进行对比，发现pcr扩增产物为杂合序列，而直接测序的杂合位点完全与通过二代测序组装得到的单个样本内的its序列之间的变异位点重合，且杂合位点的碱基组成与变异位点的碱基组成一致。证明了通过二代测序组装its序列的方法准确可靠。为了进一步证明二代测序组装的每个its单倍型序列的真实性，选取一个its成分复杂的样本‘大马士革’，对其pcr扩增产物进行克隆测序，挑取了16个单克隆进行sanger测序，每个单克隆测序的结果均没有发现杂合位点，表明单克隆实验成功，而测序得到的16条序列经比对，共发现4种序列，代表3种its1单倍型和4种its2单倍型(图2)，且完全与通过二代测序组装的its1和its2单倍型序列一致。测序的its序列与组装的its1和its2单倍型序列的对应关系见图3。表明根据二代测序数据组装的its序列真实可靠。为了充分获知所采集的食用玫瑰品种的家系，从genbank下载蔷薇属更多物种的叶绿体基因组和原始二代测序序列用于组装its1、its2序列，并用于序列比对和进化树构建。本案例共得到了88个蔷薇属材料的叶绿体基因组和60个样本的its1、its2序列。为了使进化树体现的进化关系更可靠，在genbank下载与蔷薇属同科同族(蔷薇族)的其他属物种5个作为外类群。具体样本情况见表2。将上述食用玫瑰材料和其他所有材料的叶绿体基因组、its1、its2序列载入geneious9.1.4软件中，分别对叶绿体基因组、its1、its2序列用mafft插件进行序列比对，比对好的序列去除两端的不平序列，将比对好的矩阵输出为fasta文件。将上述fasta文件分别作为输入文件，使用raxml8.2.11构建最大似然进化树，以gtrgammai为模型，bootstrap设为1000次。分别得到三个矩阵的树文件。使用figtree软件查看并编辑树文件，输出pdf文件，再用illustrator软件编辑为易识别的图片。根据得到的基于叶绿体基因组、its1、its2序列的三棵进化树，判断食用玫瑰品种的家系。依据基于叶绿体基因组的进化树判断，从母系来源上：‘千叶玫瑰’(rosa×centifolia)、‘大马士革’(rosa×damascena)、‘若水茗’(rosa'ruoshuiming')和‘金边玫瑰’(rosa'jinbian')具有共同的母本祖先：麝香蔷薇(rosamoschataherrm.)。‘商水玫瑰’、‘滇红玫瑰’、‘八街玫瑰’、‘定陶玫瑰’四个食用玫瑰品种与‘月月粉’拥有共同的母本野生祖先：单瓣月季花(rosachinensisvar.spontanea(rehder&e.h.wilson)t.t.yu&t.c.ku)。‘墨红玫瑰’的母本野生祖先：可能是具有相同叶绿体基因组序列的花蝴蝶(rosachinensisf.mutabilis(correvon)rehder)或者‘腺萼香水月季’(rosaodorata'glandularsepal')。‘荼薇花’的母本野生祖先为法国蔷薇(rosagallical.)。‘重瓣红玫瑰’、‘紫枝玫瑰’、‘丰花玫瑰’、‘妙峰山玫瑰’、‘果玫瑰’的共同母本野生祖先为中国原产的野生玫瑰(rosarugosathunb.)。‘苦水玫瑰’的野生母本祖先与其他食用玫瑰均不同，自成一系。结合基于its1、its2序列的进化树，可以推测出多数食用玫瑰品种为杂交品种，具有复杂的亲本来源。母本祖先均为麝香蔷薇的四个品种中，‘金边玫瑰’具有独特的父本-‘杏花春雨’和父本祖先光叶蔷薇(rosawichuraianacrép)，而其他三个品种的父母本来源相同，都属于大马士革系。母本祖先均为单瓣月季花的四个品种均表现出与‘月月粉’的关系密切，父本方面除‘商水玫瑰’有麝香蔷薇成分外，其他三个品种的父本均有法国蔷薇成分。而其中的麝香蔷薇成分和法国蔷薇成分均在大马士革中有包含。因此这几个食用玫瑰品种同属于单瓣月季花家系，且可能来自相同的杂交组合：‘月月粉’ב大马士革’。‘墨红玫瑰’自成一系，母本祖先为花蝴蝶(rosachinensisf.mutabilis(correvon)rehder)或者‘腺萼香水月季’(rosaodorata'glandularsepal')，父本祖先为法国蔷薇。‘荼薇花’自成一系：母本为法国蔷薇，父本为中国野生玫瑰(rosarugosathunb.)。以野生玫瑰为母本的五个食用玫瑰同为玫瑰系，但依据父本的差别，‘紫枝玫瑰’为驯化自野生玫瑰的品种，而其他包括‘重瓣红玫瑰’在内的四个品种均为玫瑰与山刺玫(rosadavuricapall.)的杂交后代。‘苦水玫瑰’自成一系，其母本与所有其他食用玫瑰品种均不同，而父本为中国野生玫瑰。表2材料表*表示序列从genbank下载。-表示信息缺乏。序列表<110>中国科学院昆明植物研究所<120>从二代测序数据挖掘植物itss序列并用于鉴别品种家系<160>89<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>259<212>dna<213>rosarugosa'plena'<400>1tcgaaacctgcctagcagaacgacccgagaacatgtttcaacgcttgggggcggagggtc60ttgcggctctgcgcccccttatcctaggaggcaagtgtcttgcgcgttgcatttcggtgc120ttgcgcttgaccgaccctcccgggcgtactgaacaccggcgtgaattgcgccaaggaact180tgaatgaaagagcgtttcccccgccgtcccggagacggtgctcgtgcgggtggtttcgtc240gtcttcaatatgtctaaac259<210>2<211>259<212>dna<213>rosarugosa'plena'<400>2tcgaaacctgcctagcagaacgacccgagaacatgtttcaacgcttgggggcggagggtc60ttgcggctctgcgccccctcatcctaggaggcaagtgtcttgcgcgttgcatttcggtgc120ttgcgcttgaccgaccctcccgggcgtactgaacaccggcgtgaattgcgccaaggaact180tgaatgaaagagcgtttcccccgccgtcccggagacggtgctcgtgcgggtggtttcgtc240gtcttcaatatgtctaaac259<210>3<211>232<212>dna<213>rosarugosa'plena'<400>3gtcgttgccccccccaaccccctcgggagttggatgggacggatgatggcctccc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