丙磺舒在早产儿视网膜病变ROP疾病防治中的应用的制作方法

本发明涉及一种丙磺舒在早产儿视网膜病变rop疾病防治中的应用。

背景技术：

尽管医疗技术水平不断提高，但早产儿视网膜病变(retinopathyofprematurity，rop)仍然是全球儿童致盲和视力障碍的主要原因，常见在出生体重小于1250g的婴儿中。在多个中心具有代表性的大型队列中，在所有接受rop筛查检查的早产儿中，43.1％发生rop，约12.5％发生严重rop。rop也是儿童和青少年后期神经发育损伤的一个强有力的独立预测因子。rop的治疗正在从机械疗法(激光或冷冻疗法)向生物制剂方面发展。目前，周围视网膜的激光光凝或冷冻治疗仍然是标准的治疗方法，但这些干预措施破坏了无血管视网膜，并且对于i区rop(i区rop需要具体说明)往往效率低下。因此，需要有针对性的治疗，以减少异常血管增生，促进生理性视网膜血管发育和神经血管相互作用，而不损害发育中的婴儿。cmap(connectivitymap)是利用小分子药物处理人类细胞后的基因表达差异，建立的一个小分子药物、基因表现与疾病相互关连的生物应用数据库，其是近年来开发的一种新的药物筛选数据库，具体原理可参考文献briefingsinbioinformatics,2017,1–18，其可用于协助研究者在药物开发领域上，快速利用基因表达谱数据比对出疾病高关联性的药物，推论大部分药物分子的主要化学结构，并能归纳出药物分子可能作用的机制方向。

高氧暴露引起的初始血管闭塞和缺氧介导的新生血管形成是rop的两个不同的病理生理阶段。缺氧引起的内皮细胞活化在血管生成中起重要作用。基于cocl2诱导低氧环境下鉴定的视网膜血管内皮细胞差异表达基因。我们通过微阵列显著分析软件筛选实验组和对照组的表达差异基因，结果发现326个基因表达存在差异，其中198个基因表达上调，128个基因表达下调，上调基因表达约为下调基因的1.5倍。差异表达的主要基因及其功能分类见表1。

表1部分差异表达基因及功能分类

将上表的差异表达基因输入cmap数据库，筛选出了rop负相关的小分子化合物和药物见表2。

技术实现要素：

基于现有技术存在的上述缺陷，本发明要解决的技术问题是提供一种丙磺舒在rop疾病治疗中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提出了一种丙磺舒在早产儿视网膜病变rop疾病治疗中的应用，在早产儿视网膜病变rop疾病预防或治疗药物中包含丙磺舒。

作为本发明进一步的改进，所述丙磺舒先通过cmap数据库筛选，再通过实验验证。

作为本发明进一步的改进，所述丙磺舒的使用剂量为1mg/kg.d。

作为本发明进一步的改进，所述丙磺舒的给药途径采用注射的方式。

作为本发明进一步的改进，所述注射为腹腔注射。

目前尚无有效预防早产儿视网膜病变rop的药物，丙磺舒作为一种老药，能应用于早产儿视网膜病变rop的防治，减少rop激光或者注药治疗带来的局部或者全身并发症。其防治早产儿视网膜病变rop的机理是通过减少高氧刺激血管内皮生长因子的表达，从而减少视网膜新生血管而实现的，属于开拓性的发现。

附图说明

图1是：实验部分的丙磺舒抑制氯化钴介导的视网膜内皮细胞增殖。

图2是：实验部分的丙磺舒预处理可防ii期早产儿视网膜病变rop中vegf和hif-1α的过度产生。

图3是：实验部分的丙磺舒治疗减少视网膜新生血管。

图4是：实验部分的丙磺舒减少oir中央血管闭塞面积。

图1:cellviability：细胞活力；normoxia:常氧组；cocl2:氯化钴组；probenecid+cocl2:丙磺舒+氯化钴组；

图2:vegfprotein:表皮生长因子；normoxia:常氧组；oir：高氧诱导视网膜病变组；probenecidpre-treatment:丙磺舒预处理组；probenecidafter-treatment:丙磺舒后处理组；

图3:numberofnewvessles:新生血管数目；normoxia:常氧组；oir：高氧诱导视网膜病变组；probenecid:丙磺舒组。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明提供的一种丙磺舒在早产儿视网膜病变rop疾病防治中的应用做进一步更详细的说明：

本发明使用cmap数据库，该数据库为一种识别已建立药物的新应用的生物信息学工具，用来搜索和筛选干扰低氧诱导的血管内皮细胞的分子化合物，尝试探索一种可以抑制视网膜血管增殖，有望治疗rop的药物。结果表明，丙磺舒与视网膜内皮细胞的病理性血管生成呈负相关，见表2。本发明主要试图评估丙磺舒对视网膜内皮细胞增殖和血管生成的影响。为了验证这一假设，利用培养的视网膜内皮细胞和新生高氧诱导视网膜血管增殖的小鼠被用来制作rop病理模型，并验证丙磺舒是否可以抑制视网膜促血管生成因子水平，视网膜血管化，以及中央血管闭塞，从而有望治疗早产儿视网膜病变rop。

下表2为cmap筛选出与早产儿视网膜病变rop负相关的小分子化合物和药物，下列药物有望能用于rop疾病的治疗，cmap数据库属于公知技术，前面有参考文献，本研究是用来验证下表中的第16种，丙磺舒对早产儿视网膜病变rop的治疗作用。

表2cmap筛选出与早产儿视网膜病变rop负相关的小分子化合物和药物

一、实验部分

丙磺舒用于早产儿视网膜病变rop的治疗尚未有报道，本研究是基于cmap筛选的结果，利用以下已公知的实验方法是利用验证丙磺舒对早产儿视网膜病变rop的治疗作用。

本发明旨在验证丙磺舒对早产儿视网膜病变rop的治疗作用，从而为早产儿视网膜病变rop的防治提供新的化合物。

1、细胞培养和处理

将获得的人视网膜内皮细胞(源自中山大学)细胞保存在纤维连接蛋白包被的培养皿中，在37℃下，在每隔一天更换一次培养基的湿化培养箱中，用10％胎牛血清((hyclonelogan,ut,usa)、1％胰岛素转移硒(its,gibco)、25纳克/毫升β-内皮细胞生长因子(r&d,minn.,usa)、100μg/ml链霉素和100u/ml青霉素的pti-memi血清培养基(gibco)培养。在丙磺舒150ug/ml(syncoltd,hongkong)处理前，细胞血清饥饿4h，并使用150μmol/l氯化钴(sigma)模拟缺氧诱导细胞增生条件，对细胞生存力进行测试，测试的目的在于仿照早产儿视网膜病变rop的体外细胞模型，用丙磺舒进行干预，观察其对早产儿视网膜病变rop视网膜内皮细胞增殖的抑制作用，实验结果见图1。

2、动物

体内实验在野生型雄性和雌性sd小鼠幼体上进行。小鼠在无病原体的设施中饲养，光照/黑暗周期为12小时，可随意获取食物和水。对于丙磺舒治疗，每窝一半的幼崽每天从p1到p7接受一次丙磺舒腹腔注射(1毫克/千克体重，溶于蒸馏的h2o水)。对照组用蒸馏水进行假注射。在p21，通过腹膜内注射0.35ml阿佛丁(2.5％tribromoethanol,sigma-aldrich)对小鼠进行深度麻醉。研究目的在于利用丙磺舒事先干预小鼠，为后面的oir模型提供丙磺舒处理后的动物来源。

3、诱导视网膜病(oir)模型制作

幼仔用氧气或者室内空气饲养。对于oir模型，在出生后第一天p1和p14之间，将带有哺乳母亲的sd小鼠暴露于75％的氧气中，以诱导视网膜血管增殖损伤，并在p15和p21之间返回室内空气。氧气浓度每天用氧气分析仪检查两次，该研究目的主要在于制作rop的动物模型，仿照rop的发病条件，从而观察对照组和丙磺舒干预组对rop动物眼底视网膜血管增殖和渗出的作用。实验结果见图4。

4、酶联免疫吸附试验(elisa)

生后22天，采集视网膜组织，重悬于1:20重量/体积的组织蛋白提取试剂(thermoscientific)中，并在冷冻组织匀浆器中破碎。所得裂解物在15，000转速下离心5分钟。收集上清液并转移到含有蛋白酶抑制剂的试管中。使用bca蛋白质测定法测定每种裂解物的蛋白质浓度。使用商业酶联免疫吸附系统(invitrogen，ma)从各自的培养基样品中定量检测vegf-a,hif-α和plgf的释放。样品和标准品一式两份，每组包含9个独立样品。用微板分光光度计在450纳米波长下分析该板(thermo)。rop视网膜血管增殖可能与vegf,hif-α和plgf水平相关，本实验在于测定丙磺舒预先干预，或者后干预以及对照组的vegf,hif-α和plgf水平，从而探讨其与早产儿视网膜病变rop发病关系。实验结果见图2。

5、石蜡切片和苏木精-伊红(he)染色

获取oir模型动物的眼球，在4％多聚甲醛中固定过夜，然后脱水并包埋在石蜡中，并平行于视神经连续切片5um厚度。切片在二甲苯中脱蜡，再水合并用苏木精-伊红(he))染料染色。这些切片是用立式显微镜(日本东京奥林巴斯bx53)拍摄的。本实验在于观察丙磺舒干预组和对照组普通显微镜底下视网膜血管的数量，从而证实早产儿视网膜病变rop建模成功，以及丙磺舒对血管增殖的抑制作用，实验结果见图3。

6、视网膜平片制备和同工凝集素荧光染色

麻醉后，摘除眼球，在4％全氟辛烷磺酸中固定2h。完整地解剖和分离视网膜，并在4％全氟辛烷磺酸中再固定10分钟。每个视网膜被均匀地切成4块，形成一个以视乳头为中心的“四叶草”形状。将组织浸泡在0.3％tritonx-100中20分钟，用10％胎牛血清封闭。加入2μm的异链菌素gs-ib4(invitrogen)，视网膜在4℃孵育过夜。视网膜在pbs中漂洗3次并盖片。血管闭塞和荧光渗漏的相对面积用与cellsensstandard1.9软件相连的共聚焦激光荧光显微镜(德国卡尔·蔡司)进行量化。本实验目的在于将磺舒干预组和对照组oir小鼠视网膜平铺，用荧光标记，荧光显微镜底下直观观察血管的形态和渗出，证实丙磺舒的功效，实验结果见图4。

7、视网膜新生血管的定量评估

对视网膜矢状切面进行苏木精-伊红染色，计算延伸至玻璃体的血管腔。

检查每只眼的10个非连续切片，每隔20um，并比较每组视网膜前的血管腔的平均数量。在同工凝集素染色的视网膜平板上，视网膜的总面积是根据轮廓的最外侧血管作为边界来描绘的。首先用手描绘丛状区域，然后在图像j(美国国家卫生研究所，md)中基于高强度的同工凝集素染色通过调整阈值来测量。该定量评估是基于图3，计算不同组别的视网膜血管数目，比较两组视网膜血管数目，证实丙磺舒对血管增殖的抑制作用。

8、中枢血管闭塞的定量评估

中央血管闭塞的面积是用图像j(美国国家卫生研究院，md)描绘和测量的。将该面积和总视网膜用计算机计算，并计算中央血管闭塞面积占总视网膜面积的百分比。中央血管闭塞是rop特点之一，该定量评估是基于图4，计算不同组别的中央血管闭塞数目，证实丙磺舒对血管增殖的抑制作用。

9、蛋白质印迹法

首先对肝组织进行物理匀浆，并在m-per哺乳动物蛋白提取试剂(thermofisher，ma，)中溶解，在4℃下以22000g速度离心30分钟。上清液用于铁调素(hamp)或β-肌动蛋白检测。以牛血清白蛋白为标准，根据布拉德福德法测定蛋白质浓度。来自所有相关实验的蛋白质样品在十二烷基硫酸锂样品加载缓冲液(biorad，ca)中处理，在95℃下加热5分钟，加载到10％三甘氨酸无污渍凝胶(bio-rad)上，通过sds-page解析，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。使用了针对不同hamp(1:1000稀释度，(thermofisher,ma)的特异性抗体。信号通过基于辣根过氧化物酶的化学发光检测(thermofisher，ma)，暴露于ecl化学传感器(bio-rad)，并使用图像实验室软件(bio-rad)数字化。

1、统计学方法

使用graphpadprism6(grapgpadsoftware,sandiego,ca)进行统计分析。两组之间用t检验进行比较。数据通过means±sem表示，并使用student’sttest方法分析。p<0.05的数值被认为是有统计学意义。

通过以上方法，得出了以下附图的结果，首次证明丙磺舒是一种抗oir视网膜血管生成的保护性化合物。cmap可用于小分子化合物药物的筛选。

二、实验结果部分

图1：在人视网膜内皮细胞中进行四甲基偶氮唑盐试验，以分析细胞活力。(a)常氧；(b)150um诱导缺氧；(c)在暴露于氯化钴(150ng/ml)前用丙磺舒处理60分钟；

结果表明，丙磺舒能抑制氯化钴诱导的视网膜血管内皮细胞增殖。

图2：说明：elisa法测定vegf和hif-1α水平，(a)常氧；(b)氧诱导的视网膜病变；(c)丙磺舒预处理；(d)丙磺舒后处理。结果表明丙磺舒预处理可以减少高氧诱导vegf和hif-1α水平。

图3：a常氧组b高氧组c高氧+丙磺舒组d不同组别血管计数，箭头处表示视网膜内新生血管。图3和图4的实验条件相同，都是用的oir动物。

图4：a常氧组(21％氧气浓度):视网膜血管呈放射状排列，以视盘为中心，象限均匀对称分布。血管自然运行，没有任何紊乱或扭曲。

b(oir(高氧诱导视网膜损伤组))组以及c(高氧+dh2o(高氧+蒸馏水))组：在边缘区，血管的大分支变得细而弯曲。扭曲的小分支血管扭曲成团。整个视网膜有广泛的新生血管形成，局部血管扩张和荧光素浸润；

d高氧+丙磺舒组(溶解蒸馏水的丙磺舒片(syncoltd,hongkong)，剂量1mg/kg.d,从生后1天-7天腹腔注射)：丙磺舒部分改善了高氧诱导的视网膜血管病理变化。

总结：眼底((a)常氧组视网膜血管呈放射状排列，以视盘为中心，象限均匀对称分布。血管自然运行，没有任何紊乱或扭曲。(b，c)oir和dh2o处理的对照导致后极的血管闭塞区域。在边缘区，血管的大分支变得细而弯曲。扭曲的小分支血管扭曲成团。整个视网膜有广泛的新生血管形成，局部血管扩张和荧光素浸润。(d)丙磺舒部分缓解了这些病变。

丙磺舒作为一种治疗痛风老药，其治疗痛风的机理是促进尿酸排泄，通过对近端肾小管对尿酸盐的重吸收的抑制，增加尿酸的排出，从而降低尿酸的浓度，减少尿酸盐的沉积。

而本发明应用丙磺舒1mg/kg.d，连续使用7天通过抑制高氧诱导vegf和hif-1α在ii期视网膜病变中过度产生，抑制视网膜内皮细胞增殖和血管生成，治疗早产儿视网膜病变rop。本研究从体内外研究均明确验证了丙磺舒能用于治疗早产儿视网膜病变rop疾病，创新性的发现丙磺舒的新用途。

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。